一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用。

背景技术

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一类病毒。某些冠状病毒会感染人类并引起疾病，比如中东呼吸综合征（MERS）、严重急性呼吸综合征（SARS）和SARS-CoV-2引起的肺炎，其症状可从普通感冒到重症肺部感染。

SARS-CoV-2引起的肺炎主要以发热、乏力和干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。对SARS-CoV-2感染的肺炎疑似案例、疑似聚集性病例患者及接触物等进行SARS-CoV-2检测，并采取适当措施，可以有效地鉴别感染病源，阻断疫情传播。

SARS-CoV-2基因组为一条完整的单股正链RNA，长约30Kb。利用NCBI上的ORFfinder工具进行该病毒的基因组注释分析发现SARS-CoV-2基因组中共有14个开放阅读框（具有编码基因的能力），ORF1a、ORF1ab和4种结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），膜蛋白（membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（envelope protein，E蛋白），核壳蛋白（nucleocapsid，N蛋白）。

易发生突变是多数RNA病毒的一种固有性质，已有报道揭示了SARS-CoV-2突变株的出现，SARS-CoV-2具有校对功能的聚合酶（proofreading polymerase），其可使SARS-CoV-2发生碱基置换（substitutions）突变的机率较低，但SARS-CoV-2较易发生缺失（deletions）突变，这种突变多发生在S蛋白的重复缺失区（recurrent deletion regions，RDRs），作为抗体识别表位，RDRs的缺失突变可能导致SARS-CoV-2抗体的结合特异性发生变化，使其发生抗原进化（antigenic evolution），进而逃逸由突变前SARS-CoV 2诱生的中和抗体。

目前，国内外对SARS-CoV-2进行检测的方法主要集中在以靶序列PCR扩增为基础的检测和测序技术（Sanger测序、NGS测序）两方面，SARS-CoV-2核酸的定性检测主要包括逆转录+实时荧光定量PCR（Real-time PCR）等，其中荧光PCR技术简单、快速且灵敏，如CN111270021A公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用，该荧光RT-RAA引物和荧光探针可以快速、定性检测患者样本中的新型冠状病毒SARS-CoV-2，但由于病毒发现时间较短，科学认知不足，用于鉴别诊断的基因位点未经大规模临床验证，可能存在假阴性或假阳性，准确性和分析特异性风险。

综上所述，提供一种准确检测SARS-CoV-2的引物及检测方法，发现新的变异位点，对于SARS-CoV-2防控具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用，利用所述引物组合物进行逆转录巢式PCR，并结合测序，能够快速、准确地获取SARS-CoV-2基因信息，从而能够实现快速检测SARS-CoV-2以及判断SARS-CoV-2突变株。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测SARS-CoV-2的引物组合物，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:12所示的核酸序列。

SEQ ID No.1：CAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAAC。

SEQ ID No.2：CAGACTTTAATAACAACATTAGTAGCGTT。

SEQ ID No.3：GAACAGGAAGAGAATCAGCAAC。

SEQ ID No.4：ACTCAGTAAGAACACCTGTGCCT。

SEQ ID No.5：GTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGC。

SEQ ID No.6：CTGCATTCAGTTGAATCACCAC。

SEQ ID No.7：TCTTTCACACGTGGTGTTTATTAC。

SEQ ID No.8：ACAATAAGTAGGGACTGGGTCTTC。

SEQ ID No.9：CTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATAT。

SEQ ID No.10：AACCATTGAAGTTGAAATTGACAC。

SEQ ID No.11：GACATTGCTGACACTACTGATGCT。

SEQ ID No.12：CTGGTAGAATTTCTGTGGTAACACTAAT。

本发明中，设计引物组合物时首先通过进化树分析，发现与SARS-CoV-2亲缘最近的为蝙蝠bat-SL-CoVZC45病毒，其次为SARS-CoV病毒，为提高扩增特异性，选择的目标序列均与bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV序列有5%以上的碱基差异的序列，并通过Blast比对，确保与人类基因组、常见人体或环境微生物之间无交叉反应。

因此，本发明的引物组合物能够针对SARS-CoV-2的S蛋白特定区域g.21765_21770del（p.HV 69_70del）、g.A22812C（p.K417T）、g.G22813C/T（p.K417N）、g.G23012A（p.E484K）、g.A23063T（p.N501Y）、g.A23403G（p.D614G）和g.C23604A（p.P681H）进行高度特异性扩增。

优选地，所述引物组合物还包括内参引物。

优选地，所述内参引物为B2M内参引物。

优选地，所述B2M内参引物包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核酸序列。

SEQ ID No.13：TCATGAGGAGTATGCAGACTCT。

SEQ ID No.14：TCCACATCTGTGGATTCAGCA。

本发明中，内参引物可作为监控提取与反转录过程的指标。

第二方面，本发明提供第一方面所述的检测SARS-CoV-2的引物组合物在制备SARS-CoV-2检测产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测SARS-CoV-2的引物组合物。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、测序引物和测序试剂。

优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg

优选地，所述PCR反应液还包括逆转录扩增Mix、10×QIAGEN buffer和5Qsolution。

优选地，所述测序引物包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所示的核酸序列。

优选地，所述测序试剂包括BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit。

第四方面，本发明提供一种第三方面所述的检测SARS-CoV-2的试剂盒以非疾病治疗和/或诊断为目的的使用方法，所述方法包括：

以样本中核酸为模板，利用第一方面所述的检测SARS-CoV-2的引物组合物进行逆转录巢式PCR，对逆转录巢式PCR的产物进行测序，并对测序结果进行分析。

本发明中，采用所述引物组合物能够对SARS-CoV-2进行高度特异性逆转录巢式PCR，对逆转录巢式PCR的产物进行测序，可准确获取SARS-CoV-2基因信息，从而进行SARS-CoV-2检测以及突变株分析。

本发明中，样本可以为人体样本，亦可以为接触物、食品等环境样本。

优选地，所述逆转录巢式PCR包括一步法逆转录巢式PCR。

优选地，所述测序包括Sanger测序。

本发明中使用Sanger测序法获取SARS-CoV-2核酸序列，可直接读取DNA的序列，测序长度较长，可发现新的变异位点，包括新的、罕见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失等。

优选地，所述一步法逆转录巢式PCR包括第一轮扩增和第二轮扩增。

优选地，所述第一轮扩增的引物包括SEQ ID NO:1~6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核酸序列。

优选地，所述第一轮扩增的反应体系如表1所示，其中，混合酶包括热启动Taq酶、逆转录酶和UNG酶。

表1

优选地，所述第一轮扩增的程序如表2所示。

表2

优选地，所述第二轮扩增的引物包括SEQ ID NO:7~12、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示的核酸序列。

优选地，所述第二轮扩增的反应体系如表3所示。

表3

优选地，所述第二轮扩增的程序如表4所示。

表4

优选地，引物对应关系如表5所示。

表5

优选地，所述方法还包括回收扩增产物的步骤；

优选地，所述回收扩增产物的方法包括通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物。

优选地，所述琼脂糖凝胶的质量百分比为1~3%（w/w）。

优选地，所述电泳的电压为80~120 V。

优选地，所述电泳的时间为15~25 min。

优选地，所述Sanger测序包括：

采用BigDye Terminator试剂盒进行测序PCR，将测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后进行结果分析。

作为优选的技术方案，所述检测SARS-CoV-2的试剂盒以非疾病治疗和/或诊断为目的的使用方法包括以下步骤：

（1）提取样本中核酸；

（2）以样本中核酸为模板，利用SEQ ID NO:1~6、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示引物，按扩增程序：53~57℃，14~16 min；93~96℃，28~32 sec；93~96℃，9~11 sec，58~62℃，58~62 sec，13~17个循环；36~40℃，28~32 sec，进行第一轮扩增，使用1~3%（w/w）的琼脂糖凝胶于80~120 V进行电泳15~25 min，回收第一轮扩增产物；

（3）以所述第一轮扩增产物为模板，利用SEQ ID NO:7~12、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示的引物按扩增程序：93~97℃，14~16 min；93~95℃，28~32 sec，58~62℃，58~62sec，70~74℃，58~62 sec，33~37个循环；70~74℃，9~11 min；36~40℃，28~32 sec，进行第二轮扩增，使用1~3%（w/w）的琼脂糖凝胶于80~120 V进行电泳15~25 min，回收第二轮扩增产物；

（4）利用SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所示的测序引物，对所述第二轮扩增产物进行Sanger测序，并对测序结果进行分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明的引物组合物具备高特异性，能够针对SARS-CoV-2的S蛋白特定区域进行高特异逆转录巢式PCR；

（2）本发明利用所述引物组合物行逆转录巢式PCR，并结合Sanger测序，能够快速、准确地获取SARS-CoV-2基因信息，从而能够实现快速检测SARS-CoV-2以及判断SARS-CoV-2突变株，且具备良好的准确性、灵敏度、特异性以及重复性。

附图说明

图1为实施例2中第二轮扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例2中1号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变起始位置，g.21765_21770 del(p. HV 69_70del)突变；

图3为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.G22813T(p. K417N)突变；

图4为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.G23012A(p. E484K)无突变；

图5为实施例2中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.A23063T(p. N501Y)无突变；

图6为实施例2中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.A23403G(p. D614G)突变；

图7为实施例2中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.C23604A(p. P681H)无突变；

图8为实施例3中第二轮扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图9为实施例3中1号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变起始位置，g.21765_21770 del(p. HV 69_70del)突变；

图10为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.G22813T(p. K417N)突变；

图11为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.G23012A(p. E484K)突变；

图12为实施例3中2号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.A23063T(p. N501Y)无突变；

图13为实施例3中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.A23403G(p. D614G)无突变；

图14为实施例3中3号扩增产物测序结果图，图中矩形标记处为突变区域，g.C23604A(p. P681H)无突变。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种SARS-CoV-2检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括SEQ IDNo.1~12所示的引物组合物、SEQ ID No.7，9，11所示的测序引物、PCR反应的试剂和Sanger测序的试剂，其中PCR反应的试剂包括宝瑞生物的逆转录扩增Mix、宝瑞生物的混合酶（包含热启动Taq酶、逆转录酶、UNG酶）、QIAGEN的10×buffer、QIAGEN的5Q solution、QIAGEN的25mM Mg

所述使用方法包括：

（1）采集鼻咽拭子样本；

（2）采用磁珠法提取核酸；

（3）使用核苷酸序列如SEQ ID No.1~12所示的引物组合进行扩增反应，

第一轮扩增反应的体系为30 μL，Primers由SEQ ID No.1~6所示的引物组合混合而成，反应体系如表6所示。

表6

第一轮扩增反应程序如表7所示。

表7

第二轮扩增反应的体系为50 μL，Primers为SEQ ID No.7-12所示的引物组合，反应体系如表8所示。

表8

第二轮扩增反应程序如表9所示。

表9

（3）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及回收

用2%（w/w）的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100 V，20 min，采用离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，Cat NO. DP209-03）回收扩增产物；

（4）Sanger测序

以第二轮扩增产物为模板，使用核苷酸序列如SEQ ID No.7，9，11所示的测序引物进行Sanger测序，采用BigDye Terminator试剂盒进行测序PCR，将测序PCR产物用酒精纯化，加入Hi-Di甲酰胺，上样，按照ABI 3500XL Dx的仪器说明书进行设置开始运行程序，下机后进行结果分析。

其中，测序PCR反应的体系为10 μL，具体体系如表10所示。

表10

测序PCR反应的程序如表11所示。

表11

实施例2

本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对SARS-CoV-2（样本来源：凯普医学检验所检测人源标本的剩余核酸样本）进行检测，具体对SARS-CoV-2 S蛋白基因突变g.21765_21770 del（p.HV 69_70del）、g.A22812C（p.K417T）、g.G22813C/T（p.K417N）、g.G23012A（p.E484K）、g.A23063T（p.N501Y）、g.A23403G（p.D614G）和g.C23604A（p.P681H）进行检测。

如表5所示，SEQ ID NO:1、2和SEQ ID NO:7、8分别为g.21765_21770 del(p.HV69_70del)区段的第一轮扩增和第二轮扩增的引物，首先以SEQ ID NO:1、2所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:7、8所示引物进行第二轮扩增，得到1号扩增产物，同理，以SEQID NO:3、4所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:9、10所示引物进行第二轮扩增，得到2号扩增产物；以SEQ ID NO:5、6所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:11、12所示引物进行第二轮扩增，得到3号扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，左侧第一泳道为DNA marker（条带大小由上至下分别为1000 bp，700 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp和100 bp），左数第2-5泳道分别为1~3号第二轮扩增产物以及内参扩增产物，回收各扩增产物，并进行Sanger测序，结果如图2-图7所示，样本检测结果为g.21765_21770 del(p.HV69_70del)、g.G22813T(p.K417N)和g.A23403G(p. D614G)突变。

实施例3

本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对SARS-CoV-2（样本来源：假病毒的RNA样本，假病毒购买于广州艾基生物技术有限公司）进行检测，具体对SARS-CoV-2 S蛋白基因突变g.21765_21770 del（p.HV 69_70del）、g.A22812C（p.K417T）、g.G22813C/T（p.K417N）、g.G23012A（p.E484K）、g.A23063T（p.N501Y）、g.A23403G（p.D614G）和g.C23604A（p.P681H）进行检测。

如表5所示，SEQ ID NO:1、2和SEQ ID NO:7、8分别为g.21765_21770 del(p.HV69_70del)区段的第一轮扩增和第二轮扩增的引物，首先以SEQ ID NO:1、2所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:7、8所示引物进行第二轮扩增，得到1号扩增产物，同理，以SEQID NO:3、4所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:9、10所示引物进行第二轮扩增，得到2号扩增产物；以SEQ ID NO:5、6所示引物进行第一轮扩增，并以SEQ ID NO:11、12所示引物进行第二轮扩增，得到3号扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，左侧第一泳道为DNA marker（条带大小由上至下分别为1000 bp，700 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp和100 bp），左数第2-5泳道分别为1~3号第二轮扩增产物以及内参扩增产物，回收各扩增产物，并进行Sanger测序，结果如图9-图14所示，样本检测结果为g.21765_21770 del（p.HV69_70del）、g.G22813T（p.K417N）、g.G23012A（p.E484K）突变。

实施例4

本实施例使用实施例1所述试剂盒及使用方法对已知突变情况的SARS-CoV-2样本进行检测，从而对本发明检测试剂盒及使用方法进行性能验证，验证性能分为四部分：准确度验证、灵敏度与特异性验证、最低检出量验证、重复性验证。

准确度验证结果如表12所示。

表12

灵敏度检测结果如表13所示。

表13

特异性检测结果如表14所示。

表14

最低检出量检测结果如表15所示。

表15

重复性检测结果如表16和表17所示。

表16

表17

综上所述，本发明采用所述引物组合物具备高特异性，能够针对SARS-CoV-2的S蛋白特定区域进行高特异逆转录巢式PCR，本发明利用所述引物组合物行逆转录巢式PCR，并结合Sanger测序，能够快速、准确地获取SARS-CoV-2基因信息，从而能够实现快速检测SARS-CoV-2以及判断SARS-CoV-2突变株，且具备良好的准确性、灵敏度、特异性以及重复性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东凯普生物科技股份有限公司，北京凯普医学检验实验室有限公司，郑州凯普医学检验所（有限合伙），广州凯普医药科技有限公司

<120> 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用

<130> 20210428

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagtgtgtta atcttacaac cagaac 26

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagactttaa taacaacatt agtagcgtt 29

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaacaggaag agaatcagca ac 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actcagtaag aacacctgtg cct 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtttctgcct ttccaacaat ttggc 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgcattcag ttgaatcacc ac 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctttcacac gtggtgttta ttac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acaataagta gggactgggt cttc 24

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgtgttgct gattattctg tcctatat 28

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaccattgaa gttgaaattg acac 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacattgctg acactactga tgct 24

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctggtagaat ttctgtggta acactaat 28

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcatgaggag tatgcagact ct 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tccacatctg tggattcagc a 21