ALKBH5作为代谢性疾病的标志物及治疗靶点

技术领域

本发明涉及一种预防或治疗代谢性疾病(包括2型糖尿病、高血脂和代谢性脂肪肝和肝癌等)的方法，所述方法包括抑制肝脏ALKBH5。本发明还涉及预防和治疗代谢性疾病的药物。

背景技术

代谢性疾病包括肥胖、高血糖(2型糖尿病)、葡萄糖耐量异常、高血脂和代谢性脂肪肝等，代谢性脂肪肝促进肝癌的发生。代谢性疾病是威胁人类健康的重大疾病之一。我国成年人群代谢性疾病发病率已超过50％，还在持续增加，代谢性疾病的防治已成为我国的重大战略需求。

目前使用最多降糖药是二甲双胍，但二甲双胍不能降血脂和缓解非酒精性脂肪肝；GLP-1激动剂利拉鲁肽等药物可以促进胰岛素分泌和抑制食欲，进而控制血糖和体重，用于2型糖尿病和肥胖患者的血糖和体重管理；降脂药多为他汀和PCSK抑制剂，但是他汀和PCSK抑制剂不能降血糖和缓解非酒精性脂肪肝；目前还没有治疗代谢性脂肪肝的有效药物，更没有同时降血糖、降血脂和治疗代谢性脂肪肝和肝癌的药物。因此，需要建立新的策略研发新药避免或缓解代谢性疾病发生发展，治疗代谢性疾病。

寻找可以同时应用于高血糖、高脂血症、代谢性脂肪肝和肝癌的药物靶点是解决这一问题的关键，即寻找代谢性疾病发生的关键驱动分子。

人ALKBH5是一种2-氧戊二酸(2OG)和亚铁依赖性核酸加氧酶(NAOX)，是m6A RNA修饰的去甲基化酶，全长具有394个氨基酸，含有用于Fe(II)结合的活性位点基序HXDXnH(包括残基His204、Asp206和His266)、用于2OG结合和底物识别的RXXnR，以及一个额外的环(βIV–V)，该环被认为具有单链RNA选择性(Xu,Chao et al.J Biol Chem.2014；289(25):17299-17311)。ALKBH5的保守DSBH核心折叠由八条反平行的β-链βI–VIII(β6–13)组成，它们形成两个β-片：主β-片(链β6、8、11和13)和副β-片(链β7、9、10和12)。另外三条β-链，β1、β2和β3，延伸主β-片基。DSBH两侧有三个螺旋α1、α2和α3。DSBH充当三个Fe(II)连接残基His204、Asp206和His266的支架，它们构成了高度保守的HXDXnH基序配位金属离子；2OG结合位点位于由两个DSBH的β-片包围的空腔中，该空腔的更开放端允许底物和活性位点之间的相互作用；m

发明内容

本发明人经过深入研究，从不同饮食习惯引起代谢状态变化入手寻找代谢性疾病发生的关键驱动分子，找到RNA结合蛋白ALKBH5是代谢性疾病的关键驱动分子。利用肝脏特异基因敲除或GalNac偶联修饰siRNA抑制肝脏ALKBH5建立了一个新型的预防或治疗代谢性疾病的方法。本发明人建立了预防或治疗代谢性疾病的方法——抑制肝脏ALKBH5。

具体地，本发明人发现ALKBH5在代谢性疾病小鼠和人肝脏中异常高表达，小鼠肝脏特异敲除Alkbh5可以抵抗代谢性疾病发病，包括降血糖、降血脂、缓解代谢性脂肪肝和肝癌。这些数据提示肝脏ALKBH5是代谢性疾病的关键驱动分子，抑制肝脏ALKBH5可以避免或缓解代谢性疾病发生。我们设计了GalNac(N-乙酰半乳糖胺)偶联修饰siRNA，靶向db/db小鼠肝脏ALKBH5，发现db/db小鼠2型糖尿病、高血脂和代谢性脂肪肝得到极大缓解。

因此，根据本发明的一个方面，提供了检测ALKBH5表达水平的试剂(单独)在制备代谢性疾病的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。

在一个实施方案中，所述试剂为ALKBH5基因的特异性探针、基因芯片、PCR引物或用于检测ALKBH5蛋白的抗体或Western Blotting试剂。

在一个实施方案中，所述代谢性疾病选自肥胖、高血糖(2型糖尿病)、葡萄糖耐量异常、高血脂、代谢性脂肪肝、肝癌(肝实质细胞癌)或它们的组合，优选所述组合为高血糖(2型糖尿病)、高血脂和代谢性脂肪肝的组合，和/或所述试剂检测受试者的肝脏的ALKBH5表达水平。

根据本发明的另一个方面，提供了降低或抑制ALKBH5表达的试剂(作为唯一的活性成分或者与其他治疗代谢性疾病的活性药物联合)在制备预防或治疗代谢性疾病的药物中的应用。

在一个实施方案中，降低或抑制ALKBH5表达的试剂选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、RNA适体、TALEN、CRISPR、锌指核酸酶、小分子化合物、ALKBH5特异性抗体、和(肝脏)ALKBH5敲除或敲减试剂。

在一个实施方案中，所述代谢性疾病选自肥胖、高血糖(2型糖尿病)、葡萄糖耐量异常、高血脂、代谢性脂肪肝、肝癌(肝实质细胞癌)或它们的组合，优选所述组合为高血糖(2型糖尿病)、高血脂和代谢性脂肪肝的组合。

在一个实施方案中，所述试剂降低或抑制受试者的肝脏的ALKBH5表达水平。

在一个实施方案中，所述试剂为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联的修饰siRNA，优选为GalNAc-siAlkbh5，其正义链和反义链(5’→3’)分别是c-c-acccAgCUAugcuucagauL(SEQID NO:1)和a-U-cugAagCauagCuGggugg-u-a(SEQ ID NO:2)，其中大写字母表示2-脱氧-2-氟(2-F)修饰，小写字母表示2-O-甲基(2-OMe)修饰，-表示PS(phosphorothiaote，硫代磷酸酯)连接，L表示GalNAc连接。

在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人。

根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选预防或治疗代谢性疾病的药物的方法，所述方法包括下述步骤：

1)确定过表达ALKBH5的细胞中ALKBH5的表达水平；

2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触；

3)确定在步骤2)后细胞中ALKBH5的表达水平；和

4)比较步骤1)和步骤3)中确定的ALKBH5的表达水平，其中ALKBH5的表达水平降低指示所述候选化合物具有预防或治疗代谢性疾病的潜力，

优选所述细胞为肝脏细胞，更优选来自患有代谢性疾病的受试者的肝脏细胞，还更优选所述代谢性疾病选自肥胖、高血糖(2型糖尿病)、葡萄糖耐量异常、高血脂、代谢性脂肪肝和肝癌(肝实质细胞癌)，优选所述组合为高血糖(2型糖尿病)、高血脂和代谢性脂肪肝的组合，更优选所述受试者是哺乳动物，最优选人。

根据本发明的另一个方面，提供了评价药剂在治疗和/或预防代谢性疾病中的效果的方法，其中所述方法包括测试所述药剂是否能够降低来自代谢性疾病受试者的肝脏细胞样品中ALKBH5的表达，如果能够降低，则说明所述药剂适合于治疗和/或预防该代谢性疾病。在一个优选实施方案中，所述代谢性疾病选自肥胖、高血糖(2型糖尿病)、葡萄糖耐量异常、高血脂、代谢性脂肪肝和肝癌(肝实质细胞癌)，优选所述组合为高血糖(2型糖尿病)、高血脂和代谢性脂肪肝的组合，更优选所述受试者是哺乳动物，最优选人。

本发明具有以下优势：1)靶向单一分子ALKBH5可以预防或治疗代谢性疾病，即同时降血糖、降血脂和缓解代谢性脂肪肝；2)递送途径(GalNac偶联修饰siRNA)已在临床上使用，具有安全性、持久性和可靠性；3)抑制肝脏ALKBH5具有安全性。

本发明提供了一种新型的预防或治疗代谢性疾病的方法，与现有的降糖降脂药物相比，抑制肝脏ALKBH5具有同时降糖、降脂、缓解代谢性脂肪肝、递送途径安全持久有效、靶点本身具有安全性等优点，可用于代谢性疾病的预防或治疗。

附图说明

图1.ALKBH5在HFD诱导的肥胖小鼠的肝脏中异常高表达；

图2.ALKBH5在db/db小鼠肝脏中异常高表达；

图3.ALKBH5在人类糖尿病患者的肝脏中异常高表达；

图4.ALKBH5-HKO小鼠成功构建；

图5.与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠血糖偏低，并且抵抗HFD诱导的高血糖；

图6.与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠显著提高了葡萄糖耐量水平；

图7.与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠由乳酸诱导的葡萄糖生成显著减少；

图8.与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠胰高血糖素敏感性显著降低；

图9.ALKBH5-HKO降低了胰高血糖素信号通路；

图10.进一步说明ALKBH5-HKO降低了胰高血糖素信号通路，胰高血糖素信号通路降低是ALKBH5-HKO小鼠血糖降低并能够抵抗HFD诱导高血糖的原因；

图11.与对照小鼠相比，正常饲养和HFD饲养的ALKBH5-HKO小鼠血清TG水平均显著降低；

图12.与对照小鼠相比，在正常饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清总胆固醇水平并无显著变化，在HFD饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清总胆固醇水平显著降低；

图13.与对照小鼠相比，在正常饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇水平并无显著变化，在HFD饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低；

图14.在正常饲养情况下ALKBH5-HKO小鼠血清ALT与对照小鼠相比没有显著差异，但在HFD饲养的条件下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠血清ALT水平显著降低；

图15.ALKBH5-HKO小鼠能够抵抗HFD诱导的脂肪肝；

图16.ALKBH5-HKO小鼠能够抵抗HFD诱导的肝脏脂质积累；

图17.DEN诱导的肝癌模型中，与ALKBH5

图18.DEN诱导的ALKBH5

图19.与DEN诱导的ALKBH5

图20.与DEN诱导的ALKBH5

图21.与DEN诱导的ALKBH5

图22.与DEN诱导的ALKBH5

图23.ALKBH5-HKO小鼠通过降低EGFR及其磷酸化形式降低了mTORC1活性，促进肝脏自噬，减少脂滴积累、降低脂质合成；

图24.ALKBH5-HKO降低了EGFR/PI3K/mTORC1信号通路；

图25.GalNAc-siAlkbh5可以显著敲低db/db BKS小鼠肝脏ALKBH5；

图26.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠禁食血糖显著降低；

图27.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠葡萄糖耐量显著改善；

图28.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠由乳酸诱导的葡萄糖生成显著减少；

图29.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5db/db BKS小鼠胰高血糖素敏感性显著降低；

图30.GCGR信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降血糖的重要原因；

图31.GCGR/cAMP信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降血糖的重要原因；

图32.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清甘油三酯含量显著降低；

图33.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清总胆固醇含量显著降低；

图34.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低；

图35.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清ALT水平均显著降低；

图36.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏TG显著降低；

图37.与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏脂滴显著减少；

图38.EGFR/AKT/mTORC1信号通路降低、脂质合成减弱以及自噬增加是GalNAc-siAlkbh5降低脂肪肝和血脂的重要原因；

图39.EGFR/PI3K/mTORC1信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降低脂肪肝和血脂的重要原因。

具体实施方式

除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。对于本领域的定义和术语，特别推荐技术人员参考Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor出版社，Plainsview，New York(1989)；以及Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley&Sons，New York(1999)。

术语“ALKBH5(Alkylation repair homolog protein 5)”是指一种2-氧戊二酸(2OG)和亚铁依赖性核酸加氧酶(NAOX)，是m6A RNA修饰的去甲基化酶。

关于ALKBH5的表达，意指其三个水平上的表达：一为DNA水平上的表达；二为RNA水平上的表达；三为蛋白水平上的表达。

术语“过表达”是指当基因表达(转录)的严格控制被打乱时，基因可能不恰当被“关闭”，或以高速度进行转录。高速转录导致大量mRNA产生。对于本发明的ALKBH5的过表达而言，是指其DNA、RNA或蛋白表达水平比对照(正常或健康组织/细胞)至少高30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或300％，或者甚至是对照中ALKBH5的表达水平的4、5、6、7、8、9、10倍或以上。

用于检测基因表达水平的技术和试剂是本领域技术人员公知的。在本发明中，优选该试剂选自ALKBH5基因的特异性探针(优选核酸探针，带有检测标记，通常与目的基因互补)、基因芯片或用于PCR特异性扩增反应的PCR引物。

用于检测蛋白表达水平的技术和试剂是本领域技术人员公知的。在本发明中，优选该试剂选自用于检测ALKBH5蛋白的抗体或Western Blotting试剂。

术语“降低或抑制ALKBH5表达”是指将ALKBH5的DNA、RNA或蛋白的表达水平降低至原来的表达水平的80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下或10％以下，例如5％以下、2％以下、1％以下或甚至0％。在一个实施方案中，通过基因敲除或敲减可以降低或抑制ALKBH5的表达。

术语“敲除(knockout)”是指一种遗传工程技术，其中利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状。

术语“敲减(knockdown)”是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。其利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。它不同于基因敲除使目标基因永久性的表达沉默，而是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。

基因敲除或敲减的技术是本领域公知的，包括但不限于，逆转录病毒基因转移，造成突变，例如点突变、插入、删除、移码、或错义突变。可以将基因敲除的另一方式是，使用锌指核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。可以对锌指结构域进行改造以靶向目的DNA序列，这可使锌指核酸酶靶向复杂基因组中的独特序列。其它可用来敲除基因的基因组定制技术有TAL效应物核酸酶(TALENs)。另一种技术是基因组编辑技术CRISPR/Cas系统，其可以被用来实现RNA引导的基因组改造。

实现“降低或抑制ALKBH5表达”的技术还可以包括使用gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、RNA适体或ALKBH5特异性抗体。

“反义RNA”是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。可以例如作为表达质粒来递送反义构建体，其中当所述表达质粒在细胞中表达时，产生与细胞(优选肝脏细胞)ALKBH5的至少一个独特部分互补的RNA。

反义RNA策略的另一特殊形式是gapmer。Gapmer是嵌合的反义寡核苷酸，其包含长度足以诱导RNase H切割的脱氧核苷酸单体的中心区段(central block)。Gapmer的设计和合成是本领域技术人员公知的并且可以由商业公司(例如，Exiqon，Isispharmaceuticals)完成。

“小干扰RNA(siRNA)”，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度约为20-25个碱基对，其通过RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。本发明的siRNA可以靶向ALKBH5基因靶序列中约19至25个连续核苷酸的任何区段，在本申请中提供了其实例。用于选择siRNA的靶序列的技术在本领域公知的。GalNAc偶联的修饰siRNA已广泛应用于临床，并被证明是一种安全有效的抑制肝脏靶点的方法。优选地，本发明使用GalNac(N-乙酰半乳糖胺)偶联修饰siRNA。

“短发夹RNA”(short hairpin RNA，缩写shRNA)是包括两个短反向重复序列的RNA序列，可以经由RNA干扰(RNAi)使基因表现沉默化。

“esiRNA”的英文全名是Endoribonuclease-prepared siRNAs，是通过大肠杆菌的RNase III(一种核糖核酸酶)切割长双链RNA(dsRNA)而生成的siRNA混合物，长度在18-25bp之间，可以用于高效敲除靶标基因的表达水平。

本发明是基于以下出人意料的发现：即ALKBH5可以用作代谢性疾病的标志物及治疗靶点。因此，本发明提供了检测ALKBH5表达水平的试剂在制备代谢性疾病的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了降低或抑制ALKBH5表达的试剂在制备治疗代谢性疾病的药物中的应用。另外，本发明还提供了一种筛选治疗代谢性疾病的药物的方法，所述方法包括确定候选化合物是否能够降低或抑制肝脏细胞中ALKBH5表达的步骤。

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此而限制本发明的范围。以下反应中所用的化学物质都是可商购的产品，除非另外指明。

在本发明中使用未配对的学生t检验作为统计分析。使用Microsoft Excel进行统计学计算。当P<0.05时，P值显著。

实施例1：ALKBH5在HFD诱导肥胖小鼠肝脏中的表达。

正常饲料(大小鼠维持饲料MD17121，江苏美迪森)饲养8周后更换HFD高脂饲料(PD6001，常州鼠一鼠二生物科技有限公司)饲养8周的雄性小鼠12只(C57BL/6J，北京维通利华实验动物技术有限公司，42.33±5.355g)和正常饲料饲养16周的雄性小鼠8只(C57BL/6J，北京维通利华实验动物技术有限公司，32.125±2.775g)，饥饿20小时，处死，收集肝脏，Western Blot检测ALKBH5表达。

[材料与方法]：

HFD饲养8周雄性小鼠和正常饲料饲养相同周龄小鼠。

Western Blot详细方法如下：

1)前期准备

蛋白胶制备：按照所需浓度配制分离胶，加入1ml 20％乙醇液封，室温静置至凝固，倒掉乙醇，擦干，倒入浓缩胶，按照实验所需插入梳子。

电泳液制备：200ml 5X Tris/Gly，800ml dH

转膜液制备：200ml 5X Tris/Gly，200ml甲醇，600ml dH

封闭液制备：5g脱脂奶粉加入95ml PBST中，混匀，4℃保存，备用。

蛋白样品制备：取肝脏组织加入10倍体积的RIPA Buffer，研磨，冰上裂解30min，每10min votex 1次，4℃12000rmp/min离心10min，将上清转移至新的EP管中，加入LoadingBuffer，100℃煮样5min。

2)电泳

分别将marker和样品缓慢匀速加入上样孔，100V恒压电泳，电泳时间根据目标蛋白分子量决定。

3)转膜

按照黑面-海绵垫-滤纸-蛋白胶-NC膜-滤纸-海绵垫-白面的顺序夹紧转膜夹，每层之间注意排空气泡，恒压100V转膜，转膜时间根据目标蛋白分子量决定。

4)封闭

将NC膜浸泡在封闭液中，水平摇床10rpm/min室温封闭1小时。

5)一抗

倒掉封闭液，用PBST洗净封闭液，使用抗体稀释液(含3％BSA的PBST溶液)稀释一抗(抗ALKBH5，Proteintech，1：5000)，加入一抗，水平摇床10rpm/min 4℃孵育过夜，回收，PBST洗膜3次，每次10min。

6)二抗

使用封闭液稀释二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，中杉金桥，1:5000稀释)，水平摇床10rpm/min室温二抗1h，PBST洗膜3次，每次10min。

7)显色

向NC膜上均匀滴加显影液，使用化学发光成像仪进行显影。

[结果见图1]

[结果]：与正常饲料喂养的小鼠相比，ALKBH5在HFD诱导的肥胖小鼠的肝脏中异常高表达。

实施例2：ALKBH5在db/db小鼠肝脏中的表达。

8周龄db/db(糖尿病)雄鼠和8周龄对照野生型雄鼠各10只。购买自常州卡文斯实验动物有限公司，饥饿20小时，处死，收集肝脏，Western Blot检测ALKBH5表达。

[材料与方法]：

db/db小鼠和对照野生型小鼠肝脏。

Western Blot方法详见实施例1。

[结果见图2]：

[结果]：与野生型小鼠相比，ALKBH5在db/db小鼠肝脏中异常高表达。

实施例3：ALKBH5在人类糖尿病肝脏中的表达。

人类肝癌并糖尿病患者和对照肝癌患者的肝脏组织各7组，均来自哈尔滨医科大学，Western Blot检测ALKBH5表达。

[材料与方法]：

Western Blot方法详见实施例1。

[结果见图3]：

[结果]：ALKBH5在人类糖尿病患者的肝脏中异常高表达。

实施例4：ALKBH5-HKO小鼠构建。

[材料与方法]：

ALKBH5

具体杂交策略为：ALKBH5

基因鉴定方式如下：

ALKBH5-HKO小鼠(基因型为：ALKBH5

ALKBH5

ALKBH5

ALKBH5小鼠基因鉴定引物为：

ALKBH5-F：ACCTGGAGTCCCATAAGATTCATCC(SEQ ID NO:4)

ALKBH5-R：TTCAGGTCAGTTGGGATTACCAGG(SEQ ID NO:5)

Alb-cre小鼠基因鉴定引物为：

Cre-F:GCATAACCAGTGAAACAGCATTGCTG(SEQ ID NO:6)

Cre-R:GGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCG(SEQ ID NO:7)

基因鉴定结果如图4,B所示：ALKBH5

通过Western Blot对ALKBH5-HKO小鼠进行验证，Western Blot方法详见实施例1(以下同)，结果如图4，C所示。

[结果见图4]：

[结果]：ALKBH5-HKO小鼠成功构建。

实施例5：ALKBH5-HKO对小鼠血糖的影响。

正常饲料(大小鼠维持饲料MD17121，江苏美迪森)饲养实施例4中获得的ALKBH5-HKO雄鼠和对照ALKBH5

正常饲料(大小鼠维持饲料MD17121，江苏美迪森)饲养实施例4中获得的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

[结果见图5]：

[结果]：与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠血糖偏低，并且抵抗HFD诱导的高血糖。

实施例6：ALKBH5-HKO对小鼠葡萄糖耐量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO雄鼠7只和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

葡萄糖(G116302，aladdin)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

葡萄糖耐量实验详细方法如下：

1)0点血糖检测

小鼠饥饿6小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

2)耐量实验

用生理盐水配置0.1g/ml葡萄糖溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为1g/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。

[结果见图6]：

[结果]：在正常饮食和高脂饮食的情况下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠显著提高了葡萄糖耐量水平。

实施例7：ALKBH5-HKO对小鼠乳酸耐量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO雄鼠7只和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

乳酸钠(71718，sigma)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

乳酸耐量实验详细方法如下：

1)0点血糖检测

小鼠饥饿6小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

3)耐量实验

用生理盐水配置0.1g/ml乳酸钠溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为1g/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。

[结果见图7]：

[结果]：在正常饮食和高脂饮食的情况下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠由乳酸诱导的葡萄糖生成显著减少。

实施例8：ALKBH5-HKO对小鼠胰高血糖素耐量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO雄鼠7只和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

胰高血糖素(GP21258，GLPBIO)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

胰高血糖素耐量实验详细方法如下：

1)0点血糖检测

小鼠饥饿6小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

4)耐量实验

用生理盐水配置1μg/ml胰高血糖素溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为10μg/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。

[结果见图8]：

[结果]：在正常饮食和高脂饮食的情况下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠胰高血糖素敏感性显著降低。

实施例9：ALKBH5-HKO对小鼠GCGR/PKA/CREB信号通路的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO雄鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

Western Blot检测胰高血糖素受体(Glucagon Receptor，GCGR)的表达(GCGR，Proteintech，26784-1-AP)、PKA底物磷酸化水平(Phospho-(Ser/Thr)PKA Substrate，CST，9621)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB，Proteintech，12208-1-AP)及其磷酸化形式p-CREB(Phospho-CREB(Ser133)，CST，9198)的表达，方法详见实施例1。

[结果见图9]：

[结果]：在正常饲养和HFD饲养的ALKBH5-HKO小鼠中，肝脏GCGR、p-PKA Sub和p-CREB水平均显著降低。说明ALKBH5-HKO降低了胰高血糖素信号通路。

实施例10：ALKBH5-HKO对小鼠cAMP的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO雄鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

cAMP ELISA试剂盒(581001，Cayman)检测方法如下：试剂盒恢复至室温

1)准备缓冲液

ELISA Buffer：将1瓶10mL的ELISA Buffer(10X)加入至90mL ddH

Wash Buffer：取2.5mL的Wash Buffer加入至997mL ddH

cAMP AchE Tracer：取cAMP AchE Tracer，加入30mL ELISA Buffer，并加入300μL示踪剂，4℃保存，备用。

cAMP ELISA Antiserum：取cAMP ELISA Antiserum，加入30mL ELISA Buffer，并加入300μL示踪剂，4℃保存，备用。

Ellman’s Reagent：取1管Ellman’s Reagent溶于50mL ddH

2)样品准备

取20mg肝脏样品，加入200μL 0.1M HCl，研磨，冰上裂解10min，加入400μL ELISABuffer，votex，4℃1000g离心10min，将上清液转移至新的EP管，置于冰盒，备用。

3)检测

取所需数量酶标板，设置Blk、TA、NSB、B0、Standard、Sample孔。按照如下体积依次加入：

Blk：空白

TA：空白

NSB：100μL ELISA Buffer，50μL Tracer

B0：50μL ELISA Buffer，50μL Tracer，50μL Antiserum

Standard：50μL Standard，50μL Tracer，50μL Antiserum

Sample：50μL Sample，50μL Tracer，50μL Antiserum

覆盖封板膜，4℃湿盒孵育18h。

甩干孔板样品，并在干净纸巾上拍干。

每孔加入200μL Wash Buffer，轻柔震荡，甩干液体并在纸巾上拍干，重复5次。

向每孔中加入200μL Ellman’Reagent，同时向TA孔中加入5μL Tracer。

覆盖封板膜，避光，水平摇床10rpm/min显色，随时读取405/420nm吸光值，当B0吸光值在0.3-1范围内即可，若大于1.5则应重新清洗显色。

以标准品绘制标准曲线，带入样品值，并以BCA法测定样品蛋白浓度，比值即为cAMP含量。

[结果见图10]：

[结果]：在正常饲养和HFD饲养的ALKBH5-HKO小鼠中，肝脏cAMP含量显著降低。进一步说明ALKBH5-HKO降低了胰高血糖素信号通路，胰高血糖素信号通路降低是ALKBH5-HKO小鼠血糖降低并能够抵抗HFD诱导高血糖的原因。

实施例11：ALKBH5-HKO对小鼠血清甘油三酯含量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

甘油三脂(TG)测试盒(F001-1-1，南京建成)，严格按照试剂盒说明书所列方法进行检测。

从-80℃冰箱取出血清，于冰上融化，votex混匀，瞬离，置于冰盒，备用。

TG测定：分别向96孔板中加入2.5μL dH

计算方法：标准品、测定血清吸光值-dH2O吸光值，记为△

[结果见图11]：

[结果]：与对照小鼠相比，正常饲养和HFD饲养的ALKBH5-HKO小鼠血清TG水平均显著降低。

实施例12：ALKBH5-HKO对小鼠血清总胆固醇含量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

总胆固醇(T-CHO)测试盒(A111-1-1，南京建成)，严格按照试剂盒说明书所列方法进行检测。

T-CHO测定：分别向96孔板中加入2.5μL dH

计算方法：标准品、测定血清吸光值-dH2O吸光值，记为△

[结果见图12]：

[结果]：与对照小鼠相比，在正常饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清总胆固醇水平并无显著变化，在HFD饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清总胆固醇水平显著降低。

实施例13：ALKBH5-HKO对小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(A113-1-1，南京建成)，严格按照试剂盒说明书所列方法进行检测。

LDL-C测定：分别向96孔板中加入2.5μL dH

计算方法：△A＝A2-A1，标准品、测定血清吸光值-dH2O吸光值，记为△A

[结果见图13]：

[结果]：与对照小鼠相比，在正常饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇水平并无显著变化，在HFD饲养条件下，ALKBH5-HKO小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低。

实施例14：ALKBH5-HKO对小鼠血清ALT的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

GPT(ALT)试剂盒(C009-2-1，南京建成)。

从-80℃冰箱取出血清，于冰上融化，votex混匀，瞬离，置于冰盒，备用。试剂盒恢复至室温，基质液37℃预热。

对照孔：向96孔板中加入10μL基质液。

实验孔：向96孔板中加入10μL基质液后加入2.5μL血清，吸打混匀。

37℃孵育30min。

分别向对照孔和实验孔中加入10μL苯肼溶液，轻轻震荡混匀，向对照孔中加入2.5μL与实验孔相对应的血清，吸打混匀。

37℃孵育20min。

分别向对照孔和实验孔中加入100μL 0.4M NaOH，轻轻震荡混匀，室温静置15min，读取510nm吸光值。

计算方法：△

[结果见图14]：

[结果]：在正常饲养情况下ALKBH5-HKO小鼠血清ALT与对照小鼠相比没有显著差异，但在HFD饲养的条件下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠血清ALT水平显著降低。

实施例15：ALKBH5-HKO对小鼠肝脏TG的影响。

按照实施例5中的饲养方法饲养ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

肝脏TG(甘油三酯)检测详细方法如下：

1)TG分离

取60mg肝脏组织，加入1.5mL 1％醋酸，匀浆。

转移200μL匀浆至新EP管，并加入800μL氯仿/甲醇(2:1)混合液。

Votex 4-6次，每次30s，室温静置5min，10000g室温离心10min。

转移EP管下层有机溶液至新的EP管，置于通风橱，干燥过夜。

2)脂类分解

向干燥的EP管中加入200μL 3M KOH重悬，70℃孵育1小时。

冷却至室温，加入600μL的1M MgCl

3)TG检测

向甘油试剂(F6428，Sigma)中加入40mL ddH

向96孔板中分别加入8μL ddH

以标准品540nm吸光值为X轴，甘油浓度为Y轴制作标曲，将待测样品540nm吸光值带入标曲得甘油浓度。

4)计算

计算公式为：(0.07687*甘油浓度)/肝重，即得肝脏TG水平(mg/g)。

[结果见图15]：

[结果]：在正常饲养情况下，ALKBH5-HKO小鼠肝脏TG与对照小鼠相比没有显著差异，但在HFD饲养的条件下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠肝脏TG水平显著降低。这说明ALKBH5-HKO小鼠能够抵抗HFD诱导的脂肪肝。

实施例16：ALKBH5-HKO对小鼠肝脏脂质积累的影响。

正常饲料饲养实施例4中获得的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

HFD饲料饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

研究级倒置荧光显微镜成像仪(IX71+DP74，Olympus)拍照。

[结果见图16]：

[结果]：在HFD饲养的条件下，与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠肝脏脂滴大小显著降低。这说明ALKBH5-HKO小鼠能够抵抗HFD诱导的肝脏脂质积累。

实施例17：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌的影响。

在实施例4中获得的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

二乙基亚硝胺(Sigma，55-1-8-5)

ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

电子分析天平(ESJ-B，龙腾电子)

[结果见图17]：

[结果]：DEN诱导的肝癌模型中，与ALKBH5

实施例18：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌形态的影响。

按照实施例17中的方法获得DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[材料与方法]：

DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[结果见图18]：

[结果]：DEN诱导的ALKBH5

实施例19：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌肿瘤数量的影响。

按照实施例17中的方法获得DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[材料与方法]：

DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[结果见图19]：

[结果]：与DEN诱导的ALKBH5

实施例20：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌肿瘤大小的影响。

按照实施例17中的方法获得DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[材料与方法]：

DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[结果见图20]：

[结果]：与DEN诱导的ALKBH5

实施例21：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导小鼠肝癌肝实质细胞增殖的影响。

按照实施例17中的方法获得DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[材料与方法]：

DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

研究级倒置荧光显微镜成像仪(IX71+DP74，Olympus)拍照。

Ki-67免疫荧光染色方法如下：

1)固定

将切好的玻片从-80℃冰箱取出，晾干，使用4％多聚甲醛溶液固定30分钟，PBS缓冲液清洗，进行透化。

2)透化

将固定后的玻片浸入透化液(含0.5％ Triton-X100和0.05％ SDS的PBS缓冲液)中，室温透化30分钟，PBS缓冲液清洗，进行封闭。

3)封闭

用免疫组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加10μL封闭液(含5％山羊血清、1％BSA的PBS缓冲液)，置于湿盒中，室温封闭2小时，PBS缓冲液清洗，进行一抗。

4)一抗

用封闭液按照一定比例稀释Ki-67(1:200，CST，D385)，在圈内滴加10μL配好的一抗，置于湿盒中，4℃孵育过夜，PBS缓冲液洗3次，每次5分钟。

5)二抗

用封闭液按照一定比例稀释荧光二抗(1:200，FITC：ABclonal，AS011，DAPI：Solarbio，C0060)，避光在圈内滴加10μL混合好的二抗，置于湿盒中，室温孵育1小时，PBS缓冲液洗3次，每次5分钟，进行封片。

6)封片

洗好的玻片甩干，滴加抗荧光淬灭剂(BOSTER，AR1109)，盖上盖玻片，指甲油涂抹四周，晾干，倒置荧光显微镜拍照。

[结果见图21]：

[结果]：与DEN诱导的ALKBH5

实施例22：ALKBH5-HKO对二乙基亚硝胺(DEN)诱导小鼠肝癌肝脏TG的影响。

按照实施例17中的方法获得DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

[材料与方法]：

DEN诱导的ALKBH5-HKO和对照ALKBH5

肝脏TG检测方法详见实施例12

[结果见图22]：

[结果]：与DEN诱导的ALKBH5

实施例23：ALKBH5-HKO对小鼠肝脏

EGFR/PI3K/AKT/mTOR/S6k/ULK1/LC3/FASN/SCD1信号通路的影响。

正常饲料饲养实施例4中获得的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

Western Blot方法详见实施例1。

抗体详细信息如下所示：

EGF Receptor(CST，4267)及其磷酸化形式Phospho-EGF Receptor(Y1068)(CST，3777)、PI3 Kinase p55(CST，11889)及其磷酸化形式Phospho-PI3 Kinase P85(Thr458)/p55(Tyr199)(CST，4228)、AKT(CST，4691)及其磷酸化形式Phospho-Akt(S473)(CST，3787)和Phospho-Akt(T308)(CST，4056)、mTOR(CST，mT2949)及其磷酸化形式Phospho-mTOR(Ser2448)(Sigma，SAB4504476)、S6K(Proteintech，14485-1-AP)及其磷酸化形式Phospho-p70 S6 Kinase(Thr389)(CST，9234)ULK1(Proteintech，20986-1-AP)及其磷酸化形式Phospho-ULK1(Ser757)(CST，14202)、LC3(Proteintech，14600-1-AP)、FASN(Proteintech，10624-2-AP)、SCD1(ABclonal，A16429)。

[结果见图23]：

[结果]：ALKBH5-HKO小鼠肝脏p-EGFR、EGFR、p-PI3K-p55、pAKT(S473)、pAKT(T308)、p-mTOR、p-S6K、p-ULK1水平显著降低，LC3II/LC3I显著增加、FASN、SCD1显著降低。ALKBH5-HKO小鼠通过降低EGFR及其磷酸化形式降低了mTORC1活性，促进肝脏自噬，减少脂滴积累、降低脂质合成。

实施例24：ALKBH5-HKO对PI3K激酶活性的影响。

正常饲料饲养实施例4中获得的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

[材料与方法]：

正常饲养的ALKBH5-HKO小鼠和对照ALKBH5

PI3K激酶活性ELISA(Echelon Biosciences，K-1000s)检测方法如下：

1)缓冲液准备：

KBZ Reaction Buffer：将1瓶4mL的5x KBZ Reaction Buffer加入到15.76mLdH

PI(4,5)P2 Substrare：向一管PI(4,5)P2 Substrare中加入230μL dH

Kinase Stop Solution：按照所需向KBZ Reaction Buffer中加入EDTA，终浓度为4mM，备用。

Standard Curve Buffer：反应当天向KBZ Reaction Buffer中加入PI(4,5)P2Substrare和EDTA，终浓度分别为2μM、2.4mM。

PI(3,4,5)P3 Standard:反应当天向一管PI(3,4,5)P3 Standard中加入250μLdH

PI(3,4,5)P3 Detector：反应当天按照1:800的比例，使用Detection Buffer按照所需稀释PI(3,4,5)P3 Detector。

TBS-T Buffer：将1瓶20mL的10x TBS-T Buffer加入到180mL dH

Secondary Detector：反应当天按照1:800的比例，使用TBS-T Buffer按照所需稀释Secondary Detector，备用。

2)样品制备：

取20mg肝脏组织，加入200uL Lysis Buffer，研磨，冰上裂解20min，4℃10000g离心10min，转移上清至新的EP管，BSA法测定蛋白浓度，取20μg蛋白至新的EP管，加入KBZReaction Buffer至30μl，置于冰上备用。

3)Kinase reaction：

向2)中样品加入30μl 10μM PI(4,5)P2 Substrare，并于37℃反应2h。向反应后溶液中加入90μl Kinase Stop Solution，混匀，备用。

4)ELISA：

取90μl 3.6μM PI(3,4,5)P3 Standard溶液，并加入210μl Standard CurveBuffer，混匀，并以此为基准，依次稀释三倍，即得360nm、120nm、40nm、13.3nm、4.4nm标准品溶液，备用。

转移60μl 3)中反应后样品、标准品，并向其中加入60ul PI(3,4,5)P3 Detector，室温孵育60min。

转移100μl反应后溶液至ELISA检测板，室温孵育60min。

弃溶液，甩干残余液体，向每孔中加入200μl TBS-T溶液，重复3次。

向每孔中加入100μl Secondary Detector，室温反应30min。

弃溶液，甩干残余液体，向每孔中加入200μl TBS-T溶液，重复3次。

向每孔中加入100μl TMB solution，室温避光反应30min，若反应较弱可适当延长时间。

向每孔中加入50μl Stop solution，立即读取450nm吸光值。

5)计算：

通过标准品吸光值计算标曲，将样品吸光值带入即为PI3-激酶活性。

[结果见图24]：

[结果]：与对照小鼠相比，ALKBH5-HKO小鼠肝脏PI3K激酶活性显著降低。PI3K直接影响mTORC1的活性，这一结果说明ALKBH5-HKO降低了EGFR/PI3K/mTORC1信号通路。

实施例25：GalNAc-siAlkbh5靶向db/db BKS小鼠肝脏Alkbh5。

[材料与方法]：

GalNAc偶联的修饰siRNA已广泛应用于临床，并被证明是一种安全有效的抑制肝脏靶点的方法。GalNAc偶联的siRNA能够通过与肝实质细胞特异表达的ASGPR相互作用促进肝实质细胞摄取，实现肝实质细胞特异性递送。另外siRNA不同位置做不同修饰可以稳定siRNA，显著提升沉默的持久性，详见已发表文献(Brown,Christopher R etal.NucleicAcids Res.2020；48(21):11827-11844.)。我们设计了针对Alkbh5的siRNA，在不同位置做不同修饰，并偶联N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc-siAlkbh5正义链和反义链分别是c-c-acccAgCUAugcuucagauL(SEQ ID NO:1)和

a-U-cugAagCauagCuGggugg-u-a(SEQ ID NO:2)；对照GalNAc-siCon的正义链和反义链分别是u-u-cuccGaACGagucacguuuL(SEQ ID NO:8)和a-C-gugAcuCguucGgGgaa-u-u(SEQ ID NO:9)。大写字母表示2-deoxy-2-fluoro(2-F)修饰，小写字母表示2-O-methyl(2-OMe)修饰，-表示PS连接，L表示GalNAc连接。

db/db BKS小鼠具有肥胖、2型糖尿病、高脂血症和代谢性脂肪肝等代谢性疾病。为了确定肝脏ALKBH5是否可以作为代谢性疾病的药物靶点，我们在db/db BKS代谢性疾病模型中做了siRNA的靶向研究。我们对8周龄的db/db BKS小鼠尾静脉注射了GalNAc-siAlkbh5RNA(1mg/kg体重)，以敲低肝脏中Alkbh5的表达，表示为GalNAc-siAlkbh5小鼠，对照db/dbBKS小鼠注射GalNAc-siCon RNA(1mg/kg体重)，表示为GalNAc-siCon小鼠，注射2周后通过Western Blot检测GalNAc-siAlkbh5小鼠肝脏ALKBH5敲低情况，Western Blot方法详见实施例1。

[结果见图25]：

[结果]：GalNAc-siAlkbh5可以显著敲低db/db BKS小鼠肝脏ALKBH5。

实施例26：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠血糖的影响。

按照实施例25制备GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/dbBKS小鼠，于注射1周后饥饿14小时(晚18:00-早8:00)，测血糖。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)

[结果见图26]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5db/db BKS小鼠禁食血糖显著降低。

实施例27：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠葡萄糖耐量的影响。

按照实施例25制备GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/dbBKS小鼠，于注射1周后饥饿15小时(晚17:00-早8:00)，进行葡萄糖耐量实验。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

葡萄糖(G116302，aladdin)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

葡萄糖耐量实验详细方法如下：

1)0点血糖检测

小鼠饥饿15小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

5)耐量实验

用生理盐水配置0.05g/ml葡萄糖溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为0.5g/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。[结果见图27]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5db/db BKS小鼠葡萄糖耐量显著改善。

实施例28：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠乳酸耐量的影响。

按照实施例25制备GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/dbBKS小鼠，于注射1周后饥饿15小时(晚17:00-早8:00)，进行乳酸耐量实验。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

乳酸钠(71718，sigma)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

1)0点血糖检测

小鼠饥饿15小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

6)耐量实验

用生理盐水配置0.05g/ml乳酸钠溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为0.5g/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。

[结果见图28]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5db/db BKS小鼠由乳酸诱导的葡萄糖生成显著减少。

实施例29：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠胰高血糖素耐量的影响。

按照实施例25制备GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/dbBKS小鼠，于注射1周后饥饿6小时(早8:00-14:00)，进行胰高血糖素耐量实验。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)。

胰高血糖素(GP21258，GLPBIO)、氯化钠注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司)和无菌注射器(1mL，江苏治宇医疗器材有限公司)。

胰高血糖素耐量实验详细方法如下：

1)0点血糖检测

小鼠饥饿6小时后，轻剪小鼠尾尖，轻轻挤出一滴饱满血液，用血糖仪检测，记录血糖和体重。

7)耐量实验

用生理盐水配置0.6μg/ml胰高血糖素溶液，按照小鼠体重注射，注射剂量为6μg/kg(如20g小鼠注射200μL)，分别测量注射后15min、30min、60min、120min血糖，并记录。[结果见图29]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5db/db BKS小鼠胰高血糖素敏感性显著降低。

实施例30：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠GCGR/PKA/CREB信号通路的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，WesternBlot检测GCGR/PKA/CREB信号通路的变化情况。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

Western Blot检测GCGR、p-PKA Sub、p-CREB、CREB的表达，方法详见实施例1。

[结果见图30]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏GCGR、p-PKA Sub和p-CREB水平均显著降低。这说明GCGR信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降血糖的重要原因。

实施例31：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠cAMP的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，cAMP ELISA试剂盒检测。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

cAMP ELISA试剂盒检测方法详见实施例10。

[结果见图31]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏cAMP含量显著降低。这说明GCGR/cAMP信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降血糖的重要原因。

实施例32：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠血清甘油三酯含量的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，取血，4000rpm/min 4℃离心10min，转移上清，即血清，-80℃冻存，备用。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

甘油三脂(TG)测试盒(F001-1-1，南京建成)，检测方法详见实施例11。

[结果见图32]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清甘油三酯含量显著降低。

实施例33：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠血清总胆固醇含量的影响。

按照实施例29中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，取血清，备用。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

总胆固醇(T-CHO)测试盒(A111-1-1，南京建成)，检测方法详见实施例12。

[结果见图33]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清总胆固醇含量显著降低。

实施例34：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量的影响。

按照实施例29中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，取血清，备用。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(A113-1-1，南京建成)，检测方法详见实施例13。

[结果见图34]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低。

实施例35：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠血清ALT的影响。

按照实施例29中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，取血清，备用。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

GPT试剂盒(C009-2-1，南京建成)，检测方法详见实施例14。

[结果见图35]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠血清ALT水平均显著降低。

实施例36：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠肝脏TG的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，检测肝脏TG的变化情况。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

甘油试剂(F6428，Sigma)，肝脏TG检测方法详见实施例15。

[结果见图36]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏TG显著降低。

实施例37：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠肝脏脂滴积累的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，4％多聚甲醛溶液固定4h，HE染色，拍照。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

研究级倒置荧光显微镜成像仪(IX71+DP74，Olympus)拍照。

[结果见图37]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏脂滴显著减少。

实施例38：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠肝脏

EGFR/PI3K/AKT/mTOR/S6k/ULK1/LC3/FASN/SCD1信号通路的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，Western Blot检测EGFR/PI3K/AKT/mTOR/S6k/ULK1/LC3/FASN/SCD1信号通路相关蛋白表达情况。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

Western Blot方法详见实施例1。

[结果见图38]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠相比，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏p-EGFR、EGFR、p-PI3K-p55、pAKT(S473)、pAKT(T308)、p-mTOR、p-S6K、p-ULK1水平显著降低，LC3II/LC3I显著增加，FASN、SCD1显著降低。这说明EGFR/AKT/mTORC1信号通路降低、脂质合成减弱以及自噬增加是GalNAc-siAlkbh5降低脂肪肝和血脂的重要原因。

实施例39：GalNAc-siAlkbh5对db/db BKS小鼠PI3K激酶活性的影响。

按照实施例25中的方法获得GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCondb/db BKS小鼠，饥饿20小时，处死，收集肝脏，PI3K激酶活性ELISA试剂盒检测肝脏PI3K激酶活性。

[材料与方法]：

正常饲养的GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS及其对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠。

PI3K激酶活性ELISA检测方法详见实施例22。

[结果见图39]：

[结果]：与对照GalNAc-siCon db/db BKS小鼠，GalNAc-siAlkbh5 db/db BKS小鼠肝脏PI3K激酶活性显著降低。这说明EGFR/PI3K/mTORC1信号通路降低是GalNAc-siAlkbh5降低脂肪肝和血脂的重要原因。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。