一种提高莫能霉素生物利用度的方法

技术领域

本发明属于莫能菌素发酵技术领域，尤其涉及一种提高莫能霉素生物利用度的方法。

背景技术

莫能菌素以干扰球虫细胞内钠钾离子的正常交换，使大量的钠离子进入细胞内，造成钠离子在胞内浓度高，渗透压上升，更多的水分进入球虫内。 莫能菌素可以影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵，提高丙酸与乙酸的产出比例，降低挥发性脂肪酸，减少甲烷生成，提高蛋白质利用效率。在当前禁止在饲料中添加促生长类抗生素的情况下，莫能霉素作为抗球虫治疗作用仍可以继续使用。产品特性：1、稳定性高，控制球虫效果良好，为轮换用药时首选药物，对所有家禽均为安全、效果稳定经过时间考验；2、改善饲料效率，莫能菌素可以帮助提前肉鸡出栏，改善料肉比，经济效益明显； 3、激发球虫免疫；但现有的生产工艺均为发酵结束后直接收集菌体，制粒得到莫能霉素预混剂产品，经过胃肠溶实验和生物利用度实验，发现其存在菌体内莫能霉素释放率低，导致产品生物利用度较低的现象。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高莫能霉素生物利用度的方法，本发明中莫能菌素预混剂的制备方法改变了传统的生产工艺，不需要使用板框压滤，用发酵液部分酶解后直接喷干生产莫能霉素产品，即减少了污水的产生，减少了设备的使用，又使得发酵结束后的剩余营养成分得到了利用，节约了成本，提高了设备利用率。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种提高莫能霉素生物利用度的方法，采用肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的培养基，发酵工艺为三级，包括一级种子培养、二级种子培养和发酵培养，包括以下步骤：

1）一级种子培养采用培养基培养，一级种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、糊精20g/L、豆粕粉15g/L、酵母粉3g/L、玉米蛋白粉5g，培养工艺周期为20-30h，培养温度30-34℃，转速200rpm，移种指标为pH 6.6-7.1，菌浓15-20%；

2）二级种子培养采用培养基培养，二级种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、碳酸钙2g/L、豆粕粉15g/L、酵母粉3g/L，培养工艺一级接二级接种量0.04%，培养周期10-20h，温度30-34℃，转速200rpm，通气量为0.5-1.0vvm, 移种指标：pH 6.6-7.1，菌浓15-20%；

3）发酵培养采用发酵罐培养基，发酵罐培养基的组成为:葡萄糖20g/L、豆粕粉20g/L、油酸甲酯10g/L、豆油20g/L、硝酸钠2g/L、硫酸钠2g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化锰0.3g/L、抗坏血酸0.02g/L,轻质碳酸钙3g/L，泡敌0.2g/L，培养工艺：接种量8.0%，周期：300h，温度30-34℃，转速100rpm，通气量为0.5-1.0vvm，发酵培养过程通过添加补料培养基保持培养液PH为6.5、油控水平1.0-2.0%；

4）提取制备成品：向步骤3）中发酵结束的发酵液中加入其重量0.05%的溶菌酶，于40℃保温反应30-60min升温至60-80°C，搅拌速率100-200rpm，使酶解率在30-40%酶解结束，由于溶菌酶对莫能霉素菌丝体进行部分破壁处理，之所以部分破壁处理是因为全部破壁的话菌体所需酶量较大，处理时间长导致成本高，另外也很难保证全部破壁，再加热到70°C，打入预处理罐中，从罐口加入氢氧化钠，搅拌均匀，使溶液的pH值为9.0-10，再加入碳酸钙搅拌35分钟，将料液全部打入预混罐，开启压力喷干塔，调节空压机压力O.35MPa，进料流量为300L/h，进风温度120-180℃，出风温度60-90℃，出料口温度50-60℃，收集产品。

进一步的，所述步骤3)中补料培养基为棕榈油、18-23%的氨水、10%的液碱、0.5%硫酸铵与0.05%磷酸混合液中的至少一种。

进一步的，所述步骤4）中碳酸钙的加量为碳酸钙的加量计算值±5%。

一种提高莫能霉素生物利用度的方法制备的莫能菌素预混剂产品。

本发明具有的优点是：本发明中莫能菌素预混剂的制备方法改变了传统的生产工艺，不需要使用板框压滤，用发酵液部分酶解后直接喷干生产莫能霉素产品，即减少了污水的产生，减少了设备的使用，又使得发酵结束后的剩余营养成分得到了利用，节约了成本，提高了设备利用率，由于在提取阶段增加一种溶菌酶对莫能霉素菌丝体进行部分破壁处理，释放部分产品游离在胞外，最后将发酵液直接通过压力喷雾干燥塔喷干制粒，改进工艺后制得产品与原有工艺制得产品进行生物利用度试验，投药后采集血液，检测不同时间点血液药物浓度，实验结果表明动物在口服改进工艺药物 后达峰时间更短，吸收速度快，作用时间长，生物利用度较高，该方法虽然增加溶菌酶处理成本，但减少污水排放，提取阶段真正做到零排放，对环境友好。

附图说明

图1是本发明实施例中实验组与对照组的血药浓度-时间曲线对比图。

具体实施方式

实施例

一种提高莫能霉素生物利用度的方法，采用肉桂地链霉菌发酵生产莫能菌素的培养基，发酵工艺为三级，包括一级种子培养、二级种子培养和发酵培养，包括以下步骤：

1）一级种子培养采用培养基培养，一级种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、糊精20g/L、豆粕粉15g/L、酵母粉3g/L、玉米蛋白粉5g，培养工艺周期为20-30h，培养温度30-34℃，转速200rpm，移种指标为pH 6.6-7.1，菌浓15-20%；

2）二级种子培养采用培养基培养，二级种子培养基组成为：葡萄糖5g/L、碳酸钙2g/L、豆粕粉15g/L、酵母粉3g/L，培养工艺一级接二级接种量0.04%，培养周期10-20h，温度30-34℃，转速200rpm，通气量为0.5-1.0vvm, 移种指标：pH 6.6-7.1，菌浓15-20%；

3）发酵培养采用发酵罐培养基，发酵罐培养基的组成为:葡萄糖20g/L、豆粕粉20g/L、油酸甲酯10g/L、豆油20g/L、硝酸钠2g/L、硫酸钠2g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化锰0.3g/L、抗坏血酸0.02g/L,轻质碳酸钙3g/L，泡敌0.2g/L，培养工艺：接种量8.0%，周期：300h，温度30-34℃，转速100rpm，通气量为0.5-1.0vvm，发酵培养过程通过添加补料培养基保持培养液PH为6.5、油控水平1.0-2.0%，补料培养基为棕榈油、18-23%的氨水、10%的液碱、0.5%硫酸铵与0.05%磷酸混合液中的至少一种；

4）提取制备成品：向步骤3）中发酵结束的发酵液中加入0.05%的溶菌酶，于40℃保温反应30-60min升温至60-80°C，搅拌速率100-200rpm，使酶解率在30-40%酶解结束，加热到70°C，打入预处理罐中，从罐口加入氢氧化钠，搅拌均匀，使溶液的pH值为9.0-10，再加入碳酸钙搅拌35分钟，碳酸钙的加量为碳酸钙的加量计算值±5%，由于溶菌酶对莫能霉素菌丝体进行部分破壁处理，之所以部分破壁处理是因为全部破壁的话菌体所需酶量较大，处理时间长导致成本高，另外也很难保证全部破壁，再将料液全部打入预混罐，开启压力喷干塔，调节空压机压力O.35MPa，进料流量为300L/h，进风温度120-180℃，出风温度60-90℃，出料口温度50-60℃，收集产品。

一种提高莫能霉素生物利用度的方法制备的莫能菌素预混剂产品。

对比实验

首先找到合适的水解工艺和溶菌酶，评估影响因子重要性，将因子进行试验验证，确定最佳反应条件。通过单因子分析，分别确定水解工艺为添加酶量0.05%、水解温度40℃、反应时间1 h、pH和转速自然（酶活单位为1万单位/ml）。酶解率为游离药物效价与总效价的比值，具体结果见表1.

表1

本发明所用工艺，接种针刮斜面孢子后接种于一级摇瓶种子（40ml种子液），培养温度30-32℃，转速200rpm，培养20小时左右，移种指标pH7.0左右,菌浓不低于15%，镜检菌丝美兰深、粗壮，菌丝长且舒展；二级罐装液量为100L，接种量为0.04%，培养温度32℃，转速200rpm，通气量0.5-1.0vvm，当pH为6.6-7.0，菌浓不低于16%，培养周期16-24h；发酵罐装液量为500L，发酵接种量为8%（需二级种子40L），培养温度30-35℃，转速130rpm，通气量为0.4-1.0vvm根据溶氧不低于30%。发酵过程检测菌浓、pH、氨基氮、氨氮、总糖、残油、效价。发酵结束检测效价和残油。

采用实施例1改进后莫能菌素预混剂的制备方法，步骤如下

（1）发酵放罐效价为60000U/ml的莫能菌素发酵液13吨，增加溶菌酶水解棕榈油工艺，添加量为0.05%，40℃保温反应30-60min，搅拌100-200rpm，保证酶解率在30-40%即可。酶解结束加热到70°C，打入预处理罐中，从罐口加入氢氧化钠，搅拌均匀，溶液的pH值为9.0- ;然后再加入相应碳酸钙复配为目标含量产品，搅拌35分钟；

(2)将步骤2的料液全部打入预混罐，开启压力喷干塔，调节空压机压力O.35MPa，进料流量为300L/h，进风温度120-180℃，出风温度60-90℃，出料口温度50-60℃，收集产品；

(3)考虑到我国在饲料中允许的莫能霉素添加量仅为20mg/kg，同时莫能霉素ＥＬＩＳＡ试剂盒的检测下限为0.05mg/kg，本试验采用一次性给药方式，加药量为每头试验猪10mg/kg。

（4）血样采集与处理

试验期间所有试验猪禁食，自由饮水采血时间点分别为投药后的第0小时 、 0.5小时 、 1小时 、 1.5 小时 、2小时 、3 小时、4小时 、5 小时 、6小时 、 8小时 、10 小时、12 小时 、14小时 、 17 小 时、 20小时 、24 小时 ， 共16次采血方法为猪前腔静脉取血，每次采血4-5ml；

（5）结果及分析

对所采样品进行血药浓度检测，根据对照组与实验组猪血清中莫能霉素含量，绘制血药浓度-时间曲线，分析结果见图1。

实验结果表明实验组（工艺改进后药物）药物吸收速度快于对照组，在较短时间内达到最大值，高血药浓度维持时间较久，增加部分破壁工艺制备产品在动物体内的吸收过程有一定的促进作用，提高了莫能霉素的生物利用度。

本发明中莫能菌素预混剂的制备方法改变了传统的生产工艺，不需要使用板框压滤，用发酵液部分酶解后直接喷干生产莫能霉素产品，即减少了污水的产生，减少了设备的使用，又使得发酵结束后的剩余营养成分得到了利用，节约了成本，提高了设备利用率。