一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，更具体的说是涉及一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法。

背景技术

叶酸(folate)是一类物质的总称，其中包括了叶酸(folic acid)及其衍生物5-甲酰四氢叶酸(5-FoTHF，亚叶酸)，5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)，5,10-亚甲基四氢叶酸和四氢叶酸(THF)等。叶酸主要影响DNA合成和DNA甲基化两个过程，一方面是尿嘧啶脱氧核苷酸(dUMP)到胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)的转化，dUMP因叶酸缺乏导致积累，而错误掺入DNA。大量掺入的dUMP在随后的DNA复制和修复过程中容易诱发基因突变、DNA单双链断裂、染色体断裂等基因组稳定性下降事件及细胞恶性转化。另一方面是5-甲基四氢叶酸在催化下将甲基转移到同型半胱氨酸上，使其转化为甲硫氨酸，随即形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM是胞嘧啶甲基化过程中的甲基供体。叶酸摄入不足将影响同型半胱氨酸代谢途径，导致DNA和RNA甲基化异常及改变基因表达，从而引发各类相关疾病的发生。

目前，叶酸检测多以化学发光法为主，常常单独测试叶酸及同型半胱氨酸，主要因为此方法具有自动化程度高，重现性好，灵敏度高等优点。但是，化学发光法无法对叶酸代谢中的多种衍生物同时进行检测。质谱平台上，以往报道多以叶酸和同型半胱氨酸、半胱氨酸等组合或叶酸与5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸等组合，都只能对叶酸代谢衍生物的其中一个影响路径指标进行测试。

因此，提供一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法，基于液相串联质谱平台全面对叶酸代谢过程中的多种关键化合物进行定量检测，方法高效，灵敏，检测下限较低，而且准确度高，能对整个叶酸代谢水平进行全面评估。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，包括如下组分：

进一步，所述校准品的组成如下：

进一步，所述质控品的组成如下：

一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法，采用液相串联质谱法：先用提取试剂对样本(校准品、质控品、血清(血浆)样本)提取纯化，然后再通过液相串联质谱仪对各个衍生物进行分离，检测。

一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法，对叶酸代谢的衍生物：叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸进行区分，并准确检测；利用所述的试剂盒进行检测，具体步骤如下：

(1)取100～200μL样本(血清、校准品或质控品)至Ep管中，加入5μL混合内标溶液后，加入500μL提取液1后涡旋振荡1min，混匀；

(2)离心后转移400～500μL上清于96孔进样板中；

(3)氮气吹干；

(4)加入100μL复溶液2复溶，覆上铝箔封膜，检测备用；

(5)将96孔进样板放入自动进样器中，准备上机；

所述上机条件如下：

①色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；

流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；

流速：450μL/min；

柱温：40℃；

进样量：5μL；

洗脱梯度如下表：

②质谱条件

在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如下表所示：

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法，通过本发明方法测试，可以对人体内叶酸代谢衍生物中的叶酸(Folic acid)、四氢叶酸(Tetrahydrofolate)、5-甲基四氢叶酸(5-Methyltetrahydrofolate)、5-甲酰四氢叶酸(Folinate)、5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-Methylenetetrahydrofolate)、S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylme-Thionine)、S-腺苷同型半胱氨酸(S-AdenosylHomocysteine)和同型半胱氨酸(Homocysteine)血清(血浆)含量进行检测；方法具有简单，快捷，专属性强，灵敏度高，检测指标全面等特点；可以在临床应用中，为了解叶酸代谢情况提供参考依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1的标准品叶酸的色谱图；

图2附图为本发明实施例1叶酸内标的色谱图；

图3附图为本发明实施例1的标准品四氢叶酸的色谱图；

图4附图为本发明实施例1的标准品5-甲基四氢叶酸的色谱图；

图5附图为本发明实施例1的标准品5-甲酰四氢叶酸的色谱图；

图6附图为本发明实施例1的标准品5,10-亚甲基四氢叶酸的色谱图；

图7附图为本发明实施例1的标准品同型半胱氨酸的色谱图；

图8附图为本发明实施例1同型半胱氨酸内标的色谱图；

图9附图为本发明实施例1的标准品S-腺苷甲硫氨酸的色谱图；

图10附图为本发明实施例1的标准品S-腺苷同型半胱氨酸的色谱图；

图11附图为本发明实施例1的标准品叠加色谱图总离子流图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试剂：所有叶酸标准品纯度均大于65％，购自Sigma-Aldrich。同位素叶酸(内标)、同型半胱氨酸(内标)均来自剑桥同位素实验室。抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇均为色谱纯，购自Sigma–Aldrich公司(St.Lous,美国)。使用Milli-Q系统(Millipore，MA，USA)制备去离子水。仪器：岛津LC-MS/MS8050CL。标准品叶酸购自macklin、5-甲基四氢叶酸购自吉至、四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸购自Sigma-Aldrich。

实施例1

一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，包括如下组分：

叶酸、叶酸内标、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、同型半胱氨酸、同型半胱氨酸内标、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸的色谱图见图1-10；标准品叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸的总离子流图见图11。其中，色谱图的横坐标为时间，单位min；纵坐标为响应值。

配制方法为：

①PBS缓冲液：

称取磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加入去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容至1L即得。

②5％牛血清白蛋白溶液(5％BSA溶液，模拟人血清)：

称取适量牛血清白蛋白，按50mg/mL加入PBS缓冲液溶解，混匀即得。

③三联抗氧化剂：

称取抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇(DTT)适量，加入甲醇，分别配制成1mg/mL甲醇溶液。然后按抗坏血酸：柠檬酸：DTT：水＝1：1：1：7配制成浓度为100μg/mL的三联抗氧化剂。

④储备液配制

称取适量各标准品叶酸、叶酸内标、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸、同型半胱氨酸内标，分别加入三联抗氧化剂配制成1mg/mL的各储备液。

⑤内标准品溶液配制

取叶酸内标和同型半胱氨酸内标储备液，用三联抗氧化剂稀释成叶酸内标浓度为1μg/mL，同型半胱氨酸内标浓度为20μg/mL的内标准品溶液(混合内标溶液)。

⑥校准品

先将各储备液配制成梯度混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：5％牛血清白蛋白溶液＝1：99配制成如下浓度校准品：

⑦质控品

先将各储备液配制成2个混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：5％牛血清白蛋白溶液＝1：99配制成如下浓度质控品：

⑧提取液1

配制含100μg/mL抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的甲醇溶液，即为提取液1。

⑨复溶液2

配制含100μg/mL抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的10％乙腈溶液，即为复溶液2。

实施例2一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法

(1)样本采集

按照现行静脉血采集方法空腹采血(血清或血浆)，所有样本应当按照血源性传染病标本对待。

(2)样本处理

取100～200μL样本(血清、校准品或质控品)至Ep管中，加入5μL内标准品溶液后，再加入500μL提取液1后涡旋振荡1min，混匀。离心后转移400μL上清于96孔进样板中。氮气吹干。加入100μL复溶液2复溶，覆上铝箔封膜，检测备用。将96孔进样板放入自动进样器中，准备上机。

(3)上机条件

①色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；

流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；

流速：450μL/min；

柱温：40℃

进样量：5μL

洗脱梯度如下表：

②质谱条件

在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如下表所示：

(4)方法学考察

①标准曲线及质控品控制

本方法采用内标进行定量：5-甲基四氢叶酸，5-甲酰四氢叶酸，5,10-亚甲基四氢叶酸，叶酸，四氢叶酸均共用叶酸内标；S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸共用同型半胱氨酸内标。

以校准品待测物峰面积与对应内标峰面积的比值作为纵坐标(y)，以各校准品的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线y＝bx+a。标准曲线拟合后，相关系数r﹥0.99。

质控品测试准确度应符合85％～115％。

标准曲线范围如下表：

结果如下表：

②检测限及定量限考察

取标准曲线下限样品校准品C1，以5％牛血清白蛋白溶液1：1稀释，再进行前处理，以检测限信噪比3：1，及定量限信噪比10：1进行考察，定量限浓度样本再重复取样6份进行考察，CV值应＜20％。结果见下表：

③精密度考察

3个浓度精密度样本平行取样12份，测试结果代入标准曲线中，计算出浓度，CV值应≤15％。结果见下表：

④回收率考察

配制3个浓度混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：血清样本＝1：99加入血清中，通过上述前处理及测试，计算出回收率，各浓度回收率应≥80％，≤120％。结果见下表：

(5)样本检测

通过对20名检测者按本发明方法进行检测，检测建立范围如下：

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。