一种奶制品中喹诺酮类化合物的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于兽药残留检测领域，特别涉及到一种奶制品中喹诺酮类化合物的检测方法及其应用。

背景技术

牛奶是深受广大消费者喜爱的饮料，含有丰富的蛋白质、乳脂肪、维生素和矿物质等营养物质，乳蛋白中含有人体所必须的氨基酸，乳脂肪多为短链和中链脂肪酸，钾、磷、钙等矿物质配比合理，易于人体吸收。

喹诺酮类化合物(Quinolones)，为化学合成抗菌药，通过抑制细菌DNA旋转酶的活性，影响细菌的正常代谢和繁衍，由于抗菌谱广，抗菌作用强，被广泛应用于畜牧养殖等产业中。但这类药物及其代谢产物可以蓄积在动物体内，形成不同程度的药物残留。如果长期食用喹诺酮类药物残留超标的奶制品(例如牛奶)，可能会引起皮疹、过敏等应激反应，并可能影响人体肠道中正常菌群生长，低浓度的残留药物也可能诱导致病菌产生耐药性，潜在危害人体健康，已成为临床上需要重点关注的抗菌药物类别之一。

中华人民共和国国家标准GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，牛/羊奶中的恩诺沙星与环丙沙星之和的限量值为100μg/kg，为其提供了判定依据；中华人民共和国农业部公告第2292号明确，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险，在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药。

目前测定奶制品中喹诺酮类药物残留的主要方法有：酶联免疫法、蛋白芯片法、液相色谱法、液质联用法、化学发光法、免疫层析法等。但这些方法存在定性、定量方面的不足，可能导致喹诺酮类药物残留测定结果不准确。

发明内容

为了改善上述技术问题，本发明提供一种奶制品中喹诺酮类化合物的检测方法及其应用。

本发明提供的喹诺酮类化合物的检测方法，包括如下步骤：使用酸化乙腈对待测样品进行处理，收集含有喹诺酮类化合物的上清液；所述上清液经萃取剂萃取，得到待测试液；利用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱对所述待测试液进行分析，实现对喹诺酮类化合物的定性和定量检测。

根据本发明的实施方案，所述待测样品为奶制品，例如为牛奶、羊奶或其他奶源。又如，所述待测样品可以为液体奶制品、乳粉奶制品或固体奶制品(如奶片)等。

根据本发明的实施方案，所述待测样品中含有喹诺酮类化合物。例如，所述喹诺酮类化合物可以选自诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等中的一种、两种或更多种，优选为恩诺沙星和/或环丙沙星。

根据本发明的实施方案，所述检测方法包括以下步骤：

(1)样品前处理：向待测样品中加入酸化乙腈沉淀待测样品中的蛋白质，收集含有喹诺酮类化合物的上清液；

所述酸化乙腈为含有0.1～1％甲酸的乙腈溶液；

(2)制备待测试液：将所述上清液与固相萃取剂混合，经涡旋、离心、氮吹后复溶，过滤，得到所述待测试液体；

所述萃取剂为二乙烯苯与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物、以及乙二胺-N-丙基硅烷的混合物；

(3)采用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱对所述待测试液进行分析，实现对喹诺酮类化合物的定性和定量检测。

根据本发明的实施方案，步骤(1)中，将待测样品与酸化乙腈涡旋混合，超声提取，而后离心，收集到含有喹诺酮类化合物的上清液。

优选地，所述待测样品与酸化乙腈的体积比为1:(1～20)，例如1:(2～10)，示例性为1:4。

优选地，所述涡旋混合的时间为30～120s，例如为60s。

优选地，所述超声提取的时间为2～15min，例如5min。

优选地，所述离心的条件为：4000～8000r/min离心5～10min，例如6000r/min离心5min。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，二乙烯苯与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物的质量和乙二胺-N-丙基硅烷的质量比为(1-3):1，例如为1.5:1。

优选地，所述萃取剂与所述上清液的质量体积比为(15-35)mg:1mL，例如为25mg:1mL。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，向所述上清液中加入萃取剂，涡旋混合，离心，吸取上清液用氮气吹扫至近干，用乙腈水溶液复溶干燥物，过滤，得到待测试液。

优选地，所述涡旋混合的时间为30～120s，例如为60s。

优选地，所述离心的条件为：4000～8000r/min离心5～10min，例如6000r/min离心5min。

优选地，所述乙腈水溶液的浓度为5～20％，例如10％。

优选地，所述过滤为过0.22μm的滤膜。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述超高效液相色谱的测试条件包括：

C

流动相：A-0.1％甲酸水溶液，B-0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱；

优选地，梯度洗脱程序如下：0～0.5min，A保持90％，B保持10％；0.5～1.4min，A从90％下降到5％，B从10％升到95％；1.4～2.2min，A保持5％，B保持95％；2.2～2.3min，A从5％上升到90％，B从95％下降到10％；2.3～3min，A保持90％，B保持10％；

流速：0.3～0.5mL/min，优选0.4mL/min；

进样量：3～6μL，优选5μL；

柱温：30～40℃，优选35℃。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述三重四级杆/线性离子阱质谱的测试条件如下：

离子源：电喷雾正(ESI+)；扫描模式：MS/MS/MS；喷雾电压：3800～4200V，优选4000V；温度：400～600℃，优选500℃；碰撞能量：25～35eV，优选30eV；去簇电压：60～100V，优选80V；激发能量：60～80V，优选70V；扫描速度：250～4000Da/s，优选4000Da/s。

优选地，当所述喹诺酮类化合物为恩诺沙星或环丙沙星时，恩诺沙星、环丙沙星的离子信息见下表：

根据本发明的实施方案，在进行所述超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱分析前，还包括喹诺酮类化合物的标准溶液的配制及标准曲线的绘制，优选包括如下步骤：

取喹诺酮类化合物的标准品溶液，用空白样品提取液配制成5～7个浓度梯度点的标准溶液工作液；以三重四级杆/线性离子阱质谱得到的喹诺酮类化合物的次级子离子为定量离子，以浓度为横坐标，目标峰面积为纵坐标，拟合喹诺酮类化合物的标准曲线图。

例如，喹诺酮类化合物的浓度梯度为2、10、20、50、100ng/mL。

根据本发明的实施方案，步骤(3)包括：将高效液相色谱测试得到的样品的目标峰面积值与标准曲线进行比照，得出待测试液中喹诺酮类化合物的浓度，进而计算出待测样品中喹诺酮类化合物的含量。

本发明中的“％”代表体积百分比。

本发明还提供了上述检测方法的应用，用于检测奶制品中的喹诺酮类化合物。

本发明的有益效果：

1.本发明使用酸化乙腈对奶制品(例如牛奶)中的喹诺酮类化合物恩诺沙星、环丙沙星进行提取，利用充分涡旋、超声的处理方式，对奶制品中的蛋白沉淀和目标化合物恩诺沙星、环丙沙星的提取效率提供了有益的帮助。

2.本发明前处理过程使用分散固相萃取的方式对样品提取液进行净化，该操作方法简单、成本低廉、重复性好，提高了检测效率和检测结果的可靠性。

3.本发明使用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱对恩诺沙星、环丙沙星进行分析，利用MS/MS/MS的扫描模式，获得了更丰富的化合物信息，确定了恩诺沙星、环丙沙星各自的母离子、子离子和次级子离子，定性分值达到了4。该方法定性准确，减低了对假阳(阴)性样品的误判概率。

4.本发明使用目标化合物的次级子离子进行定量分析，选择性更强，降低了样品中杂质的干扰程度，使目标峰的信噪比(S/N)大大增强。

5.本发明使用空白基质溶液配制标准曲线工作液，提供了和实际样品中相近的基质环境，用该校正曲线对样品进行定量分析，降低了仪器分析时基质对目标化合物的干扰，提高了喹诺酮类化合物定量分析结果的准确性。

附图说明

图1为恩诺沙星母离子(m/z 360)裂解为目标子离子碎片(m/z 316)。

图2为恩诺沙星子离子碎片(m/z 316)裂解为目标次级子离子碎片(m/z 296)。

图3为环丙沙星母离子(m/z 332)裂解为目标子离子碎片(m/z 288)。

图4为环丙沙星子离子碎片(m/z 288)裂解为目标次级子离子碎片(m/z 268)。

图5为恩诺沙星UHPLC-MS/MS/MS色谱图，目标化合物保留时间为1.73分钟。

图6为环丙沙星UHPLC-MS/MS/MS色谱图，目标化合物保留时间为1.76分钟。

图7为实施例1中恩诺沙星的标准曲线图；图中横坐标为环丙沙星浓度(ng/mL)，纵坐标为目标碎片峰面积。

图8为实施例1中环丙沙星的标准曲线图；图中横坐标为环丙沙星浓度(ng/mL)，纵坐标为目标碎片峰面积。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

恩诺沙星标准品和环丙沙星标准品均购自：天津阿尔塔科技有限公司。

二乙烯苯与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物购自：北京迪科马科技有限公司。

实施例1

1.样品的处理：

在量取好的空白牛奶样品(不含恩诺沙星、环丙沙星)中分别加入恩诺沙星标准品溶液、环丙沙星标准品溶液(如表2所示，环丙沙星标准品溶液的浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL；恩诺沙星标准品溶液的浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL。均采用甲醇溶解标准品)，混匀，得到本实施例的环丙沙星加标样品以及恩诺沙星加标样品。分别准确吸取2.0mL加标样品，加入8mL的含有1％甲酸的乙腈作为提取液，涡旋混合60s，超声提取5min，6000r/min离心5min，收集上清液。

上清液净化和浓缩：向收集的上清液中加入二乙烯苯与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物150mg，乙二胺-N-丙基硅烷100mg，涡旋混合60s，6000r/min离心5～10min，吸取5.0mL上清液于40℃下氮气吹扫至近干，10％乙腈水溶液定容，充分复溶后经过0.22μm滤膜得到的待测试液。使用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱对待测试液进行分析，测试条件如下：

2.液相色谱分析条件：

色谱柱：C

流动相：A-0.1％甲酸水溶液，B-0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～0.5min，A保持90％，B保持10％；0.5～1.4min，A从90％下降到5％，B从10％上升至95％；1.4～2.2min，A保持5％，B保持95％；2.2～2.3min，A从5％上升到90％，B从95％下降到10％；2.3～3min，A保持90％，B保持10％。

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

柱温：35℃。

3.质谱条件：

离子源：电喷雾正(ESI+)，扫描模式：MS/MS/MS，喷雾电压：4000V，温度：500℃，碰撞能量：30eV，去簇电压：80V，激发能量：70V，扫描速度：4000Da/s，化合物离子信息见表1、图1-4：

表1

4.检测步骤和结果

用空白基质提取液(空白基质提取液是指步骤1中的空白牛奶样品经提取后的上清液)稀释恩诺沙星、环丙沙星标准品溶液，得到2、10、20、50、100ng/mL标准曲线系列浓度梯度，上机。以次级子离子296、268为定量离子，上机浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，拟合标准曲线图(图7-8)。

恩诺沙星和环丙沙星的曲线方程分别为：y＝4109.2x+22363.5(R＝0.9981)、y＝4409.1x+17476.4(R＝0.9995)。

样品经上机后，根据线性方程得到相应含量，结果见下表2、图5-6。

表2

实施例2

1.样品的处理：

准确吸取2.0mL市售牛奶(品牌，伊利；产地，河北唐山)，加入8mL的含有1％甲酸的乙腈作为提取液，涡旋混合60s，超声提取5min，6000r/min离心5min，收集上清液。

上清液净化和浓缩：向收集的上清液中加入二乙烯苯与N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物粉末150mg，乙二胺-N-丙基硅烷粉末100mg，涡旋混合60s，6000r/min离心5～10min，吸取5.0mL上清液于40℃下氮气吹扫至近干，10％乙腈溶液定容，充分复溶后经过0.22μm滤膜得到的待测试液。使用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱对待测试液进行分析，测试条件如下：

2.液相色谱分析条件：

色谱柱：C

流动相：A-0.1％甲酸水溶液，B-0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～0.5min，A保持90％，B保持10％；0.5～1.4min，A从90％下降到5％，B从10％上升至95％；1.4～2.2min，A保持5％，B保持95％；2.2～2.3min，A从5％上升到90％，B从95％下降到10％；2.3～3min，A保持90％，B保持10％。

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

柱温：35℃。

3.质谱条件：

离子源：电喷雾正(ESI+)，扫描模式：MS/MS/MS，喷雾电压：4000V，温度：500℃，碰撞能量：30eV，去簇电压：80V，激发能量：70V，扫描速度：4000Da/s，化合物离子信息见表3：

表3

4.检测步骤和结果

用空白基质提取液稀释恩诺沙星、环丙沙星标准品溶液，得到2、10、20、50、100ng/mL标准曲线系列浓度梯度，上机。以次级子离子296、268为定量离子，上机浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，拟合标准曲线图。恩诺沙星和环丙沙星的曲线方程分别为：y＝4109.2x+22363.5(R＝0.9981)、y＝4409.1x+17476.4(R＝0.9995)。

检测结果：样品为阴性，未检出恩诺沙星和环丙沙星。

本发明实施例中恩诺沙星和环丙沙星的检出限为1ng/mL。

本发明采用超高效液相色谱串联三重四级杆/线性离子阱质谱仪对测试样液进行定性定量分析，得到恩诺沙星、环丙沙星的含量。该方法能够准确、灵敏地测定牛奶中恩诺沙星、环丙沙星的含量，提高了恩诺沙星、环丙沙星定量分析结果的准确性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。