一种猪链球菌抗原蛋白的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种猪链球菌抗原蛋白在病原检测和疫苗制备中的应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一种对人畜危害严重的革兰氏阳性细菌，对人类造成了严重的经济损失。猪链球菌主要定植在猪的上呼吸道，几乎所有的猪都携带有猪链球菌，猪感染后的主要临床特征是脑膜炎，心内膜炎，关节炎等。除了猪以外，猪链球菌还可以感染人，目前在一些亚洲国家，猪链球菌已经成为威胁人类健康和公共卫生安全的重要病原菌。例如在越南和泰国，猪链球菌感染已经成为造成人脑膜炎的第一和第二大常见原因。在我国1998年和2005曾爆发过两次规模较大的猪链球菌感染人的案例并且引起了不同人数的死亡。由于猪链球菌的感染率和严重程度不断增加，因此对猪链球菌的防治刻不容缓。但是由于猪链球菌具有多种血清型，并且流行病学和临床特征也在不断变化，因此这些特征为开发高效的猪链球菌疫苗带来了巨大的挑战。

虽然目前市场上已有一些预防猪链球菌的疫苗，但是大部分疫苗主要预防特定菌株或者某些血清型，无法对感染多种血清型的个体产生交叉保护性，因此寻找可能对不同血清型具有交叉保护性的保守型抗原，预防猪链球菌的传播，减少抗生素的耐药风险，是当前疫苗研发和病原菌诊断的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪链球菌高免疫原性抗原蛋白在制备猪链球菌检测试剂盒或亚单位疫苗中的应用，旨在为猪链球菌病原防控提供更多的靶标。

申请人华中农业大学前期结合噬菌体展示文库、免疫共沉淀、二代高通量测序等多种技术手段，建立了一种在细菌全基因组水平上无偏见、高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，该方法已于本专利申请日前申请了另一项中国发明专利，专利申请号为202310239675.0，名称为“一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法”。利用上述方法，申请人从猪链球菌的基因组中筛选出多个免疫原性抗原蛋白。

本发明所涉及的蛋白即为其中一种，该蛋白的名称已被NCBI注释，为ABC转运体基质结合蛋白(ABC transporter substrate-binding protein)，NCBI登录号为WP_012775268，申请人将该蛋白的编码基因命名为7475基因。蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，7475基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

使用PCR方法，从猪链球菌的基因组DNA中克隆上述目的基因，构建重组蛋白的表达质粒，通过原核表达系统表达并纯化重组蛋白。该蛋白存在猪链球菌的核心基因组中，在不同的血清型中基因序列都高度保守。通过用感染了猪链球菌的小鼠血清验证，该蛋白有很高的免疫原性，并且该蛋白能诱导小鼠机体产生高水平的Th1和Th2型免疫反应，利用该蛋白，不仅能对抗体血清进行ELISA检测，而且还能免疫动物产生保护力，抵御猪链球菌对机体的攻击。该蛋白的功能是申请人首次表征并验证，在此之前未有任何文献记载。

因此，该蛋白质可应用于制备猪链球菌检测试剂盒或亚单位疫苗，所述蛋白质的制备方法如下：

1)以猪链球菌的基因组DNA为模板，设计PCR引物扩增编码所述蛋白质的目的基因；

2)将扩增产物克隆至表达载体，获得包含所述目的基因的重组表达质粒；

3)将重组表达质粒转化至感受态细胞进行诱导表达，获得包含所述蛋白质的宿主菌；

4)从宿主菌中分离纯化所述蛋白质。

优选地，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明进一步提供了一种猪链球菌检测试剂盒以及一种猪链球菌亚单位疫苗，所述试剂盒和亚单位疫苗中分别含有所述的蛋白质。

说明书中提供了一个利用所述蛋白对猪链球菌抗体血清进行间接ELISA检测的实施例，当然，本发明的检测应用并不局限于该实施例，根据该蛋白的功能特性，本领域技术人员也能在不经创造性劳动的基础上将该蛋白用于其它检测，例如，利用该蛋白制备抗体并对猪链球菌抗原进行直接ELISA检测，这些不经过创造性劳动的改进或替换方案也都在本发明的保护范围内。

在本发明的一个具体实施例中，将已知浓度的重组蛋白与赛彼科ISA 201佐剂混合并免疫小鼠，猪链球菌SC19菌株攻毒后统计小鼠的发病及死亡情况，结果表明，免疫小鼠的临床症状和死亡率显著降低。

本发明的有益效果是：

本发明为猪链球菌的病原检测和预防提供了另一种高价值候选抗原，在猪链球菌的亚单位疫苗和诊断试剂研发方面有很高的应用前景。

附图说明

图1：7475基因的PCR扩增条带。

图2：7475蛋白表达质粒酶切鉴定的电泳结果。

图3：SDS-PAGE以及Western-blot验证表达的7475蛋白。

图4：感染猪链球菌的小鼠阳性血清间接ELISA验证7475蛋白。

图5：ELISA检测免疫7475蛋白的小鼠产生特异性IgG抗体。

图6：ELISA检测免疫7475蛋白的小鼠产生特异性IgG1和IgG2a抗体。

图7：通过攻毒实验验证7475蛋白对小鼠的保护作用。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

遗传资源来源说明：猪链球菌SC19株是申请人华中农业大学构建的一株猪链球菌2型血清型弱毒株，该毒株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCNO：M 2016584，且已在CN 108410784A的专利文献中公开。

实施例1：构建7475蛋白的表达质粒并纯化蛋白

1.构建7475蛋白的表达质粒

1)PCR扩增目的基因

首先运用SignalP-5.0和TMHMM2.0对该蛋白的信号肽和跨膜区域进行预测，经过预测后发现，该蛋白存在信号肽区域但是不存在跨膜区，将蛋白N端的信号肽区域切割后设计扩增该蛋白基因的引物，引物序列包括保护性碱基、酶切位点以及与模板结合的核苷酸序列，酶切位点选择BamHⅠ和XhoⅠ，将设计好的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以实验室已经提取好的菌株SC19的基因组DNA为模板，通过PCR扩增7475的基因片段，扩增产物的长度为1119bp，扩增结果如图1所示，目的条带清晰且明显，条带大小符合预期。基因扩增后通过琼脂糖凝胶电泳，采用OMEGA凝胶回收试剂盒回收该片段的DNA并测量DNA浓度，用QuickCut

7475基因片段的PCR扩增体系：

引物序列(下划线的为酶切位点)：

7475F：5’-CGCGGATCCggtaatgtttcgacaacca-3’(SEQ ID NO.3)

7475R：5’-CCGCTCGAGgtcaatagagatagtatctaca-3’(SEQ ID NO.4)

7475基因片段的PCR扩增条件：

95℃5min，95℃15sec，60℃15sec，72℃40sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

7475基因片段的DNA酶切体系：

反应条件：

将酶切产物放在37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。

2)构建7475的表达载体

使用QuickCut

pET32a质粒酶切体系如下：

反应条件：

酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用。

表达质粒的连接体系：

反应条件：

将上述混合物置于PCR仪16℃过夜孵育。

7475质粒酶切鉴定体系如下：

反应条件：

酶切产物置于37℃恒温水浴锅孵育1h，经琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。

2.蛋白的表达及纯化：

将测序正确的质粒用移液枪吸取10ng加入到表达感受态BL21(DE3)中，置于冰上冰浴30分钟，42℃热激45秒，热激后将感受态置于冰上，再次冰浴2分钟，在感受态中加入500μl的LB液体培养基，放入37℃摇床180rpm孵育45分钟，孵育后5000rpm离心3分钟，弃去500μl上清，剩余100μl上清重悬沉淀后将菌液涂至含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的固体LB平板上，37℃恒温培养箱培养12小时，挑取单菌落至含有10mL培养基的细菌瓶中，并添加氨苄青霉素和氯霉素并使其终浓度为100μg/ml和34μg/mL，约震荡培养8小时，按照1：100转接至1L的LB液体培养基中，并放入37℃摇床200rpm摇菌至OD值约为0.6，将摇床转速调至170rpm，并加入1ml的IPTG使其终浓度为1mmol/L，诱导表达5小时。5小时后将培养的细菌倒入离心瓶中，6000rpm离心10min倒掉上清并收集沉淀，用PBS将细胞沉淀洗涤两遍。200ml的结合缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，10mM咪唑)重悬细菌沉淀，高压破碎仪将蛋白低温破碎约半个小时，待液体澄清后收集破碎后的蛋白，30000g离心20min收集蛋白上清，并用0.22μm的滤器过滤上清，将过滤好的蛋白上清通过蠕动泵用His标签的蛋白纯化预装柱纯化蛋白。待蛋白液流尽之后更换洗涤缓冲液(300mMNaCl，20mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，20mM咪唑)洗涤杂蛋白，约洗涤30分钟后将缓冲液更换为洗脱缓冲液(300mM NaCl，20mM Tris-HCl，浓盐酸调至pH为8.0，400mM咪唑)洗脱与His柱结合的目的蛋白。将洗脱后的目的蛋白用10kDa的超滤管对蛋白进行超滤浓缩，先用超纯水将超滤管洗涤两遍，将蛋白加至超滤管中，4℃4000rpm离心，离心时间根据蛋白的量而定。每次离心后，加入一定体积的GE buffer(20mM Tris，100mM NaCl，用浓盐酸调至pH为8.0)，置换出蛋白中高浓度的盐和咪唑。大约离心置换4-5次后，离心后的蛋白体积约为置换前体积的十分之一，从超滤管中吸出蛋白至1.5mL离心管中混匀后将蛋白分装至PCR小管中，每管50μL，分装后放至-80℃冰箱保存备用。

3.SDS PAGE和Western blot验证纯化的蛋白：

将纯化后的蛋白取出10μL加入含有70μL PBS的1.5ml EP管中，再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，涡旋振荡混匀后100℃煮10min。取出两块已制备好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，一块用于SDS PAGE验证所纯化的蛋白，另一块用于Western blot验证。先80V电压下跑完浓缩胶后切换电压至120V跑完分离胶。蛋白胶跑完之后一块直接放入含有2.5g/L的考马斯亮蓝染液中染色2h，之后转至脱色液(10％冰醋酸，5％乙醇)中进行脱色。而另一块蛋白胶则用于Western blot验证。

切下蛋白凝胶的胶块，在65V的电压下转60分钟将蛋白转至PVDF膜上。TBST洗膜3遍，每次间隔5min，5％脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜3遍，每次间隔5min，鼠抗His-Tag的单克隆抗体作为一抗室温孵育2h(公司：Abclonal货号：AE003，抗体用TBST以1：4000倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗孵育45min(公司：Abbkine货号：A21010，用TBST以1：8000倍稀释)，TBST洗膜5遍，每次间隔5min，ECL发光显色液A:B等体积混合后避光使用化学发光仪显色(公司：Biosharp货号：BL520A)，所纯化的蛋白结果如图3所示，结果发现所纯化的7475蛋白约60kDa，与预测结果一致。

4.间接ELISA验证7475蛋白：

将7475蛋白包被ELISA平板并放到4℃过夜，(蛋白用0.05M碳酸盐缓冲液稀释，pH9.6)，每孔100ng蛋白。次日弃去包被液，用PBST洗涤5遍，用PBST配制3％的BSA溶液，每孔加入200μL并放入37℃恒温培养箱中封闭1小时。弃去封闭液，PBST将平板洗涤5遍，第一孔加入200μL用PBST稀释好的血清(1：500)，其余孔加上100μL的PBST，开始按照2倍比依次往后稀释，然后将平板置于37℃恒温培养箱中孵育1小时。弃去血清，PBST洗涤5遍，每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠的二抗(1：8000稀释，公司：Abbkine，货号：A21010)37℃孵育50min。弃去二抗，PBST洗涤5遍，每孔加入100μL TMB显色液，将平板置于暗处避光，室温显色至不变色后每孔加100μL2M的浓硫酸终止显色。最后通过酶标仪测定OD450处的吸光度。结果如图4所示，与阴性的小鼠血清相比，感染了猪链球菌的小鼠阳性血清与7475蛋白有很高的反应性，并且经过T检验分析发现两者反应性差异显著。

实施例2：动物实验验证7475蛋白对小鼠是否具有保护效果

1.动物免疫实验

从华中农业大学动物实验中心购买10只六周龄BALB/c雌鼠并随机分成两组，每组5只，一组为免疫蛋白的实验组，另外一组为PBS对照组。实验组的每只小鼠免疫30μg纯化的蛋白，用已灭菌的PBS将蛋白稀释至100μL并加入100μL的赛彼科ISA 201佐剂，然后运用乳化仪对蛋白进行乳化，将乳化好的蛋白腹腔免疫小鼠，每只小鼠200μL。对照组则将PBS与佐剂等体积混合并乳化，每只小鼠腹腔注射200μL。小鼠一共免疫两次，每次间隔14天。在第二次免疫的前一天对小鼠进行尾静脉采血，二免后10天对小鼠进行二次采血。将采集的小鼠血清放置在37℃的恒温培养箱中静置2小时，2小时后8000rpm离心5分钟，用移液枪吸取上清至新的1.5ml EP管中，再次8000rpm离心5分钟，吸取上清，然后将血清分装至PCR小管中，并保存于-80℃备用。

2.间接ELISA检测小鼠的血清抗体

在第二次采血后，检测小鼠的血清抗体。将纯化好的蛋白用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释并按照每孔100ng/100μL包被酶标板，放置4℃过夜。次日弃去包被液后用PBST洗涤5次，每孔加200μL 3％的BSA于37℃封闭1h。封闭结束后弃去封闭液，PBST洗涤5遍后除第一孔加入200μL的PBST，其余孔加上100μL的PBST，将蛋白第二次免疫后的血清从第一个孔以1：10000开始按照2倍比依次往后稀释，37℃孵育1h。弃去血清，PBST洗涤5遍，每孔加100μL HRP标记的羊抗鼠的二抗(公司：Abbkine，货号：A21010)37℃孵育50min。弃去二抗，PBST洗涤5遍，每孔加入100μL TMB显色液，将平板置于暗处避光，室温显色至不变色后每孔加100μL 2M的浓硫酸终止显色。最后通过酶标仪测定OD450处的吸光度。结果如图5所示，将血清稀释10000倍，测定OD450处的吸光度，免疫蛋白的小鼠抗体水平明显高于对照组的小鼠，T检验分析两者差异性显著。

为了对IgG亚型进行分析，将7475蛋白包被ELISA平板，通过间接ELISA检测IgG1和IgG2a的抗体滴度。7475蛋白第二次免疫小鼠的血清为一抗，从第一个孔以1：10000开始按照2倍比依次往后稀释，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG1和IgG2a(1：3,000稀释)，其余步骤同上。结果如图6所示，将血清稀释10000倍，与对照组相比，7475蛋白与佐剂混合免疫小鼠，小鼠机体产生了高水平的IgG1和IgG2a抗体，并且抗体水平显著高于对照组小鼠,通过T检验分析发现与对照组相比，实验组与对照组之间差异性显著。IgG1抗体与Th2型反应相关，IgG2a抗体与Th1型反应相关，证明了7475蛋白免疫小鼠，可以诱导小鼠的Th1和Th2型免疫反应。

3.动物攻毒实验

在对小鼠第二次采血后，通过动物攻毒实验来验证筛选的蛋白对动物是否具有保护效果。挑取新鲜的SC19单菌落至10ml含有10％的新生牛血清的TSB培养基中培养过夜，次日按照1：100转接至50ml含有10％的新生牛血清的TSB培养基中培养9小时，将细菌倒入离心管中8000g离心5min，弃去上清，加入10ml PBS洗涤两遍。最后将细菌沉淀用2ml的PBS重悬，并且按照10倍比稀释法对细菌进行稀释，稀释后将细菌涂至含有10％新生牛血清的TSA平板上，37℃恒温培养箱培养过夜，次日通过平板计数法对细菌进行计数。计数后用PBS将菌液浓度调整至3.0×10