同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法。

背景技术

5-异喹啉磺酸（5-Isoquinolinesulfonic acid），分子式：C

目前5-异喹啉磺酸的主要合成工艺是以异喹啉为原料，通过成盐、磺化两步反应定向合成5-异喹啉磺酸，而在合成过程中异喹啉的碱性略强于喹啉，能与各种酸成盐，亲核反应在1位、5位、6位、7位、8位均有可能发生，从而形成1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸的同分异构体，但是盐酸法舒地尔的中间体为5-异喹啉磺酸，并且在原料异喹啉反应过程中还可能含有8-喹啉磺酸以及反应不完全的异喹啉，因此在5-异喹啉磺酸中间体中可能存在的杂质为异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸六种。

5-异喹啉磺酸作为重要的医药中间体，其质量差异对终产品的质量优劣起关键作用，因此质量控制尤其重要，再加上盐酸法舒地尔、瑞格列奈的工艺合成路线较短，5-异喹啉磺酸作为其起始原料的质量控制就更加必不可少。目前，对于5-异喹啉磺酸的检测方法较少，公开号CN113358761A公开了一种5-异喹啉磺酸的检测方法，包括供试品溶液制备、对照溶液制备和检测步骤，通过对方法的专属性、系统适用性、线性范围、定量限、检测限、准确度，精密度、溶液稳定性及方法耐用性的方法学研究，表明方法可用于5-异喹啉磺酰氯盐酸盐中已知杂质5-异喹啉磺酸的检测。虽然此方法可用于检测5-异喹啉磺酸，但是对于5-异喹啉磺酸的多种杂质不能达到分离的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，主峰与各杂质峰间的分离度好，操作简单，精密度高，稳定性好，重现性好。

本发明所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取5-异喹啉磺酸，用稀释剂A溶解并稀释，作为供试品溶液；

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用稀释剂B溶解并稀释，作为各杂质贮备液；

分别量取上述各杂质贮备液，用稀释剂A稀释，作为各杂质定位溶液；

称取5-异喹啉磺酸，分别量取上述各杂质贮备液加入，再用稀释剂A稀释，作为标准溶液；

（2）色谱条件包括：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

检测器：PDA或紫外检测器；

检测波长：270-280nm；

流动相：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比（92-94）:（6-8）的混合溶液为流动相A，

甲醇为流动相B；

（3）测定法：精密量取供试品溶液、各杂质定位溶液、标准溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中与标准溶液色谱图中保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算。

所述的磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.02mol/L-0.05mol/L。

所述的色谱柱为C18柱，规格：柱长为150-250mm，柱内径4.0-4.6 mm，填料粒径3.5-5μm。

所述的流动相A和流动相B的流速为0.9-1.1mL/min。

所述的色谱柱的柱温为28-32℃。

步骤（2）的色谱条件还包括：梯度洗脱程序如下：0min，100%体积比的流动相A；18-20min，100%体积比的流动相A；40-45min，45-65%体积比的流动相A和35-55%体积比的流动相B；45-50min，45-65%体积比的流动相A和35-55%体积比的流动相B；46-51min，100%体积比的流动相A；55-65min，100%体积比的流动相A。

所述的稀释剂A为甲醇与水按照体积比1:4-1:3混合的溶液，稀释剂B为甲醇与水按照体积比1:1-2:1混合的溶液。

所述的供试品溶液中5-异喹啉磺酸的浓度为0.2-0.4mg/mL。

所述的各杂质贮备液中异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸的各杂质的浓度均为0.2-0.4mg/mL，所述的各杂质定位溶液中异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸的各杂质的浓度均为0.02-0.04mg/mL。

所述的标准溶液中5-异喹啉磺酸的浓度为0.2-0.4mg/mL，异喹啉的浓度为0.05-4μg/mL，1-异喹啉磺酸为0.03-4μg/mL，6-异喹啉磺酸为0.04-4μg/mL，7-异喹啉磺酸为0.04-4μg/mL，8-异喹啉磺酸为0.02-4μg/mL，8-喹啉磺酸为0.03-4μg/mL。

具体的，所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取5-异喹啉磺酸，用甲醇:水（1:4-1:3）（v/v）溶解并稀释制成每1mL中含0.2-0.4mg的溶液，作为供试品溶液；

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1-2:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.2-0.4mg的溶液，作为各杂质贮备液；

分别量取上述各杂质贮备液1mL，置100mL量瓶中，用甲醇:水（1:4-1:3）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为各杂质定位溶液；

称取5-异喹啉磺酸0.02-0.04g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4-1:3）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。

（2）色谱条件：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，C18柱；

检测器：PDA或紫外检测器；

检测波长：270-280nm；

流动相：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比（92-94）:（6-8）的混合溶液为流动相A，甲醇为流动相B；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.02mol/L-0.05mol/L；

流速：0.9-1.1mL/min；

柱温：28-32℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序如下：梯度洗脱程序如下：0min，100%体积比的流动相A；18-20min，100%体积比的流动相A；40-45min，45-65%体积比的流动相A和35-55%体积比的流动相B；45-50min，45-65%体积比的流动相A和35-55%体积比的流动相B；46-51min，100%体积比的流动相A；55-65min，100%体积比的流动相A。

（3）测定法：精密量取供试品溶液、各杂质定位溶液、标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中与标准溶液色谱图中保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算，8-异喹啉磺酸不超过0.2%，6-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉均不超过0.10%；其他单个杂质按面积归一化法计算，不超过0.10%，总杂质不超过1.0%；5-异喹啉磺酸按面积归一化法计算，含量不得低于99.0%。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

（1）本发明的高效液相色谱方法，采用的固定相的极性小于流动相的极性，即反相高效液相色谱方法，能够同时检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的含量。

（2）本发明的反相高效液相色谱方法，对于5-异喹啉磺酸及其六种杂质的分离度高，准确性及精密度高，稳定性及重现性好。

（3）本发明的反相高效液相色谱方法，简单易行，便于生产过程对产品5-异喹啉磺酸质量的控制。

附图说明

图1为实施例1中标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图2为实施例1中各杂质定位溶液的HPLC色谱图。

图3为实施例1中供试品溶液的HPLC色谱图。

图4为实施例2标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图5为实施例3标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图6为实施例4标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图7为实施例5标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图8为实施例6标准溶液的5-异喹啉磺酸及其六种杂质的HPLC色谱图。

图9为对比例1标准溶液的HPLC色谱图。

图10为对比例2标准溶液的HPLC色谱图。

图11为对比例3标准溶液的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例和对比例所采用的仪器与试剂均为市售产品。

实施例1

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取5-异喹啉磺酸，用甲醇:水（1:4）（v/v）溶解并稀释制成每1mL中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液；

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

分别量取上述各杂质贮备液1mL，置100mL量瓶中，用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为各杂质定位溶液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

仪器：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：275nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比94:6的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.05mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序表1所示；

表1梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取供试品溶液、各杂质定位溶液和标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示，供试品溶液色谱图中与标准溶液色谱图中保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算。结果如表2、表3及图1所示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法专属性良好。

本实施例标准溶液的HPLC色谱图如图1所示，由图1可以看出，6-异喹啉磺酸、5-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉依次出峰，所示的峰面积的数据表格如表2所示。各色谱峰之间的分离度均大于1.5，说明本发明方法专属性良好。

本实施例各杂质定位溶液的HPLC色谱图如图2所示，自下而上依次为空白溶剂、8-喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉定位溶液的HPLC色谱图。

本实施例供试品溶液的HPLC色谱图如图3所示，由图3可以看出，供试品溶液中含有杂质8-异喹啉磺酸，所示的峰面积的数据表格如表3所示。采用外标法进行计算，8-异喹啉磺酸的含量为0.07%。

表2 色谱峰定位及分离度实验结果

表3 供试品溶液测试结果

（4）定量限与检测限：取各杂质定位溶液，分别逐级稀释至不同浓度，分别精密量取20μL，注入液相色谱仪，至测得的色谱峰响应值约为噪音信号的10倍高和3倍高，即为各杂质的定量限和检测限，检测结果如表4所示。

表4 定量限与检测限结果表

（5）线性：精密称取5-异喹啉磺酸（批号：LH50Q38）0.01835g，置50mL量瓶中，加甲醇:水（1:4）（v/v）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。分别取贮备液适量，用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释并制成各含5-异喹啉磺酸3.67μg/mL、36.70μg/mL、73.40μg/mL、146.80μg/mL、220.20μg/mL、293.60μg/mL、367.00μg/mL的溶液。精密量取上述溶液及定量限溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，以峰面积对浓度作曲线，计算回归方程和相关系数，如表5所示。

表5 线性实验结果表

（6）精密度：平行制备6份供试品溶液进行测定，按外标法以峰面积计算，8-异喹啉磺酸不超过0.2%，6-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉均不超过0.10%；其他单个杂质按面积归一化法计算，不超过0.10%，总杂质不超过1.0%；5-异喹啉磺酸按面积归一化法计算，含量不得低于99.0%。样品中含有已知杂质8-异喹啉磺酸，各杂质、总杂质及主成分含量测定结果的极差均不大于0.02%。精密度实验结果如表6所示，结果表明：精密度实验结果良好。

表6精密度实验结果

（7）溶液稳定性：分别于0、6、12、18、24小时取供试品溶液进行测定，按外标法以峰面积计算，8-异喹啉磺酸不超过0.2%，6-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉均不超过0.10%；其他单个杂质按面积归一化法计算，不超过0.10%，总杂质不超过1.0%；5-异喹啉磺酸按面积归一化法计算，含量不低于99.0%。样品中含有已知杂质8-异喹啉磺酸，各杂质、总杂质及主成分含量测定结果的极差均不大于0.02%。溶液稳定性实验结果如表7所示，结果表明：供试品溶液至少在24小时内稳定。

表7溶液稳定性实验结果

（8）样品测定：按照实施例1的方法测定，对样品LH50Q38、LG60044、LN80N36进行相应检测，检测结果如表8所示，按外标法以峰面积计算，8-异喹啉磺酸不超过0.2%，6-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、1-异喹啉磺酸、异喹啉均不超过0.10%；其他单个杂质按面积归一化法计算，不超过0.10%，总杂质不超过1.0%；5-异喹啉磺酸按面积归一化法计算，含量不低于99.0%。

表8 样品测定结果

实施例2

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：275nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比92:8的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.03mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：1.1mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序表9所示；

表9 梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示，方法耐用性实验结果如表10所示，结果显示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法耐用性良好。

表10 方法耐用性实验结果

实施例3

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（2:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:3）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 150×4.6mm 3.5μm；

检测波长：275nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比94:6的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.02mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：0.9mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL

梯度洗脱程序表11所示；

表11 梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图5所示，方法耐用性实验结果如表12所示，结果显示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法耐用性良好。

表12方法耐用性实验结果

实施例4

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：275nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比92:8的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.05mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：28℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序表13所示；

表13 梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图6所示，方法耐用性实验结果如表14所示，结果显示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法耐用性良好。

表14方法耐用性实验结果

实施例5

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：270nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比92:8的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.05mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：32℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序表15所示；

表15 梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图7所示，方法耐用性实验结果如表16所示，结果显示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法耐用性良好。

表16方法耐用性实验结果

实施例6

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

所述的同时定性和定量检测5-异喹啉磺酸及其六种杂质的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配紫外检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：280nm；

流动相A：磷酸盐缓冲液与甲醇按照体积比92:8的混合溶液；磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢铵配制的，其浓度为0.05mol/L；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

梯度洗脱程序表17所示；

表17梯度洗脱程序

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图8所示，方法耐用性实验结果如表18所示，结果显示，各杂质之间及5-异喹啉磺酸与相邻杂质之间的分离度均大于1.5，表明本方法耐用性良好。

表18方法耐用性实验结果

对比例1

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；三乙胺：天津市大茂化学试剂，分析纯；磷酸：天津市科密欧化学试剂，分析纯。

包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配紫外检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：275nm；

流动相：1.0%三乙胺水溶液（磷酸调pH值至7.0）-甲醇（80:20）；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

此对比例采用等度条件；

（3）测定法：精密量取标准溶液20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，如图9所示，图中显示，异喹啉在此实验条件下未见色谱峰，标准溶液色谱图中8-喹啉磺酸与5-异喹啉磺酸色谱峰重叠在一起，色谱图中仅呈现了5-异喹啉磺酸及其4个杂质峰，表明本方法不适用。

对比例2

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini

检测波长：275nm；

流动相A：0.05mol/L磷酸二氢铵缓冲液；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

按表19进行梯度洗脱；

表19 梯度洗脱程序

测定法：精密量取标准溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，如图10所示，色谱图中仅呈现了5-异喹啉磺酸及其5个杂质峰，有色谱峰重叠现象，表明本方法不适用。

对比例3

所采用的试剂来源：甲醇：北京百灵威科技有限公司，HPLC级；磷酸二氢铵：国药集团化学试剂，分析纯。

包括以下步骤：

（1）溶液配制：

称取各杂质异喹啉、1-异喹啉磺酸、6-异喹啉磺酸、7-异喹啉磺酸、8-异喹啉磺酸、8-喹啉磺酸对照品，分别用甲醇:水（1:1）（v/v）溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.3mg的溶液，作为各杂质贮备液；

称取5-异喹啉磺酸0.030g，置100mL量瓶中，分别量取上述各杂质贮备液1mL加入，再用甲醇:水（1:4）（v/v）稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液；

（2）色谱条件：

色谱仪：岛津液相色谱仪LC-20AT配PDA检测器；

色谱柱：Phenomenex Gemini®5μm C18 110 Å 250×4.6mm；

检测波长：275nm；

流动相A：0.05mol/L磷酸二氢铵缓冲液；

流动相B：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20μL；

按表20进行梯度洗脱；

表20 梯度洗脱程序

测定法：精密量取标准溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，如图11所示，色谱图中5-异喹啉磺酸及其6个杂质峰均能呈现，但5-异喹啉磺酸与其中1个相邻杂质峰之间的分离度仅1.26，未达到完全分离，表明本方法不适用。