一种橡胶草叶绿体提取方法

技术领域

本发明属于植物组织鉴定技术领域，尤其涉及一种橡胶草叶绿体提取方法。

背景技术

橡胶草其中甲羟戊酸(MVA)途径中用于调节天然橡胶生物合成，橡胶草是二倍体(2n＝16)，具有相对简单的基因组，长度为1.29Gb，其中包含46,731个预测的蛋白质编码基因，橡胶草根含有高分子量橡胶分子，其特性与巴西橡胶树的橡胶胶乳相当，可以作为一种替代橡胶作物，橡胶草根的橡胶含量高，占其总干重的3％至28％，它们也是菊粉的新来源(线性β-(2-1)-连锁果聚糖)。此外，橡胶草可以在相对较短的生命周期中在寒冷和温带地区广泛生长，并且易于收获和进行遗传转化，因此可以用作发明小麦基因功能的理想模型植物以及天然橡胶的生物合成材料。

叶绿体是行使光合作用的细胞器,皮层叶绿体的结构的基础。完整叶绿体的获得是开展叶绿体能量转化、电子传递﹑碳固定及下游组学研究的前提,但关于橡胶草叶绿体的提取尚为空白,严重制约了皮层光合作用的生理和分子机制的研究,因此,以橡胶草为材料,建立橡胶草叶绿体的提取纯化体系,将在细胞器、亚细胞器和分子水平上推动橡胶草光合作用机制的研究。因此需要一种橡胶草叶绿体提取方法。

发明内容

本发明提供一种应用于橡胶草叶绿体的提取纯化的橡胶草叶绿体提取方法。

本发明包括以下步骤：

A采集橡胶草植物的完整叶片；

B将所述叶片组织破碎后进行初提得到橡胶草叶绿体粗提液；

C在细胞分离液的上层加入所述橡胶草叶绿体粗提液后在4℃，进行第一次超高速离心10-15min；

D离心结束后在吸取所述细胞分离液的的沉淀，用叶绿体提取液清洗沉淀后进行第二次超高速离心12min，沉淀即可得完整橡胶草叶绿体。

所述初提的方法包括在所述叶片组织中按照重量比为100：1加入PVPP粉末充分研磨，在所述叶片组织的研磨样品中按照每克样品加入5mL叶绿体提取液，过滤研磨液加入叶绿体提取液。

进一步地，提取液的配置方法包括将0.3mM/L山梨醇，5mM/L乙二胺四乙酸EDTA，1mM/LMgCL

进一步地，所述细胞分离液按照由下至上依次铺70％浓度的细胞分离液1mL、50％浓度的细胞分离液2mL、30％浓度的细胞分离液3mL、10％浓度的细胞分离液4mL，最上面层加入1mL所述叶绿体粗提液。

进一步地，所述超速离心为转速为8000RCF。

本发明的有益效果为：

本发明可以应用于橡胶草叶绿体分离，还可以提取菊科或同属科植物的叶绿体，既适于从一般的植物材料收取，还可用于顽拗植物叶片的叶绿体分离。

附图说明

图1本发明的流程示意图；

图2是本实施例中橡胶草叶绿体提取3次生物学重复验证对比图；

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图1所示，本发明包括以下步骤：

A采集橡胶草植物的完整叶片；

配置叶绿体提取液：

准备山梨醇(0.3mM/L)，乙二胺四乙酸EDTA(5mM/L)，LMgCL

将上述试剂按照体积比1:1:1:1:2混合后，用ddH

叶绿体层析液配置(100mL体系，利用Sigma-Aldrich公司生产的Percoll多用途密度梯度细胞分离液)：Percoll70％溶液Percoll50％溶液，Percoll30％溶液，Percoll10％溶液，获取的叶绿体提取液4℃保存。

B将所述叶片组织破碎后进行初提得到橡胶草叶绿体粗提液；

在本实施例子中，叶绿体提取全程要在进行(低温)冰上保持4℃进行，取10g新鲜橡胶草植物叶片，剪碎至于研钵中，加入样品克数0.1g的PVPP粉末，每克样品加入5mL叶绿体提取液，充分研磨；用中间8-10层纱布过滤研磨液，滤液于4℃，800RCF离心3min；将上清液转移新管中，离心机4℃，5000RCF超高速离心5min，离心后留沉淀；

将沉淀物中加入5-6mL叶绿体提取液，充分悬浮沉淀，制成橡胶草叶绿体粗提液；

C在细胞分离液的上层加入所述橡胶草叶绿体粗提液后在4℃，进行第一次超高速离心10-15min；

取15mL离心管，由下至上依次铺70％Percoll1mL→

50％Percoll2mL→30％Percoll3mL→10％Percoll4mL，最上面铺1mL叶绿体粗提液，4℃，8000RCF超高速离心12min；

C离心结束后在吸取所述细胞分离液的的沉淀，用叶绿体提取液清洗沉淀后进行第二次超高速离心12min，沉淀即可得完整橡胶草叶绿体；

胶头滴管吸取位于Percoll50％～30％之间墨绿颜色的沉淀，至于新离心管中，再用叶绿体提取液清洗沉淀2次，清洗完后8000RCF超高速离心12min，沉淀即可得橡胶草叶绿体，将沉淀于-80℃保存备用。

获得叶绿体沉淀后，吸取叶绿体，放于光学显微镜下镜检，叶绿体完整性是否合格。随后将叶绿体放置于-80℃保存备用。

如图2所示，镜检观察橡胶草叶绿体个体分明，叶绿体分布比较分散，组织残渣较少，证明此方法提取效率较高。综合以上实验结果，此方法提取橡胶草叶片得率较高，可适用于橡胶草叶绿体基因组提取和叶绿体方面的相关研究。尤其是植物种质资源筛选，SSR定位，以及农业核心种质资源基因定位等方面具有一定理论基础，本发明可以应用于橡胶草叶绿体分离，还可以提取菊科或同属科植物的叶绿体，既适于从一般的植物材料收取，还可用于顽拗植物叶片的叶绿体分离。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。