评估阳光照射的表观遗传方法

技术领域

本发明涉及一种用于获得可用于确定阳光照射对个体皮肤的作用的信息的表观遗传方法。

背景技术

DNA甲基化是基因表达的表观遗传决定因子。CpG甲基化的模式是可遗传的、组织特异性的，并且与基因表达相关。甲基化(尤其是位于基因启动子中时)的后果通常是基因沉默的。DNA甲基化还与其他细胞过程相关，包括胚胎发育、染色质结构、基因组印记、女性的体细胞X染色体灭活、外来DNA转录和转座的抑制以及DNA复制的时机。当基因高度甲基化时，它不太可能被表达。因此，识别基因组中含有5-meC的位点对于理解细胞类型特异性的基因表达程序以及基因表达谱在正常发育、老化和疾病(如癌症)过程中如何改变是重要的。DNA甲基化谱的定位对于理解人类癌症中的多样化的生物学过程(例如印记基因的调节、X染色体的灭活和肿瘤抑制基因的沉默)是重要的。

阳光中存在的紫外(UV)辐射是一种环境的人类致癌物。来自天然阳光和治疗性人工灯具的UV的毒性效应是人类健康的主要问题。UV辐射对正常人体皮肤的主要急性作用包括晒伤炎症红斑、DNA损伤、晒黑以及局部或全身性免疫抑制。

能够评估阳光照射对人体皮肤的表观遗传影响以根据个体的表观遗传特征评估损害或健康状况并利用该信息来提供建议和干预将是一个非常有价值的进展。

各种研究调查了与阳光照射相关的皮肤的表观遗传变化(即DNA甲基化)。Raddatz等(Epigenetics&Chromatin 2013，6：36)发现，老化表皮甲基化组特征在于相当大的稳定性，并且不显示任何整体甲基化损失。但是，可以观察到局部的年龄相关的甲基化变化，并且在弱或准备的启动子(poised promoter)和在增强子区域富集，因此表明表观遗传机制与皮肤老化的功能相关性。Gronniger等(PLoS Genetics 6(5)：e1000971)发现，老化和阳光照射与人类表皮和真皮样品的DNA甲基化模式中相对较小但显著的变化相关。

然而，没有一项研究能开发评估阳光照射对个体皮肤的作用的表观遗传模型。因此，仍然需要提供表观遗传方法以评估阳光照射对人体皮肤的影响，评估损害或健康，并潜在地利用该信息提供针对个体的表观遗传阳光照射谱个性化的建议和干预。

发明内容

本发明人惊讶地发现一组特定的CpG位点，其在确定阳光照射对个体的影响方面具有增强的效力，并且可用于评估阳光照射对人类皮肤的作用的表观遗传方法中。

因此，本发明提供了一种获得可用于确定阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞获得基因组DNA，其中皮肤细胞包括表皮皮肤细胞；和

(b)观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150、＞175个，最优选所有185个位点。

优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

更优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

更优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

更优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

更优选地，步骤(b)包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

cg00772091 cg06066180 cg19413397 cg16777510 cg23660755。优选地，观察所有5个位点。优选地，所观察的至少两个位点中的至少一个选自这一5个位点的子集。

本发明人进一步发现，上述CpG位点的特定子集在确定长期阳光照射对个体的作用方面特别有效。

因此，该方法优选地提供了一种获得可用于确定长期阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞获得基因组DNA，其中皮肤细胞包括表皮皮肤细胞；和

(b)观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150个，最优选所有151个位点。

该方法更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85个，最优选所有90个位点。

该方法甚至更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75个，最优选所有76个位点。

该方法还更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50个，最优选所有54个位点。

该方法最优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20个，最优选所有23个位点。

本发明人进一步发现，上述CpG位点的特定子集在确定急性阳光照射对个体的作用方面特别有效。

因此，本发明还优选地提供了一种获得可用于确定急性阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞获得基因组DNA，其中皮肤细胞包括表皮皮肤细胞；和

(b)观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150个，最优选所有161个位点。

该方法更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85、＞90、＞100、＞110个，最优选所有116个位点。

该方法甚至更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85、＞90个，最优选所有98个位点。

该方法还更优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞60、＞70个，最优选所有78个位点。

该方法最优选包括观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自：

从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞40个，最优选所有44个位点。

附图说明

图1显示了按处理分组的185个探针中每一个的绝对M-值在5个月内的平均变化的箱形图。该图单独地显示了处理组和未处理组中185个探针的每一个的M值量度的变化(样品上相对于基线的M值的平均绝对值变化)。单个探针的值显示为点。抖动应用于造成水平散布的单个点。经处理的样品显示在左侧，未处理的样品显示在右侧。箱形图中间线代表该185个的中位值，连接两个组的线连接平均值。

图2显示了置换分析结果。该图显示了10000次置换以计算随机采样的185个探针的组的M值量度的平均变化的结果。选择的185个探针的点估计值显示为垂直虚线。相对于基线的平均绝对值变化的平均差异与置换的(零)分布显著不同(p＝0.0196)。

图3显示了按处理分组(SPF vs.无SPF)的185个探针中每一个在1周内的绝对M值的平均变化的箱形图。该图分别显示了“UV vs.对照”变化(右侧箱形图)和“UV+SPF vs.对照”变化(左侧箱形图)中185个探针的每一个的M值量度的变化(样品上相对于基线的M值的平均绝对值变化)。单个探针的值显示为点。抖动应用于造成水平散布的单个点。箱形图中间线代表该185个的中位值，连接两个组的线连接平均值。

具体实施方式

阳光中存在的紫外(UV)辐射是环境人类致癌物。来自天然阳光和治疗性人工灯具的UV的毒性效应是人类健康的主要问题。UV辐射对正常人体皮肤的主要急性效应包括晒伤、炎症、红斑、DNA损伤、晒黑以及局部或全身性免疫抑制。恶性黑色素瘤可由UVA辐射的间接DNA损伤引起。另外，其他波长的太阳光也与皮肤老化关联(例如蓝光和红外光)。本文使用的术语“阳光照射”、“暴露”、“暴露于阳光”、“UV暴露”等旨在指暴露于天然阳光或人工照射，例如日光浴床和太阳灯。因此，该术语指暴露于与之相关的有害辐射，包括但不限于UVA和UVB辐射。

阳光照射可在不同的时间范围内发生。本文中使用的术语“长期阳光照射”指1至24个月期间的照射，特别是约5个月。本文中使用的术语“急性阳光照射”指1至30天期间的照射，特别是约一周。

在本发明的上下文中，防晒产品指能够防止或减少到达皮肤的UV射线的局部应用的皮肤处理。防晒产品可以通过如遮光剂、防晒霜、日霜或防晒露的术语，以及膳食或补充剂如β-胡萝卜素的防晒来指称。它们可以是洗液、喷雾、凝胶或其他局部产品以及膳食补充剂或食品的形式。它们可以通过吸收或反射来自太阳的部分或全部紫外辐射(尤其是UVA和/或UVB)发挥作用，因此提供对阳光照射的保护。防晒产品通常具有SPF等级(防晒系数)，这是对到达皮肤的产生晒伤的UV射线的分数的量度。

如本文所用，CpG位点/座位指Illumina CpG位点数据库中发现的唯一标识符(如Technical Note：Epigenetics，CpG Loci Identification ILLUMINA Inc.2010，https：//www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_cpg_loci_identification.pdf中所述的)。因此，这些CpG位点标识符提供了一致且确定的CpG位点数据库以确保甲基化数据报告中的一致性。

进行了研究以鉴定与阳光照射潜在相关的CpG位点。

来自涉及24名中国女性和24名欧洲女性参与者(其中24名年轻女性和24名老年女性登记入组)的单中心、横截面活组织检查研究的数据用于鉴定具有评估阳光照射的潜在价值的CpG位点。从每个受试者的两个不同区域收集皮肤活组织检查样品：来自皮肤的阳光照射区域的样品；和来自皮肤的阳光保护区域的样品。指定为阳光照射的皮肤区域位于下外臂上，和指定为阳光保护的区域位于上内臂上，通常位于肘部和腋窝区域之间的中间位置。

从欧洲年轻受试者的皮肤暴露区域收集的样品的DNA甲基化数据与来自相同的欧洲年轻受试者的保护区域的数据进行比较。在p值过滤和多重检验校正(＜0.05FDR和5％Δβ)后，发现4450个CpG位点在阳光照射样品中相对于阳光保护样品显著不同，且因此可能与受阳光照射相关。

从欧洲年轻受试者的暴露皮肤区域收集的样品的甲基化数据与来自欧洲老年受试者的暴露皮肤区域的数据进行比较。在p值过滤和多重检验校正(＜0.05错误发现率(FDR)和5％Δβ)后，发现6972个CpG位点在老年暴露样品中相对于年轻暴露样品显著不同，且因此可能与长期时间阳光暴露相关。

据发现这两个列表之间(即4450个和6972个CpG位点之间)有455个CpG位点的重叠，且在这455个CpG位点中，399个处于同一方向，即

-发现年轻暴露样品的CpG位点与年轻保护样品的相同CpG位点相比是高甲基化的(即，高甲基化是由暴露引起的)

和

-发现老年暴露样品的CpG位点与来自年轻暴露样品的CpG位点相比是高甲基化的(即高甲基化是由年龄引起的)

或者，相反：

-发现年轻暴露样品的CpG位点与年轻保护样品的相同CpG位点相比是低甲基化的(即低甲基化是由暴露引起的)

和

-发现老年暴露样品的CpG位点与年轻暴露样品的CpG位点相比是低甲基化的(即低甲基化是由年龄引起的)。

从以上单中心、横截面活组织检查研究中发现的这399个CpG位点随后在公众可得的数据集中重新评估(Vandiver A.R.等：Age and sun exposure-related widespreadgenomic blocks of hypomethylation in nonmalignant skin.Genome Biology(2015)16：80，Gene Expression Omnibus登录号：GSE51954)。Vandiver数据集包含来自20名高加索受试者的表皮样品(N＝38)。在局部麻醉的情况下，从阳光照射区域(外前臂或侧内眦赘皮)和阳光保护区域(上内臂)收集成对的穿孔活组织检查样品，直径为4mm。

在该研究鉴定的399个CpG位点中，将年轻和老年暴露位点相比发现198个CpG位点显著不同(399个测试的FDR，p＜0.05，Δβ大于5％)，且在来自Vandiver数据集的年轻样品中暴露的与保护的(单独测试)相比也是显著的(399个测试的FDR，p＜0.05，Δβ大于5％)。

此外，在Vandiver数据集和上述单中心、横截面活组织检查研究两者中，发现这些CpG位点中的全部198个以相同方向变化(在较老的光暴露样品中，135个为低甲基化的和63个为高甲基化的)。

因此，这198个CpG位点继续推进，并评估其测量一般地阳光照射和特别地长期和急性阳光照射的能力。

进行临床研究以探索长期阳光照射的表观遗传效应以及防晒产品对长期阳光照射的保护性作用。

本研究的一个目的是评估以上鉴定的198个CpG位点测量长期阳光照射的作用的能力。

在该研究中，在研究开始时从两个前臂收集皮肤活组织检查样品。随后，该研究进行了5个夏季-秋季月份，在此期间，将防晒产品(Pond′s Age Miracle Firm and Lift DayCream，防晒系数30)应用于前臂之一(“处理的”)而不应用于另一前臂(“未处理的”)。在5个月结束时，从两个前臂收集皮肤活组织检查样品以评估长期阳光照射对皮肤的作用且也评估在这5个月内使用和不使用防晒产品的效果。

该研究是单中心、前臂分开的研究，42名受试者完成。受试者为女性，年龄22-58岁，Fitzpatrick皮肤II-III型，总体健康状况良好，不经常使用防晒霜(在臂上)且常规外出和暴露于阳光(每周至少10小时)。

受试者使用其典型的面部和身体清洁和护理产品和日常活动，并且不改变其产品和日常活动直到研究完成。

受试者每天在家中进行防晒产品的施用。受试者被指示每天至少两次应用产品(受试者可以在早上、出门前、在户外时每2小时或晚上应用)于随机选择的(右或左)前臂(整个研究过程中保持一致)。受试者允许一天根据需要或在外出处于阳光下时应用多次。受试者在5个月的时间内记录了他们的阳光照射和防晒产品的使用的日志。

在基线和第5个月时，由许可的经认证的皮肤病学家收集3mm穿孔活组织检查样品(每个时间点来自每个伸肌前臂的1个)。得到以下活组织检查：

-时间0-自由生活方式前臂(未处理的)

-时间0-其上也应用测试产品的前臂(处理的)

-时间5个月-5个月之后的自由生活方式前臂(未处理的)

-时间5个月-在5个月内其上应用测试产品的前臂(处理的)。

基线和第5个月的活组织检查部位在前臂内随机分布，位于上部(靠近手肘)或下部(靠近手腕)位置。两个活组织检查部位间隔约4-5cm。

总共收集了168个活组织检查样品(42名受试者x每名受试者2个前臂x每条前臂2个时间点)。在Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip阵列上对活组织检查样品分析阳光照射引起的表观遗传改变。

表观遗传分析

一名受试者丢失了四个取样点中的一个(由于低DNA量)，且因此该受试者的所有观察结果被排除在分析之外，导致41名个体可供进一步分析(总共164个活组织检查样品)。

在被推进和在阳光照射和防晒的背景下评估的以上确定的198个CpG位点中，185个位点存在于所使用的MethylationEPICBeadChip阵列上。

样品进行过滤以去除包含已知多态性的探针(23,356个探针)、交叉杂交的探针(42,529个探针)和通过McCartney等(Genomics Data，Volume 9，September 2016，22-24而)鉴定的非CpG探针(1,652个探针)。X和Y染色体上的那些探针(14,404个探针)以及其中超过25％的样品具有与阴性对照探针无法区分的信号的那些探针(7,094个探针)也被移除。因此，83,801个探针从最初的866,836个中排除，留下782,437个探针。上述185个位点/探针没有一个因该过滤而损失。使用ComBat校正所得的数据集以控制数据中的批量效应(与技术因素“Sentrix条形码”相关)。

该研究的总体目标是确定处理组和未处理组在基线和研究结束之间差异甲基化的位点。之后，计算处理组和未处理组的前与后M值的差异(配对的Δ-M值)。然后，使用普通最小二乘将每个探针的Δ-M量度作为基线M值(协变量)以及受试者和处理分组(固定效应)的函数进行建模。然后通过确定Δ-M(不同于0)的最小二乘均数(或估计的边际均值)来评估目标特定对比(specific contrast)；这些对比是用于

1.处理组，

2.未处理组，以及

3.处理组和未处理组之间的差异。

进行了185个目标CpG位点的广泛分析。进行随机抽样和置换测试以确定这185个站点的性能。

结果

对于每一个探针和处理分组，M值的平均绝对值变化(相对于基线)在样品上计算。然后确定该量度在该组探针上是否在未处理样品和处理样品之间发生变化。

为了使185个探针中每一个的变化(在处理分组内的样品上平均)可视化，单独为未处理组和处理组生成箱形图(图1)。箱形图中的每一点显示了对于给定探针和处理分组的平均M值量度(样品上相对于基线的M值平均绝对值变化)。

为了测试未处理样品和处理样品之间M值量度的变化，首先计算组之间185个探针的M值量度变化的点估计值。该估计值的显著性使用置换检验进行了测试，其中对随机选择的185探针的组进行了该程序的10,000次置换以构建M值量度变化的零分布。然后测试我们的点估计值是否与这一零分布显著不同(图2)。

因此，置换检验显示观察值为-0.0073，表明未处理组相对于处理组，185个探针相对于基线的平均绝对值变化的平均差异高0.0073。这一相对于基线的平均绝对值变化的平均差异与置换的(零)分布显著不同(p＜0.05)。

尽管单个探针显示了组之间M值量度变化的混合模式(具有负变化和正变化)，但当在185个探针上平均时，发现观察的平均变化与对于随机选择的探针观察的变化显著不同。

明显的是，在该具体选择(预定义)的探针组中观察到了甲基化变化。此外，表观遗传变化在仅5个月内被观察到是一个新的见解-通常这些变化与多年的暴露相关。

因此很明显，这185个CpG位点，无论是单独的还是组合的，能够测量与阳光照射相关的或由阳光照射引起的变化，且因此被用于本发明第一方面的方法中，其中提供了一种获取可用于确定阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞获得基因组DNA，其中皮肤细胞包括表皮皮肤细胞；和

(b)观察基因组DNA中至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，其选自由这185个位点组成的组，从而获得可用于确定阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150、＞175个，最优选所有185个位点。

这些位点和以下所列位点的更优选选择也可用于获取可用于评估与阳光照射相关或由阳光照射引起的变化的信息的试剂盒。

因此，本发明还提供一种试剂盒，其包括对生物样品中的至少两个基因组DNA序列特异性的引物或探针，其中所述基因组DNA序列包含选自仅由这185个位点组成的组的基因组DNA中的CpG位点；

和

用于以下的试剂：

基因组DNA聚合过程；

基因组DNA杂交过程；

基因组DNA直接测序过程；

基因组DNA亚硫酸氢盐转化过程；或者

基因组DNA焦磷酸测序过程。

优选地，试剂盒包括对＞5个基因组DNA序列特异性的引物或探针，更优选＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150个，最优选全部185个。

试剂盒可包括对生物样品中至少两个基因组DNA序列特异性的引物或探针，其中基因组DNA序列包含选自由以下优选子集中列出的任何位点组成的组的基因组DNA中的CpG位点。

表1显示了185个位点，其中注释是基于Human Genome Build HG19，且列是：

-CpG位点/座位ID

-染色体

-探测起始位置

-最接近基因的名称

-CpG位点随时间的预期变化(其中“+”表示高甲基化，“-”表示低甲基化)

-是否发现CpG位点沿预期方向发生变化(是/否)

-是否发现CpG位点沿预期方向发生变化且未处理组中显示比处理组更大的变化(是/否)

-未处理的ΔM(未处理组的M值的变化)

-处理的ΔM(处理组的M值的变化)

-未处理和处理组之间ΔM的差异

-未处理组的变化的p-值

-未处理组vs.处理组的变化的p值

从表1中可以看出，在最初的185个位点中，151个位点响应于阳光照射而发生了预期方向的改变(高或低甲基化)。表2提供了这些位点。

表2

因此，这151个位点具有更高的性能，且是185个CpG位点的优选子集。

因此，本发明提供了一种获得可用于确定长期阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞获得基因组DNA；和

(b)观察基因组DNA中选自由这151个位点组成的组的至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，从而获得可用于确定长期阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150个，最优选所有151个位点。

位点全部具有对于5个月暴露期内未处理组的变化的显著性计算的p值，且因此151个位点全部可对于观察的变化的显著性进行评估。

表3列出了p值最多0.2的90个位点。这些位点是更优选的子集。

优选地，使用该90个位点子集中的至少一个位点，更优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85个，最优选所有90个位点。

表3

表4列出了p值最多为0.1的76个位点。这些位点是甚至更优选的子集。

使用该子集的优选＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75个，最优选所有76个位点。

表4

表5列出了p值最多为0.05的54个位点。这些位点是还更优选的子集。

观察该子集的优选＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50个，最优选所有54个位点。

表5

表6列出了p值最多0.01的23个位点。这些位点是最优选的子集。

使用该子集的优选＞5、＞10、＞15、＞20个，最优选所有23个位点。

表6

进行了一项研究以调查急性阳光照射的表观遗传效应。

在该研究中，使用了体外人体皮肤(外科手术过程中丢弃的腹部或胸部皮肤)。

本研究的两个目的是：

-观察皮肤样品中是否可检测到因急性UV暴露而导致的表观遗传改变，和

-允许评估以上鉴定的198个CpG位点测量急性阳光照射的作用的能力。

采用了三种不同的处理：

1)对照(无UV暴露，无SPF)

-在第0天，从来自3个不同供体的离体皮肤样品收集15个3毫米穿孔活组织检查样品。

-将活组织检查样品置入培养中(每个培养插入物5个活组织检查样品)以确保实验期间的存活。

-活组织检查样品培养物维持另外7天。

-在第7天，活组织检查样品被快速冷冻并储存在-80℃下。

-在快速冷冻的一周内分离基因组DNA(见下文)。

-DNA甲基化变化如以下详述的确定。

2)仅UV(UV暴露，无SPF)

-在第0天(星期二)，对来自3个不同供体的离体皮肤样品进行UV辐射(见下文)。在照射后从皮肤样品收集15个3mm的穿孔活组织检查样品，并将其置于培养中(每个培养插入物5个活组织检查样品)以确保实验期间的存活。

-活组织检查样品培养物维持另外7天，并每天(从星期三开始，周末除外)接受UV照射(见下文)。

-在第7天最后一次照射后，活组织检查样品被快速冷冻并储存在-80℃下。

-在快速冷冻的一周内分离基因组DNA(见下文)。

-DNA甲基化的变化如下详述的确定。

3)UV和SPF(UV暴露，应用SPF)

-在第0天(星期二)，将50uL含SPF的产品(Pond′s Age Miracle Firm and LiftDay Cream，防晒系数30)应用于来自两个不同供体的3.8cm

-活组织检查样品培养物维持另外7天，且每天(从星期三开始，周末除外)进行产品应用(2uL产品)和UV照射(见下文)。

-在第7天最后一次应用/照射后，活组织检查样品被快速冷冻并储存在-80℃下。

-在快速冷冻的一周内分离基因组DNA(见下文)。

-DNA甲基化变化如下详述的确定。

UV照射方法

具有CGA-320和UG-11滤波器以阻断UVC和可见光的Newport太阳能辐射器[外壳：67005/PSU：69911(160-600瓦)/灯：6259(300W Xe)]用于以等于1MED(最小红斑剂量)的ssUV剂量对离体皮肤或培养的活组织检查样品进行处理。该1MED剂量等同于4J/cm

基因组DNA的分离方法

从-80℃冷冻箱中取出活组织检查样品。使用手术剪从活组织检查样品移除脂肪组织。剩余的皮肤活组织检查样品进行消化并按照来自QiaAMP DNA试剂盒(Qiagen)的方案提取基因组DNA。gDNA重悬浮于1x Tris-EDTA(1x TE)中，并在-20℃下储存直至使用。

甲基化变化的确定方法

分离的基因组DNA被发送至Q Squared Solutions Expression Analysis LLC以使用其Illumina Infinium DNA Methylation Service和Illumina MethylationEPICBeadChips进行甲基化分析。甲基化分析包括：

-进行基因组DNA的亚硫酸氢盐转化

-使用全基因组技术扩增基因组DNA

-将扩增的DNA与Infinium BeadChip杂交

-用标记的等位基因特异性的双脱氧核苷酸进行单碱基延伸反应

-BeadChip的染色和扫描

-进行DNA甲基化分析并提供结果。

表观遗传分析

在因此被推进和在急性阳光照射和防晒的背景下评估的上述确定的198个CpG位点中，185个位点存在于所使用的MethylationEPICBeadChip阵列上。

样品进行过滤以去除包含已知多态性的探针(23,399个探针)、交叉杂交的探针(42,557个探针)和通过McCartney等2016鉴定的非CpG探针(1,651个探针)。X和Y染色体上的那些探针以及其中超过25％的样品具有与阴性对照探针无法区分的信号的那些探针也被移除(3,682个探针)。在总共866,836个探针中，80,683个探针被从原始数据排除，剩下786,153个探针。上述185个位点/探针中没有一个因这一过滤而丢失。

表观遗传分析的目的是：

-确定185个CpG位点上因急性UV暴露而导致的甲基化的程度。这是通过将对照样品(无UV暴露，无SPF)中的DNAm与仅经受UV的那些(UV暴露，无SPF)进行比较而实现。这被称为“UV vs.对照”。

-目的还在于通过将对照样品(无UV暴露，无SPF)中的DNAm与经受UV但应用SPF的那些(UV暴露，应用SPF)进行比较确定相同的185个CpG位点上的甲基化是否因使用SPF产品以提供针对急性UV暴露的保护而有所不同。这被称为“UV+SPF vs.对照”。

-然后“UV vs.对照”的结果与“UV+SPF vs.对照”进行比较

结果

对于每个探针和样品类型，M值的平均绝对值变化(相对于基线)在样品上计算。然后确定该变化在探针组上“UV vs.对照”与“UV+SPF vs.对照”相比是否不同。

为了使185个探针中每一个的变化(在处理组内的样品上取平均)可视化，分别生成了“UV vs.对照”变化(右侧箱形图)和“UV+SPF vs.对照”变化(左侧箱形图)的箱形图(图3)。箱形图中的每个点显示了给定探针和处理分组的平均M值量度(样品上相对于基线的M值平均绝对值变化)。这些变化的单向分析显示P＝0.0008的显著性(T-检验)。因此，从图3中可以看出，由于SPF的使用，表观遗传变化相对于非SPF样品减少。

因此，很明显，这185个CpG位点，无论是单独的还是组合的，能够测量与急性阳光照射相关的或由其引起的表观遗传变化。另外，这些CpG位点能够测量使用防晒产品防止急性阳光照射的表观遗传效应的有益效果。

明显的是，在该特别选择(预定义)的探针组中观察到甲基化变化。此外，表观遗传变化仅在一周内被观察到是一个新的见解-通常这种变化与多年的暴露相关。

表7显示了185个位点，其中注释是基于Human Genome Build HG19，且列为：

-CpG位点/座位ID

-染色体

-探针起始位置

-最接近基因名称

-CpG位点随时间的预期变化(其中“+”表示高甲基化，-”表示低甲基化)

-是否发现CpG位点沿预期方向变化(是/否)

-是否发现CpG位点沿预期方向变化且未处理样品与处理样品相比显示更大的变化(是/否)

-未处理的ΔM(未处理样品的M值变化)

-处理的ΔM(处理样品的M值变化)

-未处理样品和处理样品之间的ΔM差异

-未处理样品的变化的p-值

-未处理样品vs.处理样品的变化的p-值

从表7可以看出，最初的185个位点中161个位点沿预期方向改变(高或低甲基化)。这些位点提供于表8中。

表8

因此，这161个位点具有更好的性能，且是185个CpG位点中用于急性太阳暴露的表观遗传评估的优选子集。

因此，本发明提供了一种获得可用于确定急性阳光照射对个体皮肤的作用的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从源自个体的皮肤细胞中获得基因组DNA；和

(b)观察基因组DNA中选自由这161个位点组成的组的至少两个CpG位点的胞嘧啶甲基化，从而获得可用于确定急性阳光照射对皮肤的作用的信息。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞100、＞125、＞150个，最优选所有161个位点。

所有位点在1周时间内未处理样品中变化显著性计算的p值，且因此161个位点可对于观察的变化的显著性进行评估。

表9列出了p值最多为0.2的116个位点。这些位点是更优选的子集。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85、＞90、＞100、＞110个，最优选所有116个位点。

表9

表10列出了p值最多为0.1的98个位点。这些位点是甚至更优选的子集。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞75、＞80、＞85、＞90个，最优选所有98个位点。

表10

表11列出了p值最多为0.05的78个位点。这些位点是还更优选的子集。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞50、＞60、＞70个，最优选所有78个位点。

表11

表12列出了p值最多为0.01的44个位点。这些位点是最优选的子集。

优选观察该子集的＞5、＞10、＞15、＞20、＞30、＞40个，最优选所有44个位点。

表12