基于丝素蛋白-羟基磷灰石支架的软骨细胞复合培养方法和应用

技术领域

本发明属组织工程和医用材料技术领域，涉及软骨细胞复合培养方法。具体涉及基于丝素蛋白羟基磷灰石支架复合培养人软骨细胞的方法及制得的软骨-丝素蛋白羟基磷灰石复合物在用于气管缺损重建中的应用。

背景技术

现有技术公开了外伤、肿瘤、先天性疾病、气管切开、长期气管插管等原因可造成长段气管缺损或狭窄。气道病变切除后的组织修复仍存有若干困难。临床实践中气道重建须达到以下几个目的或效果：1、完全封闭术腔，以避免气肿等；2、有类似软骨强度的支撑作用，以保持管腔状并可避免吸气时的气管塌陷；3、可以根据术中缺损的形态及大小方便地塑形；4、气道直接与外界空气接触的器官修复后，要求粘膜可以在修复组织或材料上生长，以排出痰液减少堵塞及感染。目前临床常用的重建方法常难以达到满意效果，且修复不当极易引起发音、吞咽、呼吸、粘液纤毛对吸入性抗原的清除和免疫反应功能损害，从而导致生活质量下降甚至危及生命。以及，由于供应气管的血管纤细且呈节段性分布，较难进行血管吻合，故类似于肝脏、肾脏移植的同种异体气管移植在临床上很难应用，且同种异体组织重建，供体来源紧张，术后需要长期服用免疫抑制剂；自体组织重建，因取材有限，不能修补较大的缺损且会造成对人体供体部位的损伤，等等。

为提高长段气管缺损修复的可能性及成功率，本领域技术人员关注性能优良的人工气管修复材料的研制。目前研究较多的气管修复材料有不可降解合成材料聚丙烯、可降解合成材料聚乳酸-聚乙醇酸、天然高分子材料胶原、壳聚糖等，但上述材料均具有一定局限性。合成材料虽具有几个明显的优势：1、来源丰富，不需要供体。2、制作过程简单、快捷，可以满足不同病人个体化需要。3、机械强度较好。但合成材料(如聚乳酸-聚乙醇酸、聚丙烯支架)的缺点也显而易见，其生物相容性较差，易引起炎症反应，易形成肉芽组织及感染。胶原、壳聚糖、核心蛋白聚糖等可降解天然大分子生物材料，其优点是结构类似细胞外基质成分。然而尽管它们的组织相容性非常好，但是因机械强度存在着明显不足，不适宜单独用于气管支架。

丝素蛋白作为一种功能性生物材料，近年来其应用研究倍受研究人员关注，因其，1.丝素蛋白来源丰富，材料制作可控性强。丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶而得到的纤维状蛋白质，改变丝素蛋白制作过程的条件，可以得到不同孔径、形貌、机械性能和降解时间的支架以适应不同的组织修复要求；丝素蛋白可以被降解吸收，而吸收速率与移植部位、机械环境、宿主健康状况、生理特点、种类及丝素蛋白形态、结构等有关；2.丝素蛋白具有良好的生物相容性，具有生长因子等细胞因子结合修饰位点，能促进细胞黏附生长；丝素蛋白具有和人体角蛋白相同的氨基酸组成；丝素蛋白因含有细胞结合结构域，利于细胞粘连。丝素蛋白支架的三维多孔结构类似于细胞外基质为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，有利于细胞的粘附、增殖和分化。已有研究证实了丝素蛋白优良的组织相容性，能促进视网膜色素上皮，角膜上皮，鼓膜上皮，成纤维细胞等的生长，并可支持软骨细胞的粘附、增殖、分化及软骨的形成；3.丝素蛋白可以诱导调节钙盐沉积。是最常用的生物矿化及和羟基磷灰石杂交的聚合物之一。这是因为一方面，丝素蛋白与胶原蛋白有相似的结构；另一方面，丝素蛋白表面暴露的羰基在诱导矿化中起着非常重要的作用。

羟基磷灰石是人类骨组织的主要成分，研究显示其具有良好的生物相容性、生物活性，无免疫原性，不引起机体炎症反应，良好的骨传导性，并与人体本身的组织形成良好的化学键合，是临床上已在应用的骨替代物。有报道显示羟基磷灰石纳米结晶在体内可以诱导内皮细胞活化、黏附和增殖；

迄今为止，国内外尚无有关人软骨细胞-丝素蛋白羟基磷灰石支架复合物在气管缺损重建方面应用的报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种软骨细胞复合培养方法，尤其是基于丝素蛋白羟基磷灰石支架复合培养人软骨细胞的方法及制得的软骨-丝素蛋白羟基磷灰石复合物在用于气管缺损重建中的应用。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种软骨细胞复合培养方法，具体涉及基于丝素蛋白羟基磷灰石支架复合培养人软骨细胞的方法及制得的软骨-丝素蛋白羟基磷灰石复合物在用于气管缺损重建中的应用。

本发明提供了一种在丝素蛋白羟基磷灰石复合支架上进行人原代软骨细胞培养的方法，及其在临床气管缺损重建中的应用前景。

本发明采用丝素蛋白羟基磷灰石复合材料作为支架材料，以离体的人鼻中隔软骨细胞作为种子细胞，形成软骨-多孔丝素羟基磷灰石支架复合物。本发明利用丝素及羟基磷灰石的良好生物相容性和促进细胞生长的作用，为呼吸道管腔的修复提供必需的支撑。

本发明软骨细胞-丝素羟基磷灰石支架复合物可用作临床气管缺损修补，能为探讨软骨-丝素蛋白羟基磷灰石复合物在促进气管修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症的作用提供有意义的参考。

本发明所述的丝素羟基磷灰石上软骨细胞培养步骤如下：

1、制备多孔丝素蛋白羟基磷灰石复合支架

1.丝蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备

1.1再生丝蛋白水溶液的制备

将桑蚕蚕茧除去蚕蛹和杂质，随后放入碳酸钠(0.5wt％)的沸水溶液中煮30分钟以脱除丝胶，用去离子水漂洗干净后在40℃烘箱内干燥备用，得到脱胶丝；

将脱胶丝置于9.5M的溴化锂水溶液中，60℃下溶解一小时后，溶液经8层医用纱布过滤去除固体杂质，把所得的溶液置于截流分子量为12,000～14,000Da的透析袋中，用去离子水透析三天以除去盐。透析好的丝蛋白溶液在8000rpm下离心10分钟，再经8层医用纱布过滤，收集上层澄清部分并将该溶液置于4℃冰箱内保存，用称重法标定浓度；

上清液用12.5wt％的聚乙二醇水溶液透析浓缩，得到浓度约为14wt％的再生丝蛋白水溶液。丝蛋白水溶液的浓度通过称重法测定，并放置在4℃冰箱中保存，其它浓度的丝蛋白溶液通过去离子水将14wt％的溶液稀释得到。操作过程中尽量避免剧烈搅拌、震荡以及与有机溶剂接触等，以防引起溶液中丝蛋白构象的变化而变性。

1.2丝蛋白/羟基磷灰石复合悬浮液的制备

配置0.54M的磷酸氢二钠水溶液和2M的氯化钙水溶液；依据羟基磷灰石与丝蛋白的比例，在丝蛋白水溶液中加入一定量的氯化钙溶液，在37℃摇床内混合约三十分钟；随后，再加入一定量的磷酸氢二钠溶液继续混合三十分钟；之后，在37℃恒温水浴中培养24小时，制得丝蛋白/羟基磷灰石复合悬浮液。

1.3正丁醇/丝蛋白/羟基磷灰石复合乳液的制备

取不同浓度的丝蛋白/羟基磷灰石复合悬浮液，逐滴加入不同量的正丁醇，室温下400rpm搅拌2分钟，即形成稳定的乳液。

1.4乳液冷冻法制备丝蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架

将制得的正丁醇/丝蛋白/羟基磷灰石复合乳液倒入模具中，在-20℃冰箱中冷冻24h，室温下解冻，用去离子水漂洗多次，除去正丁醇后，得到丝蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架，修剪为直径0.5cm、厚1mm大小备用。

2、人鼻中隔软骨细胞原代培养

取人鼻中隔矫正术后鼻中隔软骨,立即浸泡在含10％FBS的DMEM培养液中，用含1×10

3、人鼻中隔软骨细胞与多孔丝素-羟基磷灰石支架的复合培养

当人软骨细胞生长达到80％融合后，吸除培养液，PBS洗涤3遍，加入0.25％胰酶，消化约3分钟，见细胞变圆。立即加入含10％FBS的DMEM培养液终止消化，吸管反复吹打，将细胞吹下。离心1000转/分×5分钟。弃上清，用含10％FBS的DMEM培养液再洗涤一遍(离心1000转/分×5分钟)，弃上清。加入含10％FBS的DMEM培养液，一次性无菌吸管轻轻吹打混匀。将多孔丝素蛋白羟基磷灰石复合支架放置于24孔培养板中，以1×10

实验结果显示：

1)人鼻中隔软骨原代细胞培养：

培养24h可见部分细胞贴壁,细胞由圆形逐渐变成梭形或多角形,培养第2～3天,细胞开始分裂增殖,培养第7～9天,细胞增殖加速,约10天细胞达80％融合。

2)多孔丝素羟基磷灰石上软骨细胞生长扫描电镜观察：

人软骨细胞可以在多孔丝素羟基磷灰石复合支架上生长、增殖，扫描电镜观察显示软骨细胞在多孔丝素羟基磷灰石复合支架黏附良好，3天细胞开始增殖；7天后细胞增殖明显，并分泌基质；14天细胞铺满材料，并保持良好的形态，材料表面已基本被细胞及基质完全覆盖。

3)多孔丝素羟基磷灰石支架上软骨细胞生长钙黄绿素染色观察：

活细胞钙黄绿素染色(Calcein AM)，证实细胞活力良好的软骨细胞在3天已粘附并分布在整个支架中，这些细胞逐渐增殖，遍布支架，在第7天和第14天细胞仍保持良好的活力。

本发明实验结果显示，离体的人软骨细胞可以黏附多孔丝素羟基磷灰石复合支架上，且生长良好，活细胞钙黄绿素染色显示多孔丝素羟基磷灰石支架上人软骨细胞活性良好，扫描电镜可见细胞分泌大量基质，逐渐覆盖整个支架。

本发明在多孔丝素羟基磷灰石支架上培养人软骨细胞，形成人软骨细胞-多孔丝素羟基磷灰石支架复合物，可以作为一种人工气管修复气管缺损，这种人工气管更接近于正常气管强度，利于气管粘膜上皮生长，进一步促进人工气管的临床应用。

本发明的优点在于，

将大分子丝素材料和羟基磷灰石结合，使丝素蛋白矿化，可以相互弥补两者作为人工气管材料的缺点，并增强复合支架的机械强度；丝素蛋白可以诱导羟基磷灰石在表面沉积，并通过强有力的化学交联形成复合物；矿化的丝素蛋白支架机械强度明显增强。同时丝素蛋白羟基磷灰石复合支架具有良好的生物相容性并通过调节细胞内信号系统产生骨诱导作用,可以有效地诱导骨、软骨的再生。

附图说明

图1，人鼻中隔软骨原代培养，其中，A,П型胶原染色，B,亚甲胺蓝染色。

图2，人原代鼻中隔软骨细胞多孔丝素羟基磷灰石支架上生长钙黄绿素活细胞染色，其中，A,接种3天细胞可见增殖，B,7天后细胞增殖明显，C,14天天细胞长满材料、荧光增强，细胞保持良好的形态及活性，显示了离体的人原代软骨细胞可以在多孔丝素羟基磷灰石支架上生长、增殖，钙黄绿素活细胞荧光染色显示软骨细胞具有良好的活性及形态；

图3，人原代鼻中隔软骨细胞多孔丝素羟基磷灰石支架上生长扫描电镜观察，显示人原代软骨细胞可以在多孔丝素羟基磷灰石支架上生长、增殖，扫描电镜观察显示软骨细胞与多孔丝素羟基磷灰石支架黏附良好，其中，A，3天可见材料上软骨细胞增殖，B,7天后软骨细胞增殖明显并分泌基质，C,14天人软骨细胞铺满材料，显示出层叠生长并分泌多量基质。

具体实施方式

实施例1制备多孔丝素蛋白羟基磷灰石支架

将桑蚕蚕茧放入碳酸钠(0.5wt％)的沸水溶液中煮30分钟以脱除丝胶，将脱胶丝置于9.5M的溴化锂水溶液中溶解，透析得到的丝蛋白溶液在8000rpm下离心10分钟，上清液用12.5wt％的聚乙二醇水溶液透析浓缩，再生丝蛋白水溶液。在丝蛋白水溶液中加入一定量的氯化钙溶液、磷酸氢二钠溶液得到丝蛋白/羟基磷灰石复合悬浮液。取不同浓度的丝蛋白/羟基磷灰石复合悬浮液，逐滴加入不同量的正丁醇，室温下400rpm搅拌2分钟，即形成稳定的乳液。将正丁醇/丝蛋白/羟基磷灰石复合乳液倒入模具中，在-20℃冰箱中冷冻24h。室温下解冻，用去离子水漂洗多次，除去正丁醇后，即得到丝蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架。修剪为直径0.5cm、厚1mm大小备用。

实施例2人鼻中隔软骨细胞原代培养

取人鼻中隔矫正术后鼻中隔软骨,立即浸泡在含10％FBS的DMEM培养液中，用含1×105U/L青霉素及1×105U/L链霉素的生理盐水冲洗三遍，再用PBS冲洗三遍，置于60cm培养皿里，浸于含10％FBS的DMEM培养液中，用眼科剪剪成约0.5mm×0.5mm大小，加入II型胶原酶4℃消化过夜。将培养液离心1000转/分×5分钟。弃上清，用含10％FBS的DMEM培养液洗涤一遍(离心1000转/分×5分钟)，弃上清，加入3ml含10％FBS的DMEM培养液，一次性无菌吸管轻轻吹打混匀，置25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。每2-3天更换培养液。

实施例3人软骨细胞与多孔丝素羟基磷灰石支架的复合培养

当人鼻中隔软骨细胞生长达到80％融合后，胰酶消化，调整细胞浓度为1×10

本发明实验结果显示，离体的人原代软骨细胞可以在多孔丝素羟基磷灰石支架上生长、增殖，钙黄绿素活细胞荧光染色显示软骨细胞具有良好的活性及形态；

以及显示人原代软骨细胞可以在多孔丝素羟基磷灰石支架上生长、增殖，扫描电镜观察显示软骨细胞与多孔丝素羟基磷灰石支架黏附良好。