太白贝母的Indel标记引物及其应用

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，公开了一种太白贝母的InDel标记引物及利用该标记引物建立的PCR方法，能够准确区分太白贝母与其它基原贝母品种，有效保证药材基原的准确性与质量安全。

技术背景

以植物、动物来源的中药材在生物学上物种的确定，称之为基原。如果中药材标准来源项下收载有两个及以上基原的情况称之为多基原中药材。尽管多基原缓解了中药材的市场空缺，然而多基原的混合使用严重影响中药临床疗效的有效性、安全性与质量可控性。为此，国家食品药品监督管理总局于2016年颁布《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》规定：“对栽培、养殖或野生采集的药用动植物，应准确鉴定其物种，包括亚种、变种或品种，不同种的中药材不可相互混用”。

贝母是典型的多基原药材，极易混淆与掺杂。《中国植物志》中收载，太白贝母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)为百合科(Liliaceae)贝母属Fritillaria L.植物，主要分布于陕西(秦岭及其以南地区)、甘肃(东南部)、四川(东北部)和湖北(西北部)，生于海拔1100-3150米的山坡草丛中或水边。2020年版《中国药典》收载川贝母、伊贝母、浙贝母、平贝母与湖北贝母等药材品种。太白贝母属于川贝母药材的6种基原之一，其余川贝母药材的基原还包括卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)、暗紫贝母(F.unibracteata P.K.Hsiao&K.C.Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskii)、梭砂贝母(F.delavayi)和瓦布贝母(F.unibracteata Hsiaoet K.C.Hsia var.wabuensis)。目前，2020版《中国药典》中“川贝母”项下以有PCR-RFLP分子鉴定方法，该方法优点是能够区分川贝母与伊贝母等其余5种贝母药材，但缺点是不能区分川贝母的6种基原，并且也不能区分川贝母与浓蜜贝母、中华贝母和康定贝母等川贝母近缘物种。以致市场上出现了不同基原贝母、不同基原川贝母、川贝母与一些近缘混淆品混用的现象。以上情况，均会严重影响临床疗效与安全性，极大地危害消费者及病患者利益，因此急需建立适合于单基原的准确、高效鉴定方法。公开号为CN201410064966的专利，使用叶绿体基因组测序方法用于鉴定太白贝母，但该方法存在测序周期长，成本高、样本必需新鲜等缺点。基于此目的，本发明建立一种能够准确鉴定太白贝母的分子生物学方法，能够有效区分太白贝母与非太白贝母(包括其余5种川贝母基原、非川贝母及一些川贝母近缘易混种)。

太白贝母的鉴定主要依赖于传统的性状鉴定方法，此法主要从样品的鳞茎色泽、脐点形状、鳞叶数量、抱合紧密度、顶端开合、长短以及气味等特征进行观察比较，需要丰富的鉴定经验，且栽培品形态标准性较差。再加上人为干预栽培导致不同贝母的相似度不断上升，鉴别难度不断增加，一般需要结合其他分析鉴定技术进行鉴别。化学方法如高效液相色谱以及液质联用技术，耗费材料多，且需要大型仪器支持，推广难度大，因此，开发更加便捷、快速的检测方法以满足药材市场监控需求是刻不容缓的。

发明内容

发明人基于川贝母(6种基原)、伊贝母(2种基原，分别为伊犁贝母与新疆贝母)、浙贝母、平贝母与湖北贝母等不同贝母的叶绿体基因组的序列信息，通过分析比对，发现太白贝母在accD-psaI基因区间中有一段长度为137bp的DNA片段缺失，这段缺失即作为太白贝母特异性的Indel标记。本发明据此Indel标记，设计Indel标记上下游引物，用于太白贝母的鉴定，至少有以下应用：①太白贝母基原植物的鉴定；②药材的鉴定。

本发明第一个目的在于提供可供太白贝母分子鉴定的Indel标记引物，其二，是提供一种能快速鉴定太白贝母的测试方法；其三是应用所述标记与方法，以解决目前快速鉴定太白贝母贝母存在的技术缺陷。

实现本发明目的之技术措施如下：一种太白贝母的Indel标记引物，所述特异性Indel标记引物的核苷酸序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：1，如下所示：

SEQ ID NO：1的核苷酸序列：5′-GCGAACGAGTATTTAGTTCATC-3′

SEQ ID NO：2的核苷酸序列：5′-AGGGTTCTTTCACTCCTTTCT-3′。

所述的Indel标记引物是根据太白贝母的Indel标记设计的。该Indel标记的获得是通过13种不同贝母属植物的叶绿体基因组序列比对，发现太白贝母的accD-psaI基因区间缺失一段长度为137个bp的序列设计的。

一种基于该Indel标记引物用于太白贝母鉴定的PCR方法，包括如下步骤：

3.1)提取待测样品基因组DNA；

3.2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述Indel标记引物进行PCR扩增；

3.3)根据凝胶电泳结果是否出现302bp位置的条带来判定样品是否为太白贝母。进一步的，所述太白贝母的Indel标记引物及其应用，用于太白贝母基原植物的快速分子鉴定。

更进一步的，所述太白贝母的Indel标记引物及其应用，用于太白贝母药材的快速分子鉴定。

与针对鉴定太白贝母的现有技术比较，本发明有如下的优点与积极效果：

1、本发明首次发现以该Indel标记为核心的PCR方法能够特异性鉴定太白贝母，仅有太白贝母的PCR扩增产物在302bp位置显示为阳性结果，其它贝母品种在302bp位置均显示为阴性结果，并运用本发明对太白贝母基原植物、药材的特异性分子检测鉴定；具有很高的可行性与应用前景，对中草药贝母市场的健康稳定发展具有重要的意义。

2、所说的本发明具有以下优点：

①操作步骤少，成本低、检测周期短，其操作步骤包含：DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、凝肽成像与结果分析，操作时间仅需2-3小时；

②特异性好，仅有太白贝母在302bp位置显示为阳性结果；

③重现性好：我们已进行了10次以上的生物学重复，重现性达到100％；

④灵敏度高：本方法最低检测(DNA)浓度检测为0.239ng/μL。

附图说明

图1本发明实施例试验检测过程流程示意图。

图2本发明所用PCR的反应灵敏度检测结果示意图。

图3本发明所用PCR的最优Tm检测结果示意图、及对太白贝母基原植物与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

图4本发明对太白贝母药材与其它近缘贝母样品的检测结果实施例。

具体实施方式

结合实施例与附图对本发明作进一步说明：

从图1可知，实施本发明历经太白贝母基原植物、药材、基因组DNA提取、PCR、凝胶电泳、凝胶成像及结果分析阶段，整个步骤耗时2～3小时。

一种太白贝母的Indel标记引物及其应用的特异性Indel标记引物，所述特异性Taqman探针的核苷酸序列SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2，如下所示：

SEQ ID NO：1的核苷酸序列：5′-GCGAACGAGTATTTAGTTCATC-3′

SEQ ID NO：2的核苷酸序列：5′-AGGGTTCTTTCACTCCTTTCT-3′

所述的Indel标记引物是根据太白贝母的Indel标记设计的。该Indel标记的获得是通过13种贝母属植物的叶绿体基因组序列比对，发现太白贝母的accD-psaI基因区间缺失一段长度为137个bp的序列设计的。

基于川贝母(6种基原)、伊贝母(2种基原，分别为伊犁贝母与新疆贝母)、浙贝母、平贝母与湖北贝母等不同贝母的叶绿体基因组的序列信息，发现太白贝母在accD-psaI基因区间中有一段长度为137bp的DNA片段缺失，这段缺失即作为太白贝母特异性的Indel标记。本发明据此设计了Indel标记引物及相应的PCR检测技术，能够快速准确区分太白贝母与其它种类贝母。

一种用于太白贝母鉴定的PCR检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)以待测样品基因组DNA为模板，利用上述Indel标记引物(SEQ ID NO：1与SEQ IDNO：2)进行PCR扩增；

3)根据凝胶电泳结果是否出现302bp位置的条带来判定样品是否为太白贝母。其中，步骤1)中所述待测样品基因组DNA提取包括以下步骤：取伊犁贝母干燥鳞茎样品、或药材、或药材饮片(50～60)mg，用75％的酒精和无菌超纯水擦拭干净，加入液氮研磨成极细粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，按照说明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio-Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水作空白对照，检测DNA的浓度。

步骤2)中PCR的反应体系与反应参数

步骤2)所述PCR反应体系：2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为12.5μL，步骤2)，Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积25μL。

步骤2)中的PCR反应条件参数：95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性30S，，58℃退火。30S，72℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min。

所述PCR反应采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪完成。

步骤3)中所述的凝胶电泳优选为3％琼脂糖电泳，恒定电压100V，步骤2)中的PCR产物8μL。

图2给出了本发明所用PCR的反应灵敏度检测结果，显示该鉴定方法有较高的反应灵敏度，最低检测浓度可达0.239ng/μL(具体结果可见表1)。图2注释：M为核酸分子量Marker；1-8代表DNA模板浓度(ng/μL)为238.54，23.854，2.39，0.239，0.0239，0.00239，0.000239与0.0000239时的PCR结果。

图3给出了本发明所用PCR的最优Tm检测结果，显示该鉴定方法在Tm值为55～59℃均有较好的扩增效果，优选为58℃。图3注释：所有样品除湖北贝母为药材粉末外，均为基原植物叶片。A为Tm等于55℃时的PCR结果图；B为Tm等于56℃时的PCR结果图；C为Tm等于57℃时的PCR结果图；D为Tm等于58℃时的PCR结果图；E为Tm等于59℃时的PCR结果图；F为Tm等于60℃时的PCR结果图。

M为核酸分子量Marker；1道为暗紫贝母；2道为梭砂贝母；3为卷叶贝母；4为太白贝母；5为甘肃贝母；6为瓦布贝母；7为中华贝母；8为康定贝母；9为伊犁贝母；10为浓蜜贝母；11为浙贝母；12为平贝母；13为新疆贝母；14为湖北贝母。

图4注释：M为核酸分子量Marker；1为市售松贝药材；2为市售青贝药材；3为市售炉贝药材；4为太白贝母干燥鳞茎药材；5为瓦布贝母干燥鳞茎药材；6为中华贝母干燥鳞茎药材；7为康定贝母干燥鳞茎药材；8为伊犁贝母干燥鳞茎药材；9为浓蜜贝母干燥鳞茎药材；10为浙贝母干燥鳞茎药材；11为平贝母干燥鳞茎药材；12为新疆贝母干燥鳞茎药材；13为湖北贝母干燥鳞茎粉末药材

图3、图4给出本发明所用PCR对不同种类贝母样品的检测结果，检测的样品为太白贝母(包括基原植物、药材，见表2)与其它近缘贝母品种(表3)。揭示本发明Indel标记引物用于太白贝母及其近缘贝母品种鉴别的PCR检测的用途。

实施例1：以太白贝母基原植物、药材为样品的实验及结果

1)太白贝母样品的DNA提取

取1份太白贝母(Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li)样品，取贝母叶片、干燥鳞茎药材各约50～60mg，用75％的酒精和无菌超纯水洗净，晾干，加入液氮研磨成极细粉，采用北京天根生化有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)，按照说明书提取样品基因组DNA。将提取的DNA使用Bio-Tek酶标仪检测，用灭菌超纯水作空白对照，检测DNA的浓度。

2)PCR的反应体系与反应参数

PCR反应体系为：2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为12.5μL，步骤2中的Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积25μL。

PCR反应条件参数：95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性30S，，58℃退火。30S，72℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min。

3)PCR的反应灵敏度

将上述太白贝母基因组DNA用灭菌超纯水按10倍稀释成8个梯度，每个浓度梯度各取2μL作为模板，检测PCR反应灵敏度。

检测结果显示，采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪，在模板DNA质量浓度为238.54～0.239ng/μL时，均可能产生良好的PCR扩增效果，凝胶电泳条带清晰可见(表1，附图2)。综上，该鉴定方法灵敏度高。

表1不同浓度DNA的PCR结果

4)PCR对太白贝母基原植物与药材等不同形式(表2)的适用度。由附图3-5可知，无论太白贝母基原植物与药材，经过PCR扩增后，均能产生长度为302bp位置的阳性条带，表明本发明能够适用于太白贝母基原植物与药材，有较广阔的应用范围。

表2太白贝母的基原植物与药材信息

实施例2：其它种类贝母样品的实验及结果

1)其它种类贝母样品的基因组DNA提取

基本同实施例1，所不同的是本实施例共收集不同贝母基原品种共13种(表3)，包括：暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)、太白贝母(Fritillaria taipaiensis)、卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi)、瓦布贝母(Fritillaria wabuensis)、甘肃贝母(Fritillaria przewalskii)、康定贝母(Fritillaria cirrhosa var.ecirrhosa Franch)、浓蜜贝母(Fritillaria mellea)、中华贝母(Fritillaria sinica)、浙贝母(Fritillaria thunbergii)、平贝母(Fritillariaussuriensis)、湖北贝母(Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)、新疆贝母(Fritillaria walujewii Regel)共13种26份样品，进行基因组DNA提取。提取到的基因组DNA直接用于后续PCR实验，以检测PCR反应特异性。

表3其它种类贝母样品

2)PCR反应

基本步骤同实施例1。

3)PCR的反应特异性

由附图3-4可知，12种其它贝母品种，包括暗紫贝母、太白贝母、卷叶贝母、梭砂贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、康定贝母、浓蜜贝母、中华贝母、湖北贝母、浙贝母、新疆贝母的PCR扩增产物长度为450bp左右，平贝母未检测到PCR产物，在302bp位置均显示为阴性结果，与太白贝母的PCR扩增结果有明显差别。综上，该鉴定方法特异性强，能够有效鉴定太白贝母及其常见易混品。

实施例3

本发明应用实施例操作步骤：

1、分别取太白贝母(包括基原植物与药材)及其它贝母品种样品50～70mg；

2、加入液氮研磨成细粉，采用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)完成基因组DNA提取；

3、利用BioTek酶标仪测定DNA浓度；

4、分别取DNA 2×Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)为12.5μL，步骤2中的Indel标记引物上、下游引物(浓度均为10μM)各1.0μL，DNA模板2.0μL，用灭菌超纯水补足体积至总体积25μL。

5、采用Thermo Fisher 96-Well Thermal Cycler PCR仪,进行PCR；

反应参数为95℃预变性10min，1次循环，(95℃变性30S，，58℃退火。30S，72℃延伸，50S，35次循环)，72℃延伸，7min；

6、利用琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像分析PCR扩增结果；

7、出现长度为302bp位置的阳性条带的即为太白贝母。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 太白贝母的Indel标记引物及其应用

<130> 发明

<140> 20201210

<141> 2020-12-10

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li

<400> 1

gcgaacgagt atttagttca tc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Fritillaria Taipaiensis P.Y.Li

<400> 2

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