一种提取7-脱氢胆固醇的方法

技术领域

本发明属于有机物提取技术领域，具体涉及一种提取7-脱氢胆固醇的方法。

背景技术

7-脱氢胆固醇（7-DHC）在常温常压下为白色或灰白色结晶状粉末，是一种动物甾醇，其在血清中为胆固醇前体。7-脱氢胆固醇是合成维生素D

目前以微生物发酵法进行7-脱氢胆固醇生产的研究已日益增长，如江南大学专利CN112813129A、CN114606147A、CN114703077A等报道均集中于酿酒酵母发酵生产7-脱氢胆固醇的菌种筛选、分子改造等方面，对于发酵液中7-脱氢胆固醇的提取纯化技术并未展开研究。此外授权公开号为CN115594727A的中国发明专利公开了一种提取发酵液中7-脱氢胆固醇的方法，但该方法条件较为苛刻，且步骤繁琐。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提取7-脱氢胆固醇的方法，提高7-脱氢胆固醇的收率和纯度。

本发明的内容为一种提取7-脱氢胆固醇的方法，步骤为，将含有7-脱氢胆固醇的菌体和强碱溶液混合，加热搅拌使菌体破碎，然后静置分层，收集上层的破碎菌体；将破碎菌体和乙醇溶液混合提取，过滤，得到提取液；将提取液在40~60℃下进行减压浓缩，得到浓缩物；将浓缩物和甲醇混合，降温析晶，得到7-脱氢胆固醇；所述浓缩物和甲醇的重量体积比为1g:0.1~3mL（优选为1g:0.1~2mL）。

优选的，所述菌体为酿酒酵母发酵液的菌体。

优选的，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液，摩尔浓度为7~12mol/L。

优选的，含有7-脱氢胆固醇的菌体和强碱溶液混合时，还加入有乙醇溶液（体积浓度为95%），乙醇溶液和强碱溶液的体积比为1:3。

优选的，所述菌体与强碱溶液和乙醇溶液的混合液（混合液为强碱溶液和乙醇溶液的混合液）的重量体积比为1g:2~5mL。

优选的，加热搅拌时的温度为80~90℃。

优选的，加热搅拌在水浴条件下进行，加热时间为2~3h。

优选的，所述破碎菌体和乙醇的重量体积比为1g:8~12mL。

优选的，所述减压浓缩的温度为50℃，真空度为-0.098Mpa。

优选的，所述浓缩物和甲醇的重量体积比为1g:0.1~2mL，更优选为1g:1mL。

本发明的有益效果是，脱氢胆固醇是胞内脂溶性化合物，存在于酵母细胞中。发酵结束，进行固液分离收集菌体细胞，收集得到细胞，使用碱液破壁，将胞内产物释放出来。静置后破碎液会分层，产物、酵母细胞中的酯类、菌体细胞碎片混合在一起，密度较小，在上层；密度较高的氢氧化钠溶液及胞内胞质混合物在下层。

分层得到的上层加入乙醇，产物溶于乙醇的同时，蛋白质、细胞碎片等堵塞滤纸的成分因为乙醇的加入，出现絮凝，易于过滤分离。

过滤后，产物富集在滤液层，经减压浓缩干乙醇，冷却至常温，产物以油状物的形式析出。加入甲醇，因为溶解度的差异，析出得到7-DHC粗品。

7-脱氢胆固醇这类胞内脂溶性产物的提取，存在含量低、细胞难破碎、脂溶性提取溶剂难选择的问题。本发明采用强碱性溶液在高温下（80-90℃）对菌体细胞进行破壁，相对于其他破壁方式，比如研磨、超声波等方式，脱氢胆固醇和菌体物质的分离更加彻底，有利于提高提纯的收率和纯度。破壁后如何提取产物是一个难点。如果使用有机溶剂萃取分层，能够分层并除去分液上层溶剂、产物又不被破坏的，只有诸如石油醚等一类的易挥发、易燃易爆的有机溶剂。若是使用其它可以与水混溶的溶剂提取，因为有水存在，减弱了其提取效果，一则溶剂使用体积大，二则过滤速度慢、过滤非常困难。本发明在酿酒酵母破壁后，利用破壁后细胞内碎片及富含产物的脂溶性物质密度小，浮于破碎液上方的特点，先进行分层，将富集目标产物的上层混合液收集（下层水溶液丢弃），再向分层得到的上层液中加入一定量的乙醇提取，乙醇使用体积大大减小，同时提取液因为乙醇的加入，其中一些附着力较强、堵塞膜孔的物质絮凝，整体过滤速度会大大加快。本申请的破碎菌体和乙醇混合，在50℃左右进行减压浓缩，相对于甲醇或者其他溶剂比如正己烷，发明人发现该方法能够更有效的进行提取分离，并更安全。本发明最后将浓缩物和少量甲醇混合，相对于较多量的甲醇或者乙醇等溶剂，析晶得到的产物的收率和纯度更高。

附图说明

图1为本发明实施例1的提取流程示意图。

具体实施方式

实施例1

一种提取7-脱氢胆固醇的方法，提取过程所用物料明细如表1所示。

表1物料配比

包括如下步骤，

1、收集菌体

采用离心法收集酿酒酵母（

2、菌体破碎

将湿菌体按1g：3ml的料液比加入7.5mol/L（30％）的NaOH和乙醇（体积浓度为95%），V

3、萃取

分层后弃下层碱液，收集上层破碎菌体，按1g：10ml的料液比加入95%体积浓度乙醇，混合均匀后得到混悬液，将混悬液进行过滤，收集过滤清液，得到目的物脱氢胆固醇提取液。

4、浓缩析晶

将收集所得的提取液升温至50℃，-0.098Mpa进行减压浓缩，待乙醇水溶液浓缩完全，按料液比1g：1ml加入少量甲醇缓慢降温析晶。

对比例1

对比例1和实施例1相比，区别在于：菌体破碎步骤中，采用离心机在5000rpm条件下转动10min，然后混合液倒入分液漏斗中，静置30min等待分层。其他步骤和实施例1步骤相同。

对比例2

对比例2和实施例1相比，区别在于：萃取步骤中，按1g：10ml的料液比加入正己烷。其他和实施例1步骤相同。

对比例3

对比例3和实施例1相比，区别在于：萃取步骤中，按1g：10ml的料液比加入甲醇。其他和实施例1步骤相同。

对比例4

对比例4和实施例1相比，区别在于：浓缩析晶步骤中，按料液比1g：1ml加入少量乙醇缓慢降温析晶。其他和实施例1步骤相同。

对比例5

对比例5和实施例1相比，区别在于：浓缩析晶步骤中，按料液比1g：5ml加入少量甲醇缓慢降温析晶。其他和实施例1步骤相同。

检测上述实施例1和对比例1-5的提取纯度和含量，得到如表2所示的提取纯度和含量表。

表2 提取纯度和含量表

粗品克重*外标含量表示目标产物的实际量。对比例1因为碱液破碎后，加入离心步骤，部分产物进入下层废液，因此收率略偏低；对比例2因为使用正己烷，萃取得到更多的杂甾醇，因此收率高，但含量低。对比例3用甲醇萃取，7-DHC在甲醇中溶解度偏低，因此收率偏低，纯度和含量偏低。对比例4在乙醇中析晶，乙醇对7-DHC溶解度大，因此收率偏低。对比例5中析晶甲醇量多，收率偏低，纯度，含量更高。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。