膀胱癌早期诊断模型及建立方法

技术领域

本发明涉及医学诊断技术领域，特别涉及膀胱癌早期诊断模型及建立方法。

背景技术

膀胱癌是一个男性恶性肿瘤高发性的疾病，位列男性恶性肿瘤发病率第五。膀胱癌预后和膀胱癌的分期分级存在紧密联系，因此早期发现膀胱癌是疾病的控制或提高患者生存周期的一个关键变量。不同于前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤疾病，膀胱癌并没有常规疾病筛查的工具，主要临床上发现膀胱癌的主要手段来自两种：1、患者出现症状，譬如：肉眼血尿等，前往医院就诊；2、每年常规体检，B超或CT发现膀胱肿瘤。但影像学检查对大体积肿瘤的诊断功能好，而对小体积的膀胱癌难以识别。同时，患者出现反复肉眼血尿再来就诊时，该类患者往往已经错失了膀胱癌的早期诊疗时机。因此，为膀胱癌患者开展灵敏有效的早期筛查工具，有非常大的现实意义和临床价值；

基于上述膀胱癌的临床挑战，液体活检方案是一个全新、颇有机会的诊断工具，液体活检技术相比传统活检技术，它的检测样本来自患者体内的各类液体，譬如：血液、尿液、胸腹水等。它的活检原理：恶性肿瘤组织存在持续增殖、广泛扩散的特征，因此癌细胞、癌微组织可从原先的肿瘤实体脱落，进入人体内的血液、尿液，进而达到在人体内广泛传播的特性。液体活检技术，通过采集癌症患者体内液体并找到癌细胞这个方式，来实现对癌症的确诊、癌症的分期分级、对治疗效果的预测等功能；

不同于癌症组织，癌症患者体液循环内的癌细胞密度是非常低。因此，如何高效率得捕获癌细胞是一个巨大的技术难题。目前主流的液体活检技术包括：循环肿瘤细胞测定(CTC)、甲基化测定、外泌体技术。其中，甲基化测定是一项非常适合膀胱癌早期诊断的液体活检技术。癌症细胞和正常细胞在DNA维度上存在显著不同，其中癌症细胞非常容易发生DNA甲基化水平的突变。同时，随着脱落癌症实体的癌细胞进入各类液体，科研工作者发现：通过检测液体内的DNA甲基化水平，可高效率区别癌症人群和正常。

目前市面上的基于尿液样本甲基化多靶点试剂盒在临床使用时，存在对于早期膀胱癌诊断阳性诊出率较低的缺点，这也反应了膀胱癌早期诊断困难性，也说明了有必要进一步改善膀胱癌检测方法，为此，我们提出膀胱癌早期诊断模型及建立方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供膀胱癌早期诊断模型及建立方法，通过采用Q-PCR检测技术，显示尿液中DNA甲基化水平，测定8个分子的甲基化水平，再构建模型，得到一个数值，根据数值大小，来判断患者得膀胱癌的风险，数值越大，膀胱癌的可能性越高，本发明对于膀胱癌的诊出率较高，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

膀胱癌早期诊断模型及建立方法，该诊断模型的建立方法步骤如下：

(1)整合样本数据：整合现有的膀胱癌甲基化多样本数据，包括：TCGA-BLCAdatasets(组织)、GSE120288(尿液)、GSE13507(组织)、GSE11933(组织)以及三项临床研究数据，结合现有的机器学习模型，确认了由8个基因甲基化模型(GHSR、MAL、ONECUT2、VIM、BCL2、CDKN2A、NID2、TWIST1)存在较高的诊断效能；

(2)收集新鲜尿液：对50例膀胱癌患者以及50例正常患者进行中段尿液100ml尿液样本的采集；

(3)低温保存送至测定室：采集尿液半小时内，将样本送入低温冰箱(-80℃)保存并送往测定室；

(4)离心获取DNA组织：将尿液解冻放入离心仪器中，在离心条件下获取尿液中DNA组织；

(5)使用DNA分离试剂获取DNA：对DNA组织使用DNA分离试剂，从而获取样本DNA；

(6)使用重硫酸盐甲基化DNA：对DNA使用重亚硫酸盐进行甲基化处理；

(7)采用PCR检测特定甲基化表达水平：采用重亚硫酸盐转化后未甲基化的C转变为U，随后用两对引物进行PCR，一对引物是甲基化特异性的引物，可以结合甲基化的DNA，另一对可以特异性结合未甲基化的DNA，如果DNA一开始被甲基化了，那么利用甲基化特异性的引物可以扩增出来；

(8)模型汇总：对8个甲基化位点结果，按照以下模型汇总为检测值，(检测值＝-0.0830758117844118*GHSR+0.130258147045189*MAL+0.03898003854039*ONECUT2+0.112554241992335*VIM-0.108794413916681*BCL2-0.227804059801386*CDKN2A-0.3376369047501*NID2-0.0893013017517621*TWIST1)；

(9)检测值分析：基于前期50例膀胱癌对比50例正常人群的尿液检测结果，50例膀胱癌数据均大于1.2，总体范围为1.2～3.6，正常人群的尿液结果，均低于0.6.总体范围是-0.4～0.6；根据检测值来判断膀胱癌的风险，得出结论为：检测值总数小于0.6，得膀胱癌的风险低，检测值总数大于1.2，得膀胱癌的风险高。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用Q-PCR检测技术，显示尿液中DNA甲基化水平，测定8个分子的甲基化水平，再构建模型，得到一个数值，根据数值大小，来判断患者得膀胱癌的风险，数值越大，膀胱癌的可能性越高；由于膀胱癌细胞是直接和尿液接触的，脱落的癌细胞最容易进入尿液内，本发明检测膀胱癌的样本为尿液样本，这对膀胱癌患者来说是无创的，有效降低膀胱癌患者的检测抵抗性；目前基于膀胱癌的尿液甲基化数据日间丰富，在各类机器学习算法的协助下，本发明的甲基化检测方案可以实现更好的诊断效能。

附图说明

图1为本发明膀胱癌早期诊断模型及建立方法的检测流程图。

图2为本发明膀胱癌早期诊断模型及建立方法的建模公式图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

如图1-2所示，膀胱癌早期诊断模型及建立方法，该诊断模型的建立方法步骤如下：

(1)整合样本数据：整合现有的膀胱癌甲基化多样本数据，包括：TCGA-BLCAdatasets(组织)、GSE120288(尿液)、GSE13507(组织)、GSE11933(组织)以及三项临床研究数据，结合现有的机器学习模型，确认了由8个基因甲基化模型(GHSR、MAL、ONECUT2、VIM、BCL2、CDKN2A、NID2、TWIST1)存在较高的诊断效能；

(2)收集新鲜尿液：对50例膀胱癌患者以及50例正常患者进行中段尿液100ml尿液样本的采集；

(3)低温保存送至测定室：采集尿液半小时内，将样本送入低温冰箱(-80℃)保存并送往测定室；

(4)离心获取DNA组织：将尿液解冻放入离心仪器中，在离心条件下获取尿液中DNA组织；

(5)使用DNA分离试剂获取DNA：对DNA组织使用DNA分离试剂，从而获取样本DNA；

(6)使用重硫酸盐甲基化DNA：对DNA使用重亚硫酸盐进行甲基化处理；

(7)采用PCR检测特定甲基化表达水平：采用重亚硫酸盐转化后未甲基化的C转变为U，随后用两对引物进行PCR，一对引物是甲基化特异性的引物，可以结合甲基化的DNA，另一对可以特异性结合未甲基化的DNA，如果DNA一开始被甲基化了，那么利用甲基化特异性的引物可以扩增出来；

(8)模型汇总：对8个甲基化位点结果，按照以下模型汇总为检测值，(检测值＝-0.0830758117844118*GHSR+0.130258147045189*MAL+0.03898003854039*ONECUT2+0.112554241992335*VIM-0.108794413916681*BCL2-0.227804059801386*CDKN2A-0.3376369047501*NID2-0.0893013017517621*TWIST1)；

(9)检测值分析：基于前期50例膀胱癌对比50例正常人群的尿液检测结果，50例膀胱癌数据均大于1.2，总体范围为1.2～3.6，正常人群的尿液结果，均低于0.6.总体范围是-0.4～0.6；根据检测值来判断膀胱癌的风险，得出结论为：检测值总数小于0.6，得膀胱癌的风险低，检测值总数大于1.2，得膀胱癌的风险高。

需要说明的是，本发明为膀胱癌早期诊断模型及建立方法，本发明采用Q-PCR检测技术，显示尿液中DNA甲基化水平，测定8个分子的甲基化水平，再构建模型，得到一个数值，根据数值大小，来判断患者得膀胱癌的风险，数值越大，膀胱癌的可能性越高。

并且Dahmcke团队通过检测尿液内多个甲基化位点(TERT，FGFR3，SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES，VIM)来评估膀胱癌的早期诊断结局，研究结果提示：上述检测方案在119例患者中有88例结果为阳性，其中57例患者处于膀胱癌早期，诊断敏感性和特异性均较为满意，该案例可以表明本发明膀胱癌早期诊断模型的建立可行性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。