2”-O-没食子酰基金丝桃苷在制备治疗和/或缓解甲状腺相关眼病的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及2”-O-没食子酰基金丝桃苷在制备治疗和/或缓解甲状腺相关眼病的药物中的应用。

背景技术

甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)是毒性弥漫性甲状腺肿(又称为Graves病)最常见的甲状腺外表现，25％～50％的Graves病患者会伴发TAO，且以中青年为主，是成人发病率最高的眼眶疾病。TAO主要临床表现包括突眼、斜视及睑挛缩等，其外貌改变或眼部不适长期影响着患者心理健康和生活质量；严重者可出现角膜暴露及视神经压迫，甚至危害视力引起失明，对患者社会功能造成极大危害。因此，TAO治疗药物的医疗市场需求非常庞大。但目前TAO的治疗手段有限，对于活动期TAO，作为一线方案的静脉激素冲击疗法的有效率仅约60％，且副作用大；而慢性期TAO尚无有效药物治疗措施，主流的抗炎治疗无法解决突眼等核心问题，总体疗效欠佳，其中15％会继续进展。因此，探索TAO的针对性的治疗方法是本领域亟待解决的难点和热点。

现有研究表明，眼眶成纤维细胞(Orbital fibroblasts，OFs)在TAO病理过程中扮演重要角色，是TAO发生发展的核心病理机制。因此，抑制OFs的成脂分化及纤维化，有望缓解或逆转组织重塑，是治疗TAO的关键突破口。

2”-O-没食子酰基金丝桃苷(2”-O-galloylhyperin；CAS:53209-27-1)可从鹿蹄草、泽漆等植物中提取得到，来源广泛，其结构式如下式I所示：

现有研究表明，2”-O-没食子酰基金丝桃苷对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，同时，其还具有很强的单宁活性，抗氧化活性以及消除脂质过氧自由基和抑制脂质过氧化活性的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种2”-O-没食子酰基金丝桃苷的新用途。

根据本发明的一个方面，提供了2”-O-没食子酰基金丝桃苷在制备具有抑制成纤维细胞如下病理过程中的至少一种作用的药物中的应用：

(1)细胞增殖；

(2)成脂分化；

(3)透明质酸的合成及分泌；

(4)纤维化。

发明人通过大量的试验及研究发现2”-O-没食子酰基金丝桃苷可有效调控TAO患者眼眶成纤维细胞的各种病理过程，包括过度增殖、脂质分化、纤维化及透明质酸合成分泌等，具有良好的免疫调节作用，可通过非免疫抑制途径发挥缓解和/或治疗TAO的作用，可应用于制备治疗和/或缓解甲状腺相关眼病的药物。

在一些实施方式中，治疗和/或缓解甲状腺相关眼病的药物可以包括2”-O-没食子酰基金丝桃苷和药学上可接受的一种或多种辅料。

在一些实施方式中，药学上可接受的辅料包括但不限于：溶剂、增溶剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、矫味剂、pH调节剂、增稠剂、稳定剂等。

在一些实施方式中，可通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤途径施用药物。

在一些实施方式中，药物的剂型可以为注射剂、口服剂、喷雾剂或吸入剂。

在一些实施方式中，药物的剂型可以为口服剂。

在一些实施方式中，口服剂可以选自片剂、颗粒剂、口服液、胶囊剂中的至少一种。

在一些实施方式中，口服剂可以为片剂。

在一些实施方式中，片剂中2”-O-没食子酰基金丝桃苷的含量可以为20mg/片。

附图说明

图1为CKK8检测不同浓度2”-O-GH对成纤维细胞细胞活力的影响的结果图；

图2为EdU检测不同浓度2”-O-GH对成纤维细胞增殖的影响的结果图，其中，

图3为不同浓度2”-O-GH抑制成纤维细胞的成酯分化的结果图，其中，

图4为不同浓度2”-O-GH抑制成纤维细胞的透明质酸分泌的结果图，其中，

图5为不同浓度2”-O-GH抑制成纤维细胞纤维化的结果图，其中，

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所用原料和试剂为可以通过市售获得的常规产品；实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。

实施例1药效实验

1、材料及试剂盒

增殖培养基：含10％(vol/vol)胎牛血清的DMEM-F12(Gibco Laboratories，美国)；

分化培养基及油红O染色液：商品化诱导成脂培养基(赛莱拉，广州，中国)；

Cell counting kit-8(CCK-8)细胞增殖试剂盒(凯基，广州，中国)；

EdU DNA合成检测试剂盒(锐博，广州，中国)；

透明质酸ELISA试剂盒(Echelon Bioscience Inc.，美国)；

2”-O-没食子酰基金丝桃苷原料(索莱宝：YZ-111629，中国)：粉末加超纯水配成浓度100mM原液，以一定比例稀释成5、20及50μM在体外处理细胞。

2、2”-O-没食子酰基金丝桃苷(2”-O-GH)抑制TAO患者OFs的增殖

(1)提取TAO患者(n＝6)眼眶的OFs，在增殖培养基中传代至P2进行实验，分为2”-O-GH不同浓度处理组(0、5、20、50、100及200μM)，开始处理后连续3天加入相同浓度的CCK8培养4h后读取吸光度(450nm)，结果如图1所示，随着2”-O-GH浓度增加及作用时间延长，细胞活性逐渐下降，选取无细胞毒性的浓度作为实验对象2”-O-GH(0、5、20、50μM)。

(2)提取TAO患者(n＝5)眼眶的OFs，在增殖培养基中传代至P2进行实验，用同步化处理后，在诱导成脂培养基处理下，分为2”-O-GH(0、5、20、50μM)共4组，随后加入EdU 37℃孵育18h，固定细胞后进行染色，用荧光显微镜拍照，统计EdU阳性比例。

(3)实验结果

结果如图1～2所示。

OFs的过度增殖是TAO的病理生理机制之一，为验证2”-O-GH是否影响其增殖，本发明提取了TAO患者OFs，将OFs在增殖培养基中分别用不同浓度的2”-O-GH处理后，然后进行CCK8细胞活性实验，发现过高2”-O-GH对OFs的增殖有抑制作用，且呈时间和浓度依赖性，见图1。

由图1结果可知，当2”-O-GH浓度超过50μM出现较大细胞毒性，因此后续实验使用5、20、50μM的2”-O-GH浓度进行实验。进一步用EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖实验检测DNA合成，通过统计EdU阳性比例，发现2”-O-GH不同浓度处理组相比对照组差异具有统计学意义，表明2”-O-GH(20、50μM)均可显著抑制OFs的细胞增殖。

3、2”-O-没食子酰基金丝桃苷(2”-O-GH)抑制TAO患者OFs的成酯分化

(1)提取TAO患者(n＝5)眼眶的OFs，在增殖培养基中传代至P3，待细胞密度达90％以上开始换用诱导培养基，分为2”-O-GH(0、5、20、50μM)共4组，10天后固定细胞，用光学显微镜拍摄普通相差图像及油红O染色后图像(100×)。

(2)诱导分化4天成功后收集各组细胞提取蛋白，进行免疫印迹实验，检测成脂肪分化相关标志物的变化。

(3)实验结果

结果如图3所示。

TAO患者出现突眼症状主要由OFs的成脂分化压迫眶周组织导致，为验证2”-O-GH对OFs上述病理过程是否有影响，本发明对TAO患者OFs进行诱导分化培养，同时用2”-O-GH(5、20、50μM)处理或无处理对照，通过油红染色法及免疫印迹实验检测OFs的成脂分化能力。

由图3结果可知，2”-O-GH(20、50μM)可以抑制脂滴形成，同时，免疫印迹实验结果显示，成脂前期及中期的标志物PPARγ，Perilipin-1(PELN1)，FABP4，CEBPα的表达水平被2”-O-GH(20、50μM)下调，表明2”-O-GH(20、50μM)均可显著抑制OFs的成脂分化。

3、2”-O-没食子酰基金丝桃苷(2”-O-GH)抑制TAO患者OFs透明质酸的分泌

(1)提取TAO患者(n＝4)眼眶的OFs，在增殖培养基中传代至P3，待细胞密度达90％以上开始换用诱导培养基，分为2”-O-GH(0、5、20、50μM)共4组，处理细胞48h，取培养基上清，4℃离心去除死细胞后用透明质酸酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)试剂盒检测透明质酸浓度。

(2)实验结果

如图4所示。

透明质酸是TAO患者眼眶中主要的亲水性粘多糖，促进眶周内容物增多及压迫周围组织，且在诱导培养基的刺激下分泌显著增多。

ELISA检测结果表明2”-O-GH(50μM)显著抑制透明质酸分泌。

4、2”-O-没食子酰基金丝桃苷(2”-O-GH)抑制TAO患者OFs纤维化

(1)提取TAO患者(n＝7)眼眶的OFs，在增殖培养基中传代至P3，待细胞密度达90％以上开始加TGF-β1(10ng/mL)诱导纤维化，分为2”-O-GH(0、5、20、50μM)共4组，处理细胞72h，对纤维化标志物胶原蛋白I型(COL1A1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分别染色。

(2)实验结果

如图5所示。

OFs纤维化是TAO患者眼眶组织重塑及慢性化的重要病理机制，促进眶周内容物增多及压迫周围组织。

结果表明，2”-O-GH可抑制OFs纤维化。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。