植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量的检测方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体的，涉及一种植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量的检测方法。

背景技术

双胍三辛烷基苯磺酸盐[iminoctadinetris(albesilate)]，又名百可得，是一种触杀型、广谱保护性杀菌剂，能通过阻止病原菌的类酯化合物的合成和破坏细胞膜机能，抑制孢子萌发、芽管伸长和附着孢和菌丝的形成，对真菌类酯化合物的生物合成和细胞膜机能起作用，可以防治由子囊菌和半知菌引起的多种植物病害；在我国主要被用于防治柑橘类水果储藏期的病害。

双胍辛胺(Iminoctadine)是农药杀菌剂双胍三辛烷基苯磺酸盐在农作物使用后测残留物，我国国家标准GB 2763-2019规定双胍三辛烷基苯磺酸盐的人体每日允许摄入量为0.009mg/kg bw，并对西瓜、柑、橘、苹果、番茄、黄瓜等基质中双胍辛胺残留提出限量，范围为0.2-3.0mg/kg，日本也规定了不同植物源产品中双胍辛胺残留限量，范围为0.02-2.0mg/kg。

检测方法方面，相关文献报道很少，多为液相色谱法，实验步骤繁琐，且需要衍生，因此，建立操作简单快速、灵敏度高、准确性好的方法对于维护国家的利益，提高我国农药残留检测技术水平，维护我国食品安全技术保障体系等诸多方面起到积极重要的作用。。

发明内容

本发明首先涉及一种植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量的测定方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样品提取：称取检测量的待测样品于离心管中，加入二氯甲烷，经均质器匀浆提取，离心分离有机相，重复提取两次，合并提取液，浓缩的样品浓缩液；

(2)样品净化：活化弱阳离子固相萃取柱WCX，转移样品浓缩液至柱上，弃去全部流出液。减压抽干小柱，洗脱，收集洗脱液并浓缩至近干，甲酸-甲醇溶液定容，混匀后滤膜过滤得检测液；

(3)样品测定：样品经由LC-MS/MS测定，监测离子对(m/z)为178.7/100.0(定量)、178.7/128.1(定性)。

步骤(1)中，所述的待测样品为植物基质样品，所述的检测量为2-5g；

优选的，所述的样品提取步骤为：称取2-5g植物基质样品，首次使用30mL二氯甲烷提取，再用20mL二氯甲烷重复提取两次，均质器转速为10000r/min，均质提取时间为1min，离心机转速为4000r/min，离心时间为5min，提取液浓缩至约2mL；

步骤(2)中，

减压抽干小柱条件为：65KPa的负压下10min；

洗脱条件为：15mL甲酸-甲醇溶液，甲酸-甲醇溶液体积比为：1：9；

浓缩条件为：40℃水浴中旋转浓缩至近干；

步骤(3)中，

LC条件为：

色谱柱：Phenyl-Hexyl苯基己基(150mm×2.1mm,3.5μm)；

流动相：(A)1％甲酸水溶液；(B)1％甲酸-甲醇溶液；采用等梯度洗脱，流动相比：A：B＝91：9，流速：0.3mL/min。

柱温：35℃；

进样量：10μL；

MS/MS的条件为：

离子源：ESI；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；

电喷雾电压(IS)：5500V；

雾化气(GS1)：55psi；

辅助气(GS2)：50psi；

气帘气(CUR)：25psi；

离子源温度(TEM)：550℃；

双胍辛胺监测定量离子对(m/z)：178.7/100.0、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：19V，碰撞室入口电压(EP)：10V；

双胍辛胺监测定性离子对(m/z)：178.7/128.1、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：27V，碰撞室入口电压(EP)：10V。

步骤(3)所述的LC-MS/MS测定方法中，

双胍辛胺的保留时间为1.56min；

对双胍辛胺定量时的回归方程为Y＝3250X+22000。(Y为峰面积；X为浓度，单位mg/kg)

本发明的有益效果在于：

本发明提供了植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量的测定方法，所述测定方法以用二氯甲烷均质提取样品中的双胍三辛烷基苯磺酸盐残留物，通过固相萃取柱净化，经LC-MS/MS检测，外标法定量，选择正离子模式下呈双电荷的特征母离子[M+2H]2+，其m/z为178.7；另外，选择m/z 100.0(图1A)、m/z 128.1(图1B)为多反应监测的碎片离子，方法具有操作简便、快速、灵敏度高的优点，能检测植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量，对提高我国农药残留检测技术水平具有重要意义。

附图说明

图1、双胍辛胺标准溶液的多离子反应监测色谱图(A)定量离子对(m/z)：178.7/100.0，(B)定性离子对(m/z)：178.7/128.1。

图2、代表性实际样品中双胍辛胺的色谱图(A为阳性芦笋样品，B为阴性枸杞样品)。

具体实施方式

仪器与试剂：

液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)(AB Sciex公司)，

色谱柱：Phenyl-Hexyl苯基己基(150mm×2.1mm,3.5μm)(沃特世公司)；，

电子天平：感量0.1mg，0.01g(岛津公司)；，

均质器(Scientific Industries)；

离心机(Thermo)；

旋转蒸发仪(BUCHI)；

超纯水发生器(默克密理博)

聚丙烯离心管(80mL)；

鸡心瓶(120mL)；

0.22μm微孔过滤膜(有机相型)(天津津腾科技有限公司)。

WCX弱阳离子固相萃取柱：150mg，6mL(沃特世公司)。

双胍三辛烷苯基磺酸盐(iminoctadinetris(albesilate)，Cas No.169202-06-6，≥98.6％，1000μg/mL(Dr.Ehrenstorfer公司)。

二氯甲烷(HPLC级，Dikma)，乙腈(HPLC级，迪马公司)，甲醇(HPLC级，迪马公司)，甲酸(HPLC级，Sigma-Aldrich)。

实施例1植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留提取条件的选择

样品来源：

采集植物源食品：芦笋、枸杞、小麦。

实验步骤：

称取5g试样芦笋、枸杞或小麦样品(精确至0.01g)，于80mL离心管中，向其种添加水平浓度为1.0mg/kg的双胍辛胺，静置老化2h以上。每类基质平行制备添加阳性样品6份，分别加入30mL乙腈，甲醇，乙腈+甲醇(1+1)，二氯甲烷，正丁醇+正己烷，磷酸盐缓冲溶液，进行提取试验条件的优化，步骤如下：

(1)用均质器在10000r/min匀浆提取1min，在4000r/min离心5min，提取有机相，再用20mL二氯甲烷重复提取两次，合并三次提取液，浓缩至约2mL；

(2)将上述浓缩液转移至已预先用6mL甲醇和6mL水活化的WCX弱阳离子固相萃取柱中，弃去全部流出液；

(3)在65KPa的负压下，减压抽干弱阳离子固相萃取柱10min，用15mL甲酸-甲醇洗脱，收集洗脱液于鸡心瓶内，40℃水浴中旋转浓缩至近干，甲酸-甲醇定容1mL，混匀，经0.22μm有机相微孔滤膜后，使用LC-MS/MS测定。

LC条件为：

色谱柱：Phenyl-Hexyl苯基己基(150mm×2.1mm,3.5μm)；

流动相：(A)1％甲酸水溶液；(B)1％甲酸-甲醇溶液；采用等度洗脱，流动相比：A：B＝91：9，流速：0.3mL/min。

柱温：35℃；

进样量：10μL；

MS/MS的条件为：

离子源：ESI；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测；

雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；

电喷雾电压(IS)：5500V；

雾化气(GS1)：55psi；

辅助气(GS2)：50psi；

气帘气(CUR)：25psi；

离子源温度(TEM)：550℃；

双胍辛胺监测定量离子对(m/z)：178.7/100.0、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：19V，碰撞室入口电压(EP)：10V；

双胍辛胺监测定性离子对(m/z)：178.7/128.1、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：27V，碰撞室入口电压(EP)：10V；

经仪器条件优化，双胍辛胺的保留时间为1.56min。

配置标准溶液：称取适量双胍三辛烷苯基磺酸盐标准品，用乙腈-甲醇(1+1，体积比)配置成浓度为1000μg/mL(以双胍辛胺计)的标准储备溶液；吸取适量标准储备溶液，用乙腈-甲醇(1+1，体积比)配置成10μg/mL的标准工作溶液；储备液和工作液于0℃～4℃避光保存。

配置标准工作曲线：根据需要用空白样品基质溶液将中间标准溶液稀释成0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的标准工作溶液，现用现配。

在本方法所确定的实验条件下，对双胍辛胺标准工作溶液进行测定，以峰面积对浓度做线性回归曲线，其回归方程为Y＝3250X+22000(Y为峰面积；X为浓度，单位mg/kg)，(r

实验以空白芦笋为代表性基质，向其中添加浓度为1mg/kg的双胍辛胺，考察了乙腈、甲醇、乙腈+甲醇(1+1)，正丁醇+正己烷，磷酸盐缓冲溶液及二氯甲烷的提取效果。结果表明，选用乙腈、甲醇、乙腈+甲醇(1+1，v/v)、正丁醇+正己烷(1+1，v/v)为提取溶剂时，双胍辛胺的回收率在20％以下，采用磷酸盐缓冲溶液和二氯甲烷作为提取溶剂的提取回收率见表1，表明采用二氯甲烷提取效果最好。进一步验证结果表明，采用二氯甲烷，芦笋、枸杞和小麦在添加浓度为1mg/kg时的回收率范围为78.1～97.2％，因而实验选定二氯甲烷为提取溶剂。

表1磷酸盐缓冲溶液和二氯甲烷作为提取溶剂双胍辛胺回收率对比(n＝6)

实施例2植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留净化条件的选择优化

样品来源同实施例1。

按实施例1实验步骤进一步对净化条件进行优化。

鉴于双胍三辛烷基苯磺酸相关文献报道较少，基于其强极性，选择了沃特世的Oasis MCX(强阳离子交换)，Oasis MAX(强阴离子交换)，Oasis WCX(弱阳离子交换)，OasisWAX(弱阴离子交换)，及其他品牌BAKERBOND Carboxylic Acid(羧酸柱)，InertSep CBA(乙基羧基结合硅胶柱)进行比对优化试验。

第一阶段，直接标准品上样，洗脱，上机检测。筛选出Oasis WCX，Oasis MAX及InertSep CBA，其它小柱不适用。

第二阶段，通过对芦笋、枸杞、小麦三种基质，以1mg/kg添加水平添加标准，二氯甲烷提取三次，进行三次平行实验考察平均回收率，结果显示Oasis WCX明显优于其他两种固相萃取小柱，满足检测要求。所以本方法采用Oasis WCX(6cc/150mg)小柱进行净化。

本方法对Oasis WCX(6cc/150mg)小柱的预处理：甲醇6mL，水6mL依次活化，保证柱体湿润上样，洗脱溶剂用10％甲酸-甲醇溶液(甲醇溶液中添加10％的甲酸)。

本方法针对洗脱体积进行了试验，在2mL pH＝4的磷酸缓冲溶液中加入10μL浓度100μg/mL标准溶液，按照方法规定的条件通过Oasis WCX固相萃取小柱，收集每5mL流出液于单个试管中，共收集20mL，并分别检测各段流出液中双胍辛胺的回收率，实验结果表明在第四个5mL收集液中无检出，所以确定使用体积为15mL的10％甲酸-甲醇溶液洗脱。

实施例3 LC-MS/MS条件的选择和优化

按实施例1实验步骤进一步对LC-MS/MS条件进行选择和优化。

1、液相色谱条件的选择：

选取BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)、BEH HILIC(100mm×2.1mm,1.7μm)和Phenyl-Hexyl(150mm×2.1mm,3.5μm)三种液相色谱柱进行试验。

试验结果显示，Phenyl-Hexyl(150mm×2.1mm,3.5μm)色谱柱的峰形、灵敏度较理想。

为了进一步提高被测物在正离子模式下的灵敏度，又研究了在流动相中添加甲酸体积分数在0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％下的影响，

结果表明添加甲酸体积分数为1.0％和2.0％的情况下灵敏度最高无显著差异，选择甲酸的体积分数为1.0％。

2、质谱条件的选择：

取浓度为10μg/mL的双胍辛胺标准品，以10μL/min流速注入离子源，找到定性、定量离子对，同时对去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞能量(CE)及碰撞室出口电压(CXP)等参数进行优化。

一般的化合物在正离子检测模式下检测母离子通常为[M+H]+或[M+Na+]等，但是在实际优化过程中发现这些通常的准分子离子的灵敏度非常低，结合该化合物分子结构，发现该化合物在正离子模式下呈双电荷，所以选择178.7为特征母离子。双胍辛胺的特征母离子[M+2H]2+/2m/z为178.7，再对其子离子进行全扫描，综合因素考察，最终选择m/z100.0、m/z 128.1作为监控的子离子。

因此：双胍辛胺监测定量离子对(m/z)：178.7/100.0、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：19V，碰撞室入口电压(EP)：10V；

双胍辛胺监测定性离子对(m/z)：178.7/128.1、去簇电压(DP)：90V，碰撞气能量(CE)：27V，碰撞室入口电压(EP)：10V。

实施例4市售植物源食品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量的测定

采集市售植物源食品15份，包括芦笋汁3份、芦笋4份、枸杞4份、黄瓜2份、面粉2份，采用本发明方法，对其中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留量进行测定。

测定结果表明，除芦笋及其制品外，其余样品均未检出双胍三辛烷基苯磺酸盐残留；3个芦笋汁样品1份检出双胍辛胺含量为0.032mg/kg，4个芦笋中2个样品检出，检出含量分别为0.058mg/kg和0.629mg/kg，代表性阳性和阴性样品中双胍辛胺色谱图见附图2。上述检测结果说明芦笋及其制品中双胍三辛烷基苯磺酸盐残留相对较高。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。