一种可以诱导软骨分化的猪鼻中隔软骨来源的脱细胞外基质支架的构建方法

技术领域

本发明属于组织工程材料领域，具体地说是一种可以诱导软骨分化的猪鼻中隔软骨来源的脱细胞外基质支架的构建方法。

背景技术

在软骨组织工程领域中，合适的支架对于组织再生至关重要。不同的细胞支架旨在通过模拟细胞外基质(ECM)的自然环境，提供各种物理和生物信号以促进细胞生长和功能。其中，ECM衍生的细胞支架因其含有组织特异性成分一直是组织再生工程中的研究热点。在脱钙骨基质能够诱导异位骨形成的能力得到证明后，越来越多的证据表明，软骨衍生的脱细胞基质(DCM)似乎可能有调节干细胞向软骨细胞分化的功能。

据报道，来自猪鼻中隔软骨的ECM在诱导人类软骨再生方面具有潜力。此外，猪鼻软骨衍生的DCM可能保留有利于间充质干细胞(MSCs)软骨形成分化的生物诱导因子。甚至，DCM中的这些生物诱导因子可能有减少软骨细胞的成骨发育的潜力。然而，这些具体的生物诱导因子仍然未知，它们在软骨组织工程中的作用途径仍然不明确。另外，目前未有报道使用无标记定量蛋白质组学分析方法对猪鼻中隔软骨衍生的DCM中的蛋白质进行鉴定和定量

然而，并非所有的DCM生产技术都适用于软骨组织工程，过多的物理、化学和酶法处理的组合可能会损害ECM中的生物蛋白质，包括蛋白聚糖、胶原蛋白和生长因子。这可能是现有细胞支架需要通过额外添加生长因子才能诱导MSCs向软骨细胞分化的原因。于是我们提出假设：能否通过有效保留猪鼻中隔软骨ECM中的生物诱导因子，实现在不需要添加外源性生长因子的情况下诱导MSCs分化形成类软骨组织。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可以诱导软骨分化的猪鼻中隔软骨来源的脱细胞外基质支架的构建方法，以解决背景技术中提出的问题。

一种可以诱导软骨分化的猪鼻中隔软骨来源的脱细胞外基质支架的构建方法，包括以下制备步骤：

S1、获取新鲜的猪鼻中隔软骨，鼻中隔软骨在无菌条件下用无菌蒸馏水冲洗，消除表面血液；

S2、在无菌条件下，使用手术器械去除软骨表面的骨膜，并将软骨切成约0.3厘米×0.3厘米的颗粒；

S3、三次冻融循环后进行物理机械研磨脱细胞：将颗粒在-80℃下冷冻24小时，然后在4℃下解冻24小时，重复3次，将约2ml软骨颗粒装入5ml厚壁冻存管中，使用冷冻研磨机在-60℃下以70HZ频率进行研磨，并每研磨2分钟后，停顿20秒，重复循环三次，获得软骨匀浆；

S4、在4倍放大镜下，低温环境中手动去除较大的软骨颗粒；

S5、将软骨匀浆等量分装入2毫升冻存管中，放置在-80℃下冷冻24小时后，使用冷冻干燥机进行冻干24小时，产生PN-DCM；

S6、将PN-DCM切片，并使用环氧乙烷进行低温灭菌处理。

优选的，脱细胞过程中不额外添加化学试剂以及纯水，完全属于物理研磨。研磨方式是在5ml厚壁冻存管中，添加约2毫升软骨颗粒，且每管放入一个大号和一个中号的钢球，在-60℃环境中，使用70HZ频率进行间断研磨(研磨2分钟后，停顿20秒，重复循环3次)，获得软骨匀浆，进行低温冻干灭菌后获得支架。

优选的，冻干后所产生的PN-DCM的直径在0.8—0.9厘米。

优选的，还包括对空的PN-DCM支架中保存的潜在生物诱导因子进行蛋白质提取、定量和酶消化，将肽溶解在0.1％甲酸和2％乙腈的溶液中，在4℃下以13200rpm的速度离心20分钟，收集上清液，并进行质谱分析和无标记定量蛋白质组学分析。

优选的，所述PN-DCM支架呈三维多孔结构，其中所含的胶原呈片状，相互交织形成网状结构。

优选的，所述PN-DCM支架的孔洞面积在1.4mm

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过从猪鼻中隔软骨构建脱细胞外基质支架，并对该支架进行无标记定量蛋白质组学分析，确定得到的细胞支架能够在不添加外源性生长因子的前提下促进干细胞分化形成类软骨组织，并观察到未经细胞培养的空白支架的Safranin-O染色整体呈现阳性，并且未见明显软骨细胞残留。蛋白组学分析结果表明所构建的PN-DCM支架保留了近1298种天然软骨基质中的蛋白成分。

附图说明

图1为本发明PN-DCM支架的总体形态；其中A为猪鼻中隔软骨在处理前的外观；B为从代表性供体中低温研磨后形成了白色凝胶状的细胞外基质；C为在低温冷冻管中冷冻干燥后，PN-DCM形成的圆柱形海绵状支架；D为所切割的厚度约为2.0±0.2mm的PN-DCM支架；E为直径约为0.85±0.5cm的PN-DCM支架；F为PN-DCM支架的多孔结构图。

图2为本发明在SEM下，空的PN-DCM支架显示出的三维多孔结构图；

图3为本发明在SEM下，空的PN-DCM支架中的胶原成分呈叶片状，相互交织形成网状结构图；

图4为本发明使用Safranin-O染色对切片进行染色，硫酸化蛋白聚糖呈阳性染色图；

图5为本发明切片上硫酸化蛋白聚糖呈阳性染色图的放大图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例一：如附图1所示，制备猪鼻中隔软骨衍生的脱细胞基质(PN-DCM)支架：取三个新鲜的猪鼻中隔软骨样本，每个软骨样本在无菌条件下用无菌蒸馏水冲洗，以去除表面的血液。然后，在无菌条件下，使用手术器械小心地去除软骨表面的骨膜。软骨随后被切割成大约0.3cm×0.3cm大小的颗粒。随后，颗粒经历了三次冻融循环：首先，在-80℃下冷冻24小时，然后在4℃下解冻24小时。将软骨颗粒放入5ml厚壁储存管中，每管约2ml颗粒，每管放入一个大号和一个中号钢球。使用冷冻研磨机在-60℃下运行，频率为70HZ，进行研磨。每研磨2分钟后，暂停20秒；重复这个循环三次，以获得软骨匀浆。在4倍放大视野下，手动去除较大的软骨颗粒，此过程在低温环境中进行，以防止蛋白质的热变性。然后，将软骨匀浆分装到2ml冻存管中，放置在-80℃下冷冻24小时。随后，使用冷冻干燥机进行冻干24小时，产生直径约为0.85±0.5cm的PN-DCM。然后将其切成约2.0±0.2cm厚的切片，并使用环氧乙烷进行低温灭菌处理。

实施例二：通过灭菌后的蛋白质组学分析，对空的PN-DCM支架中保存的潜在生物诱导因子进行了分析。首先，对PN-DCM支架进行了蛋白质提取、定量和酶消化。随后，将肽溶解在0.1％甲酸和2％乙腈的溶液中，然后在4℃下以13200rpm的速度离心20分钟。收集上清液，并进行质谱分析。然后进行了无标记定量蛋白质组学分析。液相色谱分离采用DionexUltimate 3000 RSLCnano和自制柱，流速为300nl/min，使用120分钟的梯度。整个质谱图谱在分辨率为70000的Thermo Scientific Q Exactive下进行分析，扫描范围为300到1800m/z。随后以分辨率为17500进行了MS/MS分析。通过将MS和MS/MS肽段数据与数据库uniprot-sus-scrofa-20230111.fasta进行交叉引用，鉴定了蛋白质。使用MaxQuant进行蛋白质定量，该软件采用LFQ算法分析肽段的同位素峰。蛋白质比值基于共享肽段的中位数比值确定，并进行基本的统计分析、GO功能注释和KEGG通路分析。同时利用SEM对空的PN-DCM支架或细胞种植构建物在培养4周后的微观结构和细胞形态进行了研究。

如说明书附图2和附图3所示，在SEM下，空的PN-DCM支架显示出三维多孔结构，其中DCM呈平板状，相互锁定形成网状结构，根据SEM图像，空的PN-DCM支架的孔隙大小范围从1.4mm

如说明书附图4和附图5所示，使用Safranin-O染色对切片进行染色，观察硫酸化蛋白聚糖。观察到未经细胞培养的空白支架的染色整体呈现阳性，并且未见明显软骨细胞残留。蛋白组学分析结果表明所构建的PN-DCM支架保留了近1298种天然软骨基质中的蛋白成分。。

由上可知，由猪鼻中隔软骨制作形成的脱细胞外基质支架，在电子显微镜下可以看到面积大小从1.4mm

重要的是，应注意，在多个不同示例性实施方案中示出的本申请的构造和布置仅是例示性的。尽管在此公开内容中仅详细描述了几个实施方案，但参阅此公开内容的人员应容易理解，在实质上不偏离该申请中所描述的主题的新颖教导和优点的前提下，许多改型是可能的。因此，本发明不限制于特定的实施方案，而是扩展至仍落在所附的权利要求书的范围内的多种改型。

此外，为了提供示例性实施方案的简练描述，可以不描述实际实施方案的所有特征(即，与当前考虑的执行本发明的最佳模式不相关的那些特征，或与实现本发明不相关的那些特征)。

应理解的是，在任何实际实施方式的开发过程中，如在任何工程或设计项目中，可做出大量的具体实施方式决定。这样的开发努力可能是复杂的且耗时的，但对于那些得益于此公开内容的普通技术人员来说，不需要过多实验，所述开发努力将是一个设计、制造和生产的常规工作。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。