GHR106单株抗体做为GnRH拮抗物之应用

相关申请的交叉引用

本申请基于两件美国临时专利申请案主张优先权及其利益，一个是2021年5月18日提交的第63/189852号，另一个是2021年9月10日提交的第63/242976号。前述两件申请案的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

为哺乳动物生殖障碍的治疗提供实施方案；为哺乳动物生殖激素的调整提供实施方案。

背景技术

GnRH(促性腺激素释放激素)是一种十肽激素，它与位于人垂体前叶的GnRH受体反应，控制黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的释放或分泌。这两种生殖激素对包括人类在内的所有动物生殖系统的性分化和成熟都是必不可少的。

GHR-106是一种单株抗体，源于抗人促性腺激素释放激素受体胞外区N1-29寡肽。图1A显示了位于几个物种(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6)的GnRH受体胞外区的N1-29寡肽。比较发现，人的氨基酸序列与兔、猴、猫和狗之间有高度的同源性(约90-95％之间)，而与小鼠的序列同源性较小。

图1B示出IgG4人源化GHR-106单株抗体的重链和轻链(分别为SEQ ID NO：7和SEQID NO：8)的氨基酸序列，并通过下划线重链(SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：11)和轻链(SEQ IDNO：12至SEQ ID NO：14)的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3来进一步识别这些序列。

图中人源化IgG4GHR-106的实例包含了抗体重链的S228P突变，正如SEQ ID NO：7所示(注意：根据EU编号系统，S228位于氨基酸SEQ ID NO：7中的位置250)。在不受理论约束的情况下，人们认为S228P突变或其他等价突变阻止了称为IgG4晶状体臂交换的抗体重组过程。Fab-arm交换会导致不想要的双特异性抗体的形成，这对抗体目标受体的特异性产生负面影响。参见Silvaetal.，JBC，2015，290(9)：5462-5469。

由于氨基酸序列的高度同源(>90-95％)，人源GHR-106与猴、兔、狗、猫GnRH的N1-29肽都有交叉反应，而与小鼠和大鼠GnRH的N1-29肽却无交叉反应。业已证明GHR-106及其人源化形式都能与癌细胞或垂体前叶中人的GnRH受体有特异性反应。

人类只有一种功能性GnRH受体基因。GnRH受体的主要作用部位位于垂体前叶，在脉动刺激下丘脑释放GnRH时，负责释放促性腺激素、黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。然而，在生殖相关组织或器官如卵巢、睾丸以及癌细胞中，GnRH受体可通过自分泌/旁分泌调节机制与GnRH或其肽类似物发生结合作用。

对GnRH的正常功能具有拮抗作用的GnRH类似物的药物已经用于治疗各种与性激素有关的状况或障碍，如生殖疾病(男性和女性均有)、不孕症、辅助生殖治疗(如体外受精(IVF)或卵子捐赠(如控制卵巢刺激)、包括抑制排卵在内的避孕措施、变性人的医学过渡或变性治疗(包括男变女和女变男)是否与变性手术结合、子宫内膜异位症、子宫内膜变薄、子宫腺肌病、子宫内膜增生、子宫肌瘤、经前综合症、前列腺增生症、卵巢疾病、多囊卵巢疾病、性早熟等。

由于天然激素的半衰期相对较短(2-4分钟)，所以合成十肽及其衍生物的目的就是将其循环半衰期增加到小时级。通过对十肽及衍生物结构的修饰，保留了他们刺激或抑制促性腺激素释放的生物学作用，并使半衰期得到数量级的提高。根据它们刺激或抑制促性腺激素释放的生物学作用机制，通常分别称为GnRH刺激素或GnRH拮抗剂。几十年前，cetrorelix就上市了。作为GnRH拮抗剂应用于生育调节药物或抗癌药物，与天然GnRH相比，Cetrorelix效力更高，半衰期更长(从分钟提高到小时)。其它合成GnRH拮抗剂的实例还有antide、cetrorelix、abarelix、degarelix、ganirelix和Elagolix等。

以前涉及GHR-106及其人源化形式的工作都着眼于治疗人类癌症和与生育相关疾病的潜在的临床应用(参见美国专利号8163283、9273138和公开号2020/035462，其中每一项通过引用并入本文)。本文引用的PCT(申请公开号WO2019/153075)公开了单株抗体GHR-106对人GnRH受体的作用，并且可能开发成长效GnRH拮抗剂。在其他方面，与西曲瑞克或其他已建立的肽类似物生物亦相似。这是由于抗体药物的半衰期通常比肽拮抗剂如已知的GnRH肽拮抗剂Cetrorelix或Antide的半衰期长得多，为5-21天。尽管分子大小不同(80kDa和1.5kDa)，但肽类似物和GHR-106抗体都显示出相似的结合亲和力(Kd1-4nM)和对人GnRH受体的特异性。GHR-106单株抗体的优点是半衰期长(5-21天)，而肽类GnRH拮抗剂如西曲瑞克或安替德的半衰期大多为1-10小时。

目前有许多GnRH肽类似物或衍生物可作为临床治疗癌症如前列腺癌和乳腺癌的药物。临床应用还包括许多与妇女健康、生育和疾病状况相关的适应症。例如，GnRH肽类似物被广泛用于体外受精(IVF)以控制程序性排卵和激素依赖性疾病，如子宫内膜异位症、子宫肌瘤和经前综合症或多囊卵巢综合症。

人们普遍希望得到长期有作用的组合物，其可用于治疗哺乳动物受试者的生殖障碍和调节生殖激素位准。

如前所述，相关技术的示例与限制旨在说明而非排他。通过阅读细节和研究附图，相关技术在本领域的其他限制将变得显而易见。

发明内容

以下实施例描述和说明了系统、工具和方法之间的关联。这只是举例说明，并不意味着范围的限制。在各种实施例中，有些上述问题已经得到解决，其它问题也将迎刃而解。

GHR-106单株抗体或其抗原结合片段可用于调节哺乳动物受试者的性相关激素的位准，也可导致受试者至少一种性相关激素的可逆抑制。这种可逆抑制发生在给受试者施用GHR-106单株抗体或其抗原结合片段后的3至21天期间，血清中至少一种性相关激素的位准下降。这种激素可以是睾酮、雌二醇、黄体生成素、孕酮、卵泡刺激素或其组合。GHR-106单株抗体或其抗原结合片段的施用量是1至3毫克每公斤体重。这个剂量用到人身上大约50毫克到300毫克每人。给药可以定期重复，例如在大约每1周到3周之间给一次药。

在某些方面，GHR-106单株抗体或其抗原结合片段可以具有重链和轻链，重链具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的CDRs，轻链具有SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的CDRs。

在某些方面，GHR-106抗体或其抗原结合片段可用于终止异位妊娠、控制排卵、男性或女性的生育控制，和/或治疗性激素相关状况或障碍。受试对象可以是任何哺乳动物，包括人、猴、狗、猫、兔，等等。这里还提供了体现上述用途的方法。

除了上面描述的示例和实施例之外，通过参考附图和阅读下面的详细描述，就能进一步了解实施例。

附图说明

在附图中示出了示例性实施例。意在将本文公开的实施例和图视为说明性的而不是限制性的。

图1A比较了人、兔、猴、猫、狗和小鼠GnRH受体胞外区N1-29寡肽的氨基酸序列。

图1B显示了GHR-106抗体的重链和轻链的氨基酸序列，并在互补决定区(CDRs)下划线。

图2显示了在405nm下ΔOD与GHR-106抗体浓度的双对数图，GHR-106单株抗体分别应用于来自人、狗和兔的三个分离的、包衣良好的GnRH受体N1-29合成寡肽。

图3显示了成年雄性兔在第1天皮下注射3毫克/千克GHR-106后，血清LH(mIU/ml)和睾酮(ng/ml)浓度随天数的变化。从第1天到第30天监测激素位准。

图4显示了成年雌性兔在第1天单次皮下注射3mg/kg GHR-106后，血清LH(MIU/ml)和雌二醇(E2，pg/ml)浓度随天数的变化。从第1天到第20天监测激素位准。

图5对OC-3-VGH卵巢癌细胞的基因表达位准进行定量RT-PCR检测，以揭示抗原(肽拮抗剂)和GHR-106对卵巢癌细胞基因调控的影响。

图6显示了10只雄性兔的血清睾酮位准，分为三个实验组。

图7显示了10只雄性兔的血清LH位准，分为三个实验组。

图8显示了10只雌性兔的血清雌二醇(E2)位准，分为3个实验组，从第1天维持到第17天。

图9显示了10只雌性兔在研究期间分为三个实验组的血清LH位准。

具体实施方式

在下面的描述中，阐述了具体细节，以便向本领域技术人员提供更透彻的理解。然而，可能没有详细示出或描述众所周知的元件，以避免不必要地模糊本公开。因此，描述和附图应被视为说明性的，而不是限制性的。

发明人现在已经进行了研究，包括在兔中的概念验证实验和本文公开的定量基因调控研究，以支持GHR-106在包括人类在内的几种动物物种中用于治疗生育问题和其他生殖障碍的广泛临床应用。本文所述的在兔身上进行的概念验证实验显示，在大约一两周的时间内，血清生殖激素(LH、睾酮或雌二醇)被可逆地抑制。这一新的数据证明了GHR-106在人类以及其他几种动物的治疗应用中的潜在适用性。

以前没有证明GHR-106也会以类似于十肽类GnRH拮抗剂的方式作用于垂体前叶的GnRH受体，后者已知抑制促性腺激素的释放。因此，本研究选取兔作为概念验证动物模型，论证GHR-106作用于垂体GnRH受体，抑制体内促性腺激素释放。因此，通过比较GHR-106对基因表达的影响和体内生殖激素位准调节的生物相似性，可以合理地假设GHR-106可以替代已知的GnRH肽拮抗剂，用于除人类癌症之外的许多妇科疾病或生殖障碍的治疗，但其半衰期较长有潜在的益处。

在一些实施方案中，提供GHR-106抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段被给予哺乳动物，包括人、猴、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、兔或其他家畜，以治疗生殖状况或障碍或性激素相关的健康问题。在一些实施方案中，将GHR-106抗体或其抗原结合片段给予哺乳动物，其中GnRH受体的N1-29末端氨基酸序列具有与GnRH受体的人N1-29末端氨基酸序列(SEQ ID NO：1)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，包括至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体，其被工程设计以最小化目标物种中抗体的交叉反应性的可能性。例如，本文公开的具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链的GHR-106IgG4构建体是人源化抗体构建体。在其他实施方案中，其中对像是不同的哺乳动物物种，可以使用含有来自受试者物种的IgG4Fc区的嵌合抗体，例如，用于狗的抗体的狗IgG4-Fc、用于猫的抗体的猫IgG4-Fc、用于兔的抗体的兔IgG4-Fc、用于猴的抗体的猴IgG4-Fc、用于马的抗体的马IgG4-Fc、用于牛的抗体的牛IgG4-Fc、用于羊的抗体的羊IgG4-Fc、用于山羊的抗体的羊IgG4-Fc，等等。

在一些实施方案中，GHR-106抗体作为GHR-106的一个或多个活性抗原结合片段提供，用于治疗性激素相关的健康状况或疾病。在一些实施例中，片段是GHR-106可变区的单链片段。在一些实施方案中，所述片段是IgG同种类型的GHR-106的片段，包括IgG4。在一些实施例中，片段是F(ab')2片段。在一些实施方案中，F(ab')2片段的分子量为110kDa。在一些实施例中，该片段是Fab片段。在一些实施方案中，Fab片段的分子量为55kDa。在一些实施例中，该片段是scFab片段。在一些实施方案中，scFab片段的分子量为25kDa。在一些实施例中，片段是scFv片段。在一些实施方案中，scFv片段的分子量为25kDa。在一些实施方案中，不同抗原结合片段的组合，例如以上所述的两个或多个片段，可用作治疗性激素相关状况或障碍的药物。

在一些实施方案中，用于治疗性激素相关健康状况或障碍的GHR-106抗体或其抗原结合片段不具有效应功能。不具有效应功能的抗体不能活化补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径。在一些实施方案中，不具有效应功能的GHR-106抗体或其抗原结合片段具有IgG4亚型。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段抑制补体活化。在一些实施方案中，具有IgG4亚型的抗体的重链具有S228P突变或等效突变，以防止Fab-arm交换。在一些实施方案中，不具有效应功能的GHR-106抗体或其抗原结合片段是GHR-106抗体的IgG抗原结合片段。在一些实施方案中，不具有效应功能的抗原结合片段是GHR-106抗体的F(ab')2、Fab、scFab或scFvIgG片段。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段来源于hGHR-106。

在一些实施方案中，选择GHR-106抗体的亚型来调节抗体的效应功能。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段被结构修饰以进一步调节抗体的效应功能，例如通过使用不具有任何效应功能的抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，GHR-106抗体的Fc区是IgG4亚型。在一些实施方案中，不具有任何效应功能的GHR-106抗体或其抗原结合片段用于治疗性激素相关的健康状况或障碍，用于可逆地抑制受试者中至少一种性激素的位准，用于控制受试者的排卵，和/或用于终止受试者的异位妊娠。在一些实施方案中，具有IgG4亚型的GHR-106抗体用于治疗性激素相关的健康状况或障碍。

不受理论约束，认为由于IgG4抗体亚型不活化补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，使用IgG4抗体亚型治疗性激素相关的健康状况或障碍或以其他方式调节受试者的性激素位准，包括治疗生育障碍，将最小化或消除与垂体前叶结合的GHR-106抗体发生CDC和ADCC反应的可能性。参见Vidarssonetal.,Front.Immunol.,2014,5：520。

此外，已经证明IgG4抗体实际上可以抑制补体活化(参见vanderZeeetal.，Clin.exp.Immunol.，1986，64(2)：415-422)。因此，在一些实施方案中，选择GHR-106单株抗体或其抗原结合片段来抑制补体活化。在一些实施方案中，抑制补体活化的GHR-106单株抗体或其抗原结合片段用于治疗性激素相关的状况或障碍。

在一些实施方案中，GHR-106抗体的循环半衰期约为3至21天，包括它们之间的任何值，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、17、18、19或20天，或72至500小时，包括它们之间的任何值，例如75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450或475小时。相比之下，西曲瑞克(cetrorelix)的循环半衰期约为10至63小时。与十肽GnRH拮抗剂西曲瑞克相比，GHR-106具有更长的半衰期，因此可能需要更少的频繁给药，这可能改善患者的依从性和/或拟议治疗方案的可行性。

在一些实施方案中，来自GHR-106的IgG抗原结合片段，例如F(ab')2、Fab、ScFab或ScFv，每一个循环半衰期约为12至20小时，包括它们之间的任何值，例如13、14、15、16、17、18或19小时。与mGHR-106或hGHR-106抗体相比，mGHR-106或hGHR-106的抗原结合片段具有更短的半衰期。在一些实施方案中，蛋白质工程用于提供半衰期在期望范围内的GHR-106抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段具有根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链和根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO：7具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链和与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链，分别包括例如与SEQ ID NO：7和8具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在进一步的实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段具有以下互补性决定区的重链：具有根据SEQ ID NO：9(RYSVH)的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ ID NO：10(MIWGGGSTDYNPSLKSR)的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQ ID NO：11(GYYSFA)的氨基酸序列的CDR3区。在进一步的实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段具有以下CDR的轻链：具有根据SEQ ID NO：12(KSSQSLLNSRTRKNYLA)的氨基酸序列的CDR1区、具有根据SEQ IDNO：13(WASTRES)的氨基酸序列的CDR2区和具有根据SEQ ID NO：14(KQSYNLYT)的氨基酸序列的CDR3区。

本文所述的GHR-106抗体或其抗原结合片段可以合适的方式配制以作为药物。因此，它们可以与药学上可接受的赋形剂或其他药学上合适的化合物组合，以提供可用于调节性激素位准和/或治疗性激素相关的健康状况或障碍的药物。

在一些实施方案中，提供了GHR-106抗体或其抗原结合片段治疗性荷尔蒙相关的健康状况或障碍的有效量和/或以调节哺乳动物(包括人、猴、狗、猫、兔、马、牛、绵羊、山羊或其他家畜)中一种或多种性相关荷尔蒙位准。哺乳动物可以是雄性也可以是雌性。在一些实施例中，与性激素相关的健康状况或障碍是生殖疾病(在男性或女性受试者中)，变性人的医学转变包括男性对女性(MTF)或女性对男性(FTM)变性治疗，无论是否伴随变性手术、体外受精(IVF)或卵子捐赠(例如控制卵巢刺激)、避孕措施，包括抑制女性受试者排卵或男性受试者精子产生、子宫内膜异位症、子宫内膜变薄、子宫腺肌病、子宫内膜增生、子宫肌瘤、经前综合症、良性前列腺肥大、卵巢疾病、多囊卵巢疾病、性早熟等。

在一些实施方案中，受试男性用GHR-106抗体或其抗原结合片段进行生育控制。在不受理论约束的情况下，本申请的示例中包含的数据支持向男性受试者施用GHR-106抗体或其抗原结合片段可以将性相关激素如睾酮的位准降低到可能干扰男性精子产生的位准，从而为男性受试者提供生育控制。

在一些实施方案中，给药GHR-106抗体或其抗原结合片段以终止异位妊娠。在不受理论约束的情况下，人们认为，给药GHR-106抗体或其抗原结合片段引起的生殖激素位准下降将对胎儿有害，及/或GnRH受体及GnRH在人类胎盘中高度表现，同时伴有人类绒毛膜促性腺激素分泌之量，导致异位妊娠迅速终止，同时将对受试者的负面影响降至最低。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段用于调节受试者的排卵。给予女性GHR-106抗体或其抗原结合片段用于生育控制(例如节育)。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段用于调节受试者中一种或多种性相关激素的位准，包括通过使一种或多种性相关激素的血清浓度可逆地降低。在一些实施方案中，性相关激素是睾酮、雌二醇、黄体化激素、孕酮、卵泡刺激素或其组合。在一些实施例中，性相关激素位准的改变改变了受试者的生育状态。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段在治疗可由包括antide或Cetrorelix在内的已知GnRH拮抗剂治疗的任何疾病中充当GnRH拮抗剂。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段用于治疗一种情况，在这种情况下，需要比已知的GnRH拮抗剂(包括antide或Cetrorelix)更长的半衰期。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段以0.5-10毫克/公斤的剂量位准给药，包括它们之间的任何值，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5毫克/公斤。在一些实施方案中包括例如约1-3毫克/公斤，包括它们之间的任何值或子值。在GHR-106抗体或其抗原结合片段的结合亲和力和/或特异性已被修饰的一些实施方案中，适当地修饰抗体或其抗原结合片段的剂量位准。

在受试者是人的一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段以约50毫克至约300毫克之间的剂量给药，包括两者之间的任何值，例如75、100、125、150、175、200、225、250或275毫克。

在一些实施方案中，GHR-106抗体或其抗原结合片段以重复间隔给予，例如每5-30天或其间的任何值，例如每6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29天；每隔1-8周或其间的任何价值，例如每隔2、3、4、5、6或7周，或每隔2-6个月或其间的任何价值，例如每隔3、4或5个月。在一些实施方案中，GHR-106抗体或其中的抗原结合片段以大约每1周至大约每3周之间的重复间隔给药。在一些实施方案中，给予人的GHR-106抗体或其抗原结合片段是人源化GHR-106抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，人源化GHR-106抗体是hGHR-106IgG4，其具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链。

含有抗体的药物组合物的典型给药途径是通过注射，通常是静脉注射或肌肉注射。然而，在各种实施例中可以使用任何合适的给药模式。

实例

参考以下示例进一步描述某些实施例，其意图是说明性的而不是限制性的。

在兔中进行概念验证实验，以证明单次注射抗GnRH受体的人源化单株抗体GHR-106(hIgG4)对血清生殖激素的可逆抑制，GHR-106(hIgG4)具有序列号7的氨基酸序列的重链和序列号8的氨基酸序列的轻链。

单次皮下注射1毫克/千克或3毫克/千克的抗体给雄性兔，在7-10天内，血清LH和睾酮浓度平行下降了正常位准的80-90％。生殖激素在最初注射后大约两周恢复到正常位准。雌性兔的血清LH和雌二醇浓度在同一抗体单次注射相同剂量时可逆性地被抑制，并得到恢复，这与雌性兔的观察结果相似，雌性兔的血清LH和雌二醇浓度在同一抗体单次注射相同剂量时呈可逆性地恢复。这些实验支持GHR-106(hIgG4)可以作为一种类似于Elagolix或Antide的基于抗体的GnRH拮抗剂作用于垂体前叶GnRH受体，只是GHR-106(hIgG4)的半衰期要长得多(天相对于小时)。

除了兔的概念验证实验外，还进行了定量RT-PCR实验，并作为一种工具，通过体外研究证明了GHR-106和十肽GnRH拮抗剂之间几乎完全相同的细胞内基因调控。因此，有理由认为，基于抗体和基于肽的GnRH拮抗剂在对抗癌细胞和可逆抑制垂体前叶促性腺激素释放的生物学机制方面高度相似，只是GHR-106具有明显更长的半衰期。

GHR-106相关抗体药物的生产

GHR-106的各种异构体，包括鼠-狗或鼠-猫嵌合形式，可以基于本领域已知的知识和方法，包括本文引用的美国专利，大量生产。例如，人(可变区)狗(恒定Fc区)嵌合抗体和鼠(可变区)狗(恒定Fc区)嵌合抗体都可以基于对狗的GHR-106抗体用药量的既定知识来大量生产。

小鼠GHR-106可通过小鼠腹水或杂交瘤细胞系体外培养的方法产生和纯化。人源化GHR-106可以通过建立的永久细胞系产生。这些包括mGHR-106(小鼠来源)、GHR-106(hIgG1)和GHR-106(hIgG4)以及不同的抗体片段，如Fab、(Fab')2或可变区的单链片段。

例1：在兔中的概念验证实验和在人类和/或家畜中广泛临床应用的含义。

GHR-106是一种通过免疫小鼠获得的抗人GnRH受体N1-29寡肽的单株抗体。GHR-106的重链和轻链的氨基酸序列如图1B所示，CDRs下划线。选择动物模型证明GHR-106与垂体GnRH受体相互作用可导致体内生殖激素的可逆性抑制。因此，比较来自不同动物物种包括人、猴、狗、猫、兔和鼠(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6)的N1-29寡肽，并在图1A中示出序列同源性。基于高度相似的序列同一性将导致它们各自GnRH受体高度相似的体内结合活性和可比的生物活性的假设，本研究选择兔作为合适的动物模型进行体内概念验证实验。具体来说，鉴于人和兔的GnRH受体的N1-N29肽的氨基酸序列相似性大于95％，发明人预测它们与GHR-106(hIgG4)结合的表观KD是相似的，因此兔被选为证明生殖激素如LH、E2和睾酮可逆抑制的合适动物。

通过对不同动物N1-29肽序列的比较，推测GHR-106在人与兔、猫、狗、猴等动物之间可能具有高度的结合交叉反应性。因此，GHR-106不仅可以作为GnRH拮抗剂应用于人类，还可以应用于其他几种动物(哺乳动物)，包括兔、狗和猫。本领域技术人员可以实施已建立的技术(例如在人源化抗体设计中使用的技术)来设计适合于不同哺乳动物物种中使用的抗体，以最小化抗体的不希望的交叉反应性的可能性。

实施例2-ELISA对比研究

GHR-106和来自上述动物物种的N1-29肽之间的结合研究对于证明GHR-106与分别来自人、狗和兔的N1-29寡肽的亲和力对比至关重要。因此，本研究采用结合ELISA方法，对GHR-106与人、狗和兔的N1-29寡肽结合的亲和力进行了对比研究，以确定GHR-106与N1-29寡肽结合的亲和力。这些结合研究的结果在图2中给出并进行了比较。

图2显示了405nm处ΔOD与GHR-106抗体浓度的双对数图，其中GHR-106单株抗体分别应用于人、狗和兔的三个分离的、包衣良好的GnRH受体N1-29合成寡肽。用RP215单株抗体作为阴性对照。用碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG作为信号检测的第二抗体。以磷酸对硝基苯酯为底物，在405nm处进行监测，并绘制了双对数图。结果表明，分别来源于人、狗和兔的GHR-106和N1-29肽的结合亲和力与无亲和力的RP215的阴性参比相比较，两者之间的结合亲和力是相当的，而N1-29肽的结合亲和力与人、狗和兔的N1-29肽的结合亲和力与人、狗和兔的N1-29肽的结合亲和力是相当的。

在以前的研究中，发明人已经表明GHR-106的三种异构体包括小鼠GHR-106、人源化GHR-106和人源化GHR-106(hIgG4)在它们各自与人GnRH受体及其N1-29寡肽的结合亲和力和特异性上基本相同，其解离常数在1-5nm量级。

基于图2所示的ELISA结合研究，已经证明GHR-106与人或兔的GnRH受体或其N1-29寡肽具有类似的结合。因此，选择兔进行概念验证实验，以证明GHR-106单次处理对体内生殖激素的可逆抑制。

实施例3：注射GHR-106的雄性兔血清LH和睾酮浓度

以前对人癌细胞的体外研究表明，1-10μg/ml不同亚型的GHR-106单株抗体共孵育24～72h，可诱导癌细胞凋亡。诱导凋亡的程度与十肽GnRH拮抗剂Antide相当，尽管抗体的分子大小是前者的50倍。

为了证明GHR-106与垂体GnRH受体的相互作用类似于十肽GnRH拮抗剂，在兔体内进行了概念验证实验。在雄兔的情况下，在皮下注射3毫克/千克的hGHR-106后，定期监测包括黄体生成素(LH)和睾酮在内的生殖激素的血清浓度。

用EIA试剂盒分别测定血清LH和睾酮浓度，并在第1～30天内绘制成时间函数。激素分布的结果显示在图3中，它显示了在一只成年雄性兔在第1天皮下注射3毫克/千克GHR-106后，血清LH(mIU/ml)和睾酮(ng/ml)浓度对天数的绘图。

如图3所示，雄性兔注射3mg/kg,24～48小时后，血清LH和睾酮均立即受到抑制(从3.5mIU/mI降至<0.5mIU/mL)。低LH位准至少持续了一到两周。随后LH位准波动上升，直至第3周末达到稳定的正常值范围(2.9～5.0mIU/ml)。在不受理论约束的情况下，人们注意到哺乳动物生殖激素位准的波动通常是在哺乳动物的日常基础上观察到的，例如由于内分泌、环境或生理原因，因此生殖激素位准的一些波动是预期的。然而，在这些例子中，在给药GHR-106后生殖激素可逆抑制的趋势是一致的，也是显而易见的。

同样，雄性兔单次注射3毫克/千克剂量，血清睾酮浓度在头两周内从0.95纳克/毫升下降到≤0.1纳克/毫升，下降了80％以上。血清睾酮位准与LH位准具有时间依赖性。在注射后的第三周，LH和睾酮位准的波动变化相互平行，直到第30天激素位准才回到正常范围内(图3)。

实施例4：在雌兔中一次注射hGHR-106时血清LH和雌二醇浓度。

单次注射3mg/kg剂量的hGHR-106，监测雌兔血清黄体生成素(LH)和雌二醇(E2)的激素位准。从第1天到第20天定期测定血清LH和E2浓度，如图4所示。

在注射抗体后的最初几天内，立即观察到LH位准的抑制(从3mIU/mI到≤1mIU/mL)。同样，在同一时间段内(从50pg/ml到≤20pg/ml)血清E2浓度平行下降，直到第10天。

第10天至第20天，LH和E2浓度均随时间延长而升高，第18天和第20天分别达到6mIU/ml和120pg/ml。

在另一个实验中，对雌性注射1毫克/千克的低剂量时，LH和E2浓度的总体分布与同一观察期内高剂量的相似(数据未提出)。

实施例5-定量基因调控研究

进行了定量基因调控研究，以证明GHR-106和肽GnRH拮抗剂Antide之间的分子机制完全相同。用GHR-106或GnRH肽拮抗剂antide与人癌细胞孵育后，与人GnRH受体结合的基因表达量发生了变化。为了进一步比较GHR-106和十肽GnRH拮抗剂，我们选择了10个调控基因，用RTPCR方法进行定量，结果显示和比较见图5。这些比较研究的结果显示GHR-106与抗肿瘤药物在作用机制上有很强的相似性。

实施例6--GHR-106单株抗体高特异性

与许多已知和可用的抗GnRH受体单株抗体相比，GHR-106对人GnRH受体具有高度特异性。特别是，测试GHR-106检测参考细胞系中GnRHR过表达的能力，并与四种不同的市售抗体进行比较。发现只有GHR-106抗体能够检测到参比细胞系中GnRHR的过度表达。

鉴于这种在人类中的组织特异性，在其他抗体中没有观察到，GHR-106可能是分别与人GnRH受体以及该受体的N1-29寡肽反应的最佳抗体之一。

此外，本文描述的其他例子也揭示了几个不同动物物种之间高度的物种交叉反应性。因此，GHR-106应被认定为第三类治疗药物。即一种基于抗体的GnRH拮抗剂，可与基于有机化学或十肽的GnRH拮抗剂相比拟。

人源化的GHR-106只能用于人类临床，无论是癌症治疗还是生育控制，这是由于在人类应用中固有的和有限的免疫原性。可以考虑对抗体，特别是抗体的Fc区进行适当的修饰，以便在其他动物物种，包括其他哺乳动物物种中进行临床应用。例如，为了避免对异体注射的过敏反应，可以用来自其他物种(如狗或猫)的嵌合抗体取代纯种小鼠源抗体(受体恒定区)。为了减少异源免疫反应，可以制备小鼠(可变，VR)-狗(恒定，Fc)嵌合IgG并用于犬。类似地，鼠-猫嵌合抗体可以根据已知的方法产生，用于猫。对于GHR-106抗体作为治疗剂在其他物种中的应用，可以进行类似的修饰。

实施例7-概念验证兔大规模实验

为了证明GHR-106(hIgG4)在体内起到GnRH拮抗剂的作用，在兔身上进行了大规模的概念验证实验，并在这些额外的例子中提供了数据。

从上述例子的数据来看，在雄兔或雌兔单次注射时，观察到生殖(即与性有关的)激素包括黄体生成素、睾酮和雌二醇的可逆抑制。注射后1～2周血清生殖激素位准恢复正常。

在对单只兔进行初步观察的基础上，采用相同的实验方案进行包括阴性对照的大规模兔实验(n≥30)。具体来说，为了进一步证实GHR-106作为GnRH拮抗剂的作用，在雄性和雌性兔中进行了大规模实验。对各实验组产生的数据进行统计学分析。各实验组兔激素位准的均值和标准偏差见图6-9以及相应的统计分析和与阴性对照的单独比较见表1-表4。

以雄性兔为例，分别于第1天皮下注射1mg/kgGHR-106(低剂量，n＝3)或3mg/kgGHR-106(高剂量，n＝3)或不注射GHR-106(阴性对照，n＝4)后，监测10只雄性兔血清中LH和睾酮等生殖激素的浓度。测定血清睾酮位准，并测定第1天至第17天的平均值(标准偏差)，测定从第1天开始至第13天结束的血清LH位准(标准偏差)。睾酮图谱的结果见图6。LH分布的结果见图7。选择的统计分析和与图6和图7的阴性对照的单独比较分别见于表1和表2。

如图6和图7所示，在第1天，单次注射低剂量或高剂量的GHR-106可可逆地抑制雄兔的血清睾酮和LH位准。与阴性参比对照，低剂量或高剂量治疗均能立即降低血清睾酮和LH位准，且有统计学意义。值得注意的是，在低剂量和高剂量组中观察到类似的抑制幅度。低剂量组和高剂量组的血清睾酮和LH在抑制几天后恢复到与阴性对照组相似的位准。

表1.图6中雄性兔睾酮谱图的选择的统计分析

表2.图7中雄性兔LH图谱的选择的统计分析

以雌性兔为例，分别于第1天皮下注射1mg/kgGHR-106(低剂量，n＝3)或3mg/kgGHR-106(高剂量，n＝3)或不注射GHR-106(阴性对照，n＝4)后，监测10只雌性兔血清生殖激素包括LH和雌二醇(E2)的浓度。从第1天开始至第17天结束测定血清E2位准，从第1天开始至第13天结束测定血清LH位准。雌二醇(E2)曲线的结果见图8。LH分布的结果见图9。选择的统计分析和与图8和图9的阴性对照的单独比较分别见于表3和表4。

如图8和图9所示，雌性家兔的血清雌二醇(E2)和LH位准在第1天被低剂量或高剂量的GHR-106单次注射可逆性地抑制。与阴性对照组相比，低剂量或高剂量治疗均可立即导致血清雌二醇(E2)和LH显著下降。值得注意的是，在低剂量和高剂量组中观察到类似的抑制幅度。低剂量组和高剂量组的血清雌二醇(E2)和LH在抑制数天后恢复至与阴性对照组相似的位准。

表3.图8雌性兔雌二醇(E2)谱图的选择的统计分析

表4.图9中母兔LH图谱的选择的统计分析

总的来说，单只或多只兔的实验都显示，单次注射1毫克/千克或3毫克/千克剂量的GHR-106(hIgG4)对生殖激素的抑制是可逆的。激素位准在1-3周后恢复至正常范围，与阴性对照组一样，表明性相关激素的抑制是可逆的。因此，与上述个体兔数据一致，在较大的实验组中观察到可逆激素抑制的效果。

总之，在GHR-106抗体治疗时，多兔和个体兔实验在时间依赖性可逆性相关激素抑制方面得出了相同的结论。因此，本发明人已经证明GHR-106(hIgG4)是一种基于抗体的长效GnRH拮抗剂，其表现出与目前临床使用的十肽GnRH拮抗剂如cetrorelix相似的生物学效应，但由于其更长的半衰期，其潜在的益处是更长的活性期。

虽然上文已经讨论了许多示例性方面和实施例，但本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，以下所附申请专利范围和下文引入的申请专利范围被解释为包括与整个规范的最广泛解释一致的所有此类修改、排列、添加和子组合。

在不限制前述的情况下，各种实施例包括多个方面，包括以下方面。这些方面基于本申请中公开的实施例，其证明因素包括(1)GHR-106对几个动物物种的高度氨基酸序列同源性和广泛的物种交叉反应性；(2)概念验证实验提供了人类或其他哺乳动物GHR-106与GnRH受体强相互作用的直接证据；(3)以抗体为基础的长效GnRH拮抗剂和以肽为基础的短效GnRH拮抗剂在定量基因表达位准变化上具有高度的同一性和一致性。

在第一方面，各种异构体或物种的GHR-106与几种不同动物物种(狗、猫、兔和猴)的GnRH受体交叉反应，并且可以用作GnRH拮抗剂，只要它们与人类在各自受体的N1-29寡肽上具有高度的序列同源性(≥90-95％)。

在第二方面，作为GnRH拮抗剂，GHR-106可用于可逆地抑制符合第一方面标准的人类或任何其他动物物种的内源生殖激素(如：LH、FSH、睾酮、雌二醇和孕酮等)。

在第三方面，作为GnRH拮抗剂，人源化IgG4同型[GHR-106(hIgG4)]中的GHR-106可以直接作用于人垂体前叶，在GHR-106治疗时可逆地抑制生殖激素，以操纵GnRH受体控制的生育调节或障碍，类似于十肽类似物如Cetrorelix的药物作用。

在第四个方面，作为GnRH拮抗剂，不同亚型或物种的GHR-106不仅可用于人类，而且也可用于其他动物物种，包括狗、猫和兔等的几乎所有受体阳性癌症的治疗。

序列表

<110>温哥华生物技术有限公司(VANCOUVER BIOTECH LTD.)

<120>GHR106单株抗体做为GnRH拮抗物之应用

<130>V101 0043/JAM

<150>US63/189852

<151>2021-05-18

<150>US63/242976

<151>2021-09-10

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Ala Asn Ser Ala Ser Pro Glu Gln Asn Gln Asn His Cys Ser Ala

1 5 1015

Ile Asn Asn Ser Ile Pro Leu Met Gln Gly Asn Leu Pro Thr

202530

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>兔(Oryctolagus cuniculus)

<400>2

Met Glu Asn Ser Ala Ser Pro Glu Gln Asn Gln Asn His Cys Ser Ala

1 5 1015

Ile Asn Asn Ser Ile Pro Leu Thr Gln Gly Asn Leu Asn Thr

202530

<210>3

<211>30

<212>PRT

<213>黑猩猩(Pan troglodytes)

<400>3

Met Ala Asn Ser Ala Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asn His Cys Ser Val

1 5 1015

Ile Asn Asn Ser Ile Pro Leu Met Gln Gly Asn Leu Pro Thr

202530

<210>4

<211>29

<212>PRT

<213>猫(Felis catus)

<400>4

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1 5 1015

Asn Asn Ser Ile Pro Leu Met Gln Gly Asn Leu Pro Thr

2025

<210>5

<211>29

<212>PRT

<213>家犬(Canis familiaris)

<400>5

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1 5 1015

Asn Asn Ser Asn Met Leu Met Gln Gly Asn Leu Pro Thr

2025

<210>6

<211>30

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

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1 5 1015

Ile Asn Asn Ser Ile Pro Leu Ile Gln Gly Lys Leu Pro Thr

202530

<210>7

<211>468

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工构造(Artificial Construct)

<400>7

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1 5 1015

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly

202530

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465

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<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工构造(Artificial Construct)

<400>8

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<220>

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<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人工构造(Artificial Construct)

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Arg

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<223>人工构造(Artificial Construct)

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1 5