一类化合物及其用于新型冠状病毒肺炎的医药用途

技术领域

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类化合物及其用于新型冠状病毒肺炎的医药 用途，属于药学技术领域。

背景技术

自从SARS-CoV-2引起的COVID-19爆发以来，它已夺走了全球数百万人的生命。此外，尽管先 前有人畜共患病暴发，但仍未批准针对紧密相关的冠状病毒，SARS-CoV-1或MERS-CoV的抗病毒 药物或疫苗。对于COVID-19的抗病毒药物的设计和开发，了解复制周期和关键基因组要素仍然至关 重要。冠状病毒是有包膜的，正义的，单链RNA病毒。两种病毒半胱氨酸蛋白酶3CLpro和PLpro 扮演关键的角色。3CLpro在所有冠状病毒中高度保守，并且在介导病毒复制和转录中起着重要作用， 因此被认为是理想的蛋白目标是开发广谱抗病毒药物。Cys145和His41是3CLpro催化位点的关键残 基。此外，3CLpro活性位点上有几个口袋，例如谷氨酰胺特异性S1位点，疏水性S2位点和小的S4 位点，这些共同为药物设计提供了充足的机会。SARS-CoV-2的PLpro可以抑制病毒复制并重新激活 固有的免疫应答。与SARS-CoV PLpro相似，SARS-CoV-2的PLpro的活性位点包含经典的 Cys-His-Asp三元催化分子，Trp106的侧链位于氧阴离子孔内，并建议吲哚环氮参与在整个催化过 程中产生的带负电荷的四面体中间体的稳定化。

发明内容

LY1是一种新型有效的小分子抑制剂，是抗病毒候选新药。化学名为3-((2-(哌嗪-1-基)苯基) 氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物，研究表明LY1可以有效抑制COVID-19新冠肺炎 的病毒活性，同时在多次有效剂量下，它不会引起明显的毒性。结构式如下：

因此LY1可以通过抑制3CLpro和PLpro的活性，可能成为COVID-19新冠肺炎的治疗药物。

本发明合成一系列结构类似，对新冠肺炎有效的化合物。

本发明提供一系列化合物的制备方法，该制备方法高效实用经济、生产周期短，收率较高，易于 工业化生产。

本发明验证了系列化合物抗新冠肺炎活性，对化合物LY1进行了系统的验证，为抗新冠药物提 供潜在药物分子。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种化合物，所述化合物的结构式如下

本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一类化合物，为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：

其中，A环可以是五、六、七元饱和或者不饱和环，环内存在一到两个杂原子，杂原子指N、O、 S；

R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨 基、羧基或C1～C3烷氧酰基；

R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、所述卤素指氟、氯、 溴或碘。

R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～ C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘。

R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、 羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，所述卤素指氟、氯、溴或碘、

在一些实施例中，A环吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、四氢呋喃基、 噻唑基、苯环、、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、

所述R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、或C1～C3 烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为甲基。

所述R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基 或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为氢、甲基、羟基、卤素。

所述R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、 氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，

在上述优选的基础上，化合物为3-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5- 酮1,1-二氧化物，简称化合物LY1，结构式如下

药理实验证明，该化合物对新冠病毒有明显的抑制作用。

本发明的目的之一在于提供式I/式II通式所示的化合物的制备方法，合成路线如下：

本发明的另一目的在于提供化合物LY1的制备方法，合成路线如下：化合物LY1的制备方法， 其特征在于，合成路线如下：

包括：

(1)(化合物1)1-萘磺酰氯经取代反应制得(化合物2)1-萘磺酰胺；

(2)(化合物2)1-萘磺酰胺经氧化反应制得(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘；

(3)(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘再与(化合物4)叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯发 生取代反应得到(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌 嗪-1-羧酸叔丁酯)；

(4)(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1- 羧酸叔丁酯)氨基脱保护得到目标化合物(化合物LY1)4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨)-5H-萘并[1，8-cd] 异噻唑-5-酮1，1-二氧化物。

进一步的，步骤(1)具体是指：将化合物1加入到盛有溶剂的反应器中，搅拌，在冰浴中滴加 0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏，析出固体，过滤，真空干燥， 得化合物2。

优选的，所述的溶剂为非质子性溶剂中的一种或几种。

步骤(2)具体是指：将(化合物2)1-萘磺酰胺加入盛有有机溶剂的反应器中，控温65℃-70℃ 并搅拌；将十倍当量硫酸高铈用2mol/L的稀硫酸溶解，控温65℃-70℃并搅拌，缓慢滴加入至体系中， 从滴加开始计时，25-35分钟后停止反应，放置冷却后抽滤，随后在滤液中加入二氯甲烷萃取，取二 氯甲烷层，真空干燥，得5，8-二氧代-二氢萘。作为更优选，温度为65℃，反应时间为27分钟。

进一步的，步骤(2)中，所述有机溶剂为冰乙酸、三氟醋酸中的一种或几种。

步骤(3)具体是指：将化合物3、化合物4与催化剂用冰乙酸溶解，常温下搅拌反应25-30小时； 减压蒸馏除去溶剂，得粗品，粗品经纯化得化合物5；

所述催化剂为一水合乙酸铜、三氯化铈、三乙胺中的一种或几种；更优选为一水合乙酸铜。

步骤(4)具体是指：化合物5脱去氨基保护得到化合物LY1；具体包括：用有机溶剂二氯甲烷 溶解化合物5，通入盐酸气体，室温搅拌，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤，即得化合物LY1。

步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿，二氧六环中的一种或几种。

优选的，步骤(3)中，粗品经纯化得化合物5，包括：

在粗品中加入无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却 搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后，加入10倍当量的有机溶剂完全溶解后，滴加入25倍当量的醇类 有机溶剂，旋蒸后除去有机溶剂，待晶体全部析出，过滤得化合物5。

进一步的，纯化过程中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或几种，优选为二氯甲烷； 醇类有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，优选为异丙醇。

本发明提供的化合物LY1系列化合物的制备纯化方法，制备方法简单，成本低，收率高，以萘 磺酰氯为原料，以较低的成本方便地制备了有良好抗肿瘤活性的化合物LY1。

第三方面，提供所述的化合物在制备预防和/或治疗与新型冠状病毒肺炎有关疾病的药物中的应 用。

该化合物通过高特异性来抑制3CLpro和PLpro的活性，用作治疗新型冠状病毒肺炎的药物。

能够作为治疗包括结直肠癌，肺癌、新型冠状病毒肺炎在内的对STAT3抑制剂类药物或者吉非 替尼产生耐药性的疾病的药物。

其中化合物LY1效果尤佳。

附图说明

图1为：通过定量实时RT-PCR评估LY1对新冠病毒繁殖的功效，化合物LY1表现出良好的抗 病毒活性；

图2为：MTT法，化合物LY1的细胞毒性通过MTT法评估，化合物LY1的CC50值高于15μM。 如图2所示。实验结果表明，LY1在体外具有优秀的抗病毒活性和较小的毒性；

图3为：荧光共振能量转移(FRET)蛋白酶测定结果表明LY1能有效抑制SARS-CoV-23CLpro 和PLpro的活性；

图4为：表面等离振子共振(SPR)分析结果表明LY1主要靶向3CLpro蛋白。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本 发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

一、化合物及其制备

前体准备

1)、制备1-萘磺酰胺

将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240 ml 0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的 氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得1-萘磺酰胺(4.35g，收率96.7％)。该化合物无需进一步纯化， 直接用于下一步反应。实验数据如下：

Mp 147～149℃.

2)、制备5，8-二氧代-二氢萘

将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将1-萘磺酰胺 (10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌，缓慢滴 加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液冷却后， 过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得5，8-二 氧代-二氢萘(6.72g，收率58.43％)。直接用于下一步反应无需纯化。实验数据如下：

Mp 186～188℃.HR-MS(ESI)calcd for C

实施例1

1.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)

将5，8-二氧代-二氢萘(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g， 217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应， 该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。

在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热， 自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓 慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红 色晶体，低压干燥得4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸 叔丁酯，纯度为97％.(67.53g，收率83％)。

实验数据如下：

Mp 189～190℃.

1.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物

将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g， 3.78mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应 结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1- 二氧化物(1.95g，收率97％)。实验数据如下：

Mp 200～201℃.

2.1制备(1,4-二氧代5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)-烟酸

将5，8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、5-氨基烟酸(172mg,1.2mmol).与一水合乙酸铜(20mg, 0.1mmol)加入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应3小时；减压蒸 馏除去溶剂，液相色谱分离出3-(萘-2-基氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(221mg，收 率71％)。

实验数据如下

实施例3

3.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)

将5，8-二氧代-二氢萘(0.5g，2.11mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(0.787g，2.53mmol) 与一水合乙酸铜(42mg，0.21mmol)加入到盛有12ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，118℃加热回流，该 温度下搅拌反应3小时；减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺 酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(0.568g，收率51％)。实验数据如下：

Mp 189～190℃.

3.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物

将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(200 mg，0.378mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的10ml圆底烧瓶中，随后加入2ml三氟醋酸，室温搅拌， 薄层跟踪检测反应；反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物制备4-((2-(哌嗪-1-基) 苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物(149mg，收率95％)。实验数据如下：

Mp 200～201℃.

实施例4

制备7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1-磺酰胺

将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、4-氨基苯酚(55.2mg，0.506mmol)与一水合乙酸 铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小时， 反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1- 磺酰胺。

实验数据如下.

实施例5

5.1制备3-((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物

将5,8-二氧代-二氢萘3(300mg，1.26mmol)、N,N-二乙基对苯二胺4(249.26mg，1.52mmol)与 一水合乙酸铜(20mg，0.1mmol)加入到盛有15ml冰乙酸的100ml圆底烧瓶中，室温下搅拌24小时； 减压蒸馏除去溶剂，加入无水乙醇加热，冷凝回流，将大部分溶剂蒸去后过滤，柱层析分离滤饼出3- ((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(37mg，收率7.67％)。

实施例6

6.1制备3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物

将5,8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、1,2-二氨基苯胺(130mg,1.2mmol)。与一水合乙酸 铜(20mg,0.1mmol)加入到盛有10ml冰乙酸的50ml茄形瓶中，室温搅拌反应16小时；减压蒸馏 除去溶剂，液相色谱测得3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(234mg， 收率72％)

实验数据如下；黄色粉末状固体mp(262℃-267℃).

HRMS(ESI)of C

实施例7

7.1制备3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物

将5，8-二氧代-二氢萘1(100mg)、4-氟-2-(三氟甲基)苯胺(90.6mg).与一水合乙酸铜(28.4mg)加 入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应34小时；反应结束后，得到产 物粗产品47.6mg(收率47.6％)。随后加入DCM溶解后加入5g100目硅胶制砂，制砂结束后进行柱层 析分离纯化。分离结束后得到初步纯化产物，进LC-MS中分析得到里面有397分子量产物，可以进一 步纯化。进一步柱层析纯化得到纯化后产物3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5- 酮1,1-二氧化物26.2mg(收率26.2％)。

实施例8

8.1制备3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物

将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、2-氟-5氨基吡啶(56.71mg，0.506mmol)与一水合 乙酸铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小 时，反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd] 异噻唑-5-酮1,1-二氧化物。

实验数据如下

实施例9

9.1制备N-甲基萘-1-磺酰胺

将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240 ml 0℃的甲胺，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的 氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得N-甲基萘-1-磺酰胺(4.82g，收率95.66％)。该化合物无需进一 步纯化，直接用于下一步反应。

9.2制备N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺

将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将N-甲基萘-1- 磺酰胺(10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌， 缓慢滴加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液 冷却后，过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得 N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(6g，收率54.22％)。直接用于下一步反应无需纯化

9.3 4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁 酯

将N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g， 217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应， 该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。

在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热， 自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓 慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红 色晶体，低压干燥得4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基) 哌嗪-1-羧酸叔丁酯.(54.33g，收率78.32％)。

9.4制备N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8-二氢萘-1-磺酰胺

将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g， 3.78mmol)加入到盛有20ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应 结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8- 二氢萘-1-磺酰胺(1.82g，收率98％)。实验数据如下：

二、药理部分(新型冠状病毒肺炎)

1.质粒

将3CLpro的开放阅读框克隆到Nde I和Xho I多个克隆位点之间的pET28a载体中。该构建体确 保了表达的蛋白可以被3CLpro自身自动切割，并可以用PreScission蛋白酶处理以去除6ⅹHis标签。 对于PLP构建，将密码子优化的SARS-CoV-2nsp3在aa746-1062部分中插入到pET28a的Nde I和 EcoR I中，该肽与N端的SAVLQ蛋白序列融合。将第一个氨基酸(Glu)突变为Ser，以促进3CLpro 对PLP的消化，以去除N端His标签。所有突变体均使用KOD-plus-neo(TOYOBO，日本大阪)产 生。

2.重组蛋白的生产与纯化

将3CLpro和PLP的构建体分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)中进行表达。有关详 细信息，将单个克隆在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中于37℃预培养过夜，以产生种子 培养物。然后，以0.5％的异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的比例，以1％的比例接种种子培养物以 产生足够的培养物以表达蛋白质。诱导表达12小时后，通过在4℃以5000rpm离心10分钟收获细 胞。然后，在通过超声处理裂解之前，将沉淀重悬于缓冲液A(20mM HEPES，500mM NaCl，pH 7.5) 中。超声处理后，通过在4℃下以18000rpm超离心1.5h来澄清裂解物，并使用HisTrap FF柱(GE Healthcare)将上清液用于蛋白质纯化。将获得的蛋白质在4℃下用PreScission蛋白酶以20：1的摩 尔比对3CLpro裂解一整夜，然后在用缓冲液B(20mM HEPES，100mM NaCl，1mM DTT，pH 7.5) 平衡的Superdex 200柱(GEHealthcare)上通过凝胶过滤色谱法进一步纯化。之后，使用Amicon(10 kDa临界值，Millipore)将洗脱的级分浓缩至15mg/ml。然后将浓缩的蛋白质储存在-80℃，用于结 晶和活性测定。对于PLP纯化，以20：1的摩尔比使用3CLpro来去除N端His标签。

3.SARS-CoV-2 3CLpro和PLP的抑制分析

分别使用Dabcyl-KLSAVLQSGFRKM-Edans-NH2和CBZ-RLRGG-AMC作为荧光底物，进行了 荧光共振能量转移(FRET)蛋白酶测定。为了进行3CLpro抑制分析，将100nM 3CLpro重组蛋白(化 合物的系列稀释液)在反应缓冲液1(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.3)中混合，共孵育50h， 混合后的总体积为50μL，加入20μM底物以引发反应。然后立即用BioTekSynergy4读板器每3秒钟 测量320nm激发和405nm发射的荧光信号。对于PLP抑制测定，进行了类似的步骤，同时在340nm (激发)和450nm(发射)监测荧光信号。使用GraphPad Prism5.0软件(GraphPad Software，Inc.， San Diego,CA,USA)来计算IC50曲线。来自三个独立实验的IC 50值表示为平均值±SD。

4.LY1的抗病毒测定

非洲绿猴肾Vero E6细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，编号1586)，并保存在Dulbecco 改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco Invitrogen)中，并补充了10％胎牛血清(FBS；Gibco Invitrogen) 和1％青霉素-链霉素(Gibco Invitrogen)。将SARS-CoV-2的临床分离株(nCoV-2019BetaCoV/WIV04 /2019)在Vero E6细胞中繁殖，并按照先前的描述确定病毒滴度(11)。所有感染实验均在生物安全 等级3(BLS-3)下进行。

5.RT-PCR

通过定量实时RT-PCR评估LY1对病毒产量的功效。将Vero E6细胞接种在96孔板中，并以0.05 的MOI感染SARS-CoV-2。感染2小时后，去除含有病毒的培养基，然后用0.1％DMSO作为对照或 2.5-15μMLL1处理细胞。处理48小时后，使用实时荧光定量PCR检测细胞上清液中病毒RNA的拷 贝数，该反应由RdRP，N和E的表达指示。

表面等离子体共振分析

6.SPR分析

SPR分析是在BiaCore T200系统(GE Healthcare，瑞典)上进行的。将目标蛋白稀释在10mM 乙酸钠中，并通过胺偶联方法固定在CM5传感器芯片上。然后将样品在运行缓冲液(PBS)中稀释。 然后，将经过分析物的药物以30μL/min的流速通过参比通道和活性通道注入。关联和解离时间均设 置为120s。在Biacore T200评估软件上，通过稳态亲和模型通过全局拟合进行亲和拟合，以获得平 衡解离常数K

实施例1.LY1体外抗病毒活性

并行使用免疫荧光染色测定法和通过定量RT-PCR评估的抗病毒作用，以证明LY1的体外抗病毒 能力。我们发现在组装好的化合物库中，化合物LY1表现出强大的抗病毒活性，在30μM时抑制率 达到100％。使用免疫荧光染色测定法，用抗核蛋白(NP)抗体和DAPI染色，在显微镜下观察到结 果LY1使得NP明显减少，如图1所示。通过定量实时RT-PCR，化合物LY1表现出良好的抗病毒活 性，EC50值为3.93μM，见图2。化合物LY1的细胞毒性通过MTT法评估，化合物LY1的CC50值 高于15μM。如图2所示。实验结果表明，LY1在体外具有优秀的抗病毒活性和较小的毒性。

实施例2.LY1抑制3CLpro或PLpro的活性

从大肠杆菌(E.coli)发酵液纯化得到重组SARS-CoV-2 3CLpro和PLpro。为了测量化合物LY1 对3CLpro或PLpro的抑制能力，分别使用Dabcyl-KLSAVLQSGFRKM-Edans-NH2和CBZ-RLRGG-AMC作为荧光底物，进行了荧光共振能量转移(FRET)蛋白酶测定。结果如图3所示， 当浓度为10μM时，对3CLpro和PLpro的抑制效果分别达到94.4％和88.6％。结果表明化合物LY1 能有效抑制SARS-CoV-2 3CLpro和PLpro的活性。我们使用了基于荧光共振能量转移(FRET)的裂 解测定法来确定IC

实施例3.LY1主要靶向3CLpro蛋白

为了进一步确定3CLpro和PLpro作为潜在的靶标，我们然后通过表面等离振子共振(SPR)分 析来表征3CLpro和PLpro与化合物LY1之间的亲和力。K