红景天苷在制备抑制细菌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种红景天苷抑制诸如大肠杆菌、金葡菌、耐甲氧西林金葡菌的方法和应用。

背景技术

细菌感染是由于细菌引起的感染性疾病，任何年龄的儿童和成人都可能发生细菌感染。细菌可以感染身体的任何区域，包括皮肤、膀胱、肺、肠、脑等。细菌感染也会在血液中传播，导致脓毒血症。在免疫力低下的人群，比如粒细胞减少症病患者、器官移植患者以及后天免疫功能缺失患者中，细菌感染会立即危及生命。大肠杆菌是一种革兰阴性菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。感染大肠杆菌后不仅会引起腹泻、呕吐、胃痉挛、低烧，还会导致出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症。溶血性尿毒综合症是一种严重的疾病，有时甚至会致命，能导致胃衰竭、贫血及内出血。对幼儿、长者、免疫系统低下者，以及孕妇等构成的伤害尤其严重。金黄色葡萄球菌是一种格兰阳性菌，在空气、水、土壤等外环境中广泛存在，人和动物的鼻腔、咽喉、皮肤和肠道中金葡菌的携带率也较高。在一定条件下，金葡菌可致人体局部及全身感染并引起中毒性休克。凡对甲氧西林、苯唑西林、头孢拉定耐药或Mec基因阳性的金黄色葡萄球菌定义为耐甲氧西林金葡菌。随着抗生素的广泛应用和滥用，耐甲氧西林金葡菌的感染率也在逐年增高。近几年耐甲氧西林金葡菌的检出率正在逐年上升，国内多家医院报道耐甲氧西林金葡菌达到53.88-84.6％，已成为院内感染的重要病原菌之一。因而，耐甲氧西林金葡菌感染、乙型肝炎和获得性免疫缺陷综合征同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。

由于抗生素的广泛应用和滥用，使得耐药菌的种类和数量越来越多。为了减少抗生素的使用，并且应对不断增长的微生物耐药性的威胁，寻求一种可替代抗生素治疗的方法具有重要意义。

红景天被称为高原人参，首次记录于《四部医典》中，药典记载红景天具有益气活血、通脉平喘功效，可用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘。红景天苷是红景天的主要活性成分，到目前为止，尚未发现有红景天苷用于治疗大肠杆菌、金葡菌、耐甲氧西林金葡菌感染的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明目的之一是基于上述问题，提供一种抑制细菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种抑制大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌的方法，将红景天苷与所述大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌进行接触。抑制细菌的方法分为体外的方法和体内的方法。

进一步，所述红景天苷浓度为60uM。

具体的，所述红景天苷接触所述大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌24小时，所述大肠杆菌菌落数相较于空白组对照组降低37±19％；所述金葡菌菌落数相较于空白组对照组降低68±20％；所述耐甲氧西林金葡菌菌落数相较于空白组对照组降低64±10％，所述空白对照组为大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌中添加等量于红景天苷的PBS。

本发明目的之二是发现红景天苷在制备治疗细菌感染的药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

红景天苷在制备治疗细菌感染的药物中的应用。所述细菌为大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌

进一步，所述红景天苷接触所述大肠杆菌和/或金葡菌和/或耐甲氧西林金葡菌24小时，所述大肠杆菌菌落数降低37±19％；所述金葡菌菌落数降低68±20％；所述耐甲氧西林金葡菌菌落数降低64±10％。

进一步，所述红景天苷处理所述大肠杆菌24小时，所述中性粒细胞数低于15×106；所述MCP-1含量低于40pg/ml；所述IL-6含量低于30pg/ml；所述TNF-α含量低于25pg/ml；所述IL-1β含量低于30pg/ml。

进一步，所述红景天苷处理金葡菌24小时，所述中性粒细胞数低于10×10

进一步，所述红景天苷处理所述耐甲氧西林金葡菌24小时，所述中性粒细胞数低于10×105；所述MCP-1含量低于100pg/ml；所述IL-6含量低于20pg/ml；所述TNF-α含量低于10pg/ml；所述IL-1β含量低于5pg/ml。

本发明目的之三是发现红景天苷在制备中性粒细胞增殖和炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β分泌抑制药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

红景天苷在制备中性粒细胞增殖和炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α、IL-1β分泌抑制药物中的应用。

进一步，所述红景天苷处理大肠杆菌24小时，所述中性粒细胞数低于15×10

进一步，所述红景天苷处理金葡菌24小时，所述中性粒细胞数低于10×10

进一步，所述红景天苷处理耐甲氧西林金葡菌24小时，所述中性粒细胞数低于10×10

进一步，所述红景天苷在小鼠机体内使用量为40mg/kg。

本发明的有益效果在于：

发现了红景天苷可应用于制备治疗大肠杆菌感染、金葡菌感染以及耐甲氧西林金葡菌感染药物中应用。通过动物实验证明，红景天苷的确可减轻大肠杆菌感染、金葡菌感染以及耐甲氧西林金葡菌感染。本发明为红景天苷用于制备治疗大肠大肠杆菌感染、金葡菌感染以及耐甲氧西林金葡菌感染的后续研究提供了基础药理学依据。

附图说明

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

图1：大肠杆菌感染处理后中性粒细胞数；

图2：大肠杆菌感染处理后细菌菌落数；

图3：大肠杆菌感染处理后炎症因子MCP-1含量；

图4：大肠杆菌感染处理后炎症因子IL-6含量；

图5：大肠杆菌感染处理后炎症因子TNF-α含量；

图6：大肠杆菌感染处理后炎症因子IL-1β含量；

图7：红景天苷组和PBS组体外吞噬大肠杆菌实验中BacLightgreen的平均荧光强度；

图8：金葡菌感染处理后中性粒细胞数；

图9：金葡菌感染处理后细菌菌落数；

图10：金葡菌感染处理后炎症因子MCP-1含量；

图11：金葡菌感染处理后炎症因子IL-6含量；

图12：金葡菌感染处理后炎症因子TNF-α含量；

图13：金葡菌感染处理后炎症因子IL-1β含量；

图14：金葡菌感染处理后浸润程度；

图15：红景天苷组和PBS组体外吞噬金葡菌实验中BacLightgreen的平均荧光强度；

图16：耐甲氧西林金葡菌感染处理后中性粒细胞数；

图17：耐甲氧西林金葡菌感染处理后细菌菌落数；

图18：耐甲氧西林金葡菌感染处理后炎症因子MCP-1含量；

图19：耐甲氧西林金葡菌感染处理后炎症因子IL-6含量；

图20：耐甲氧西林金葡菌感染处理后炎症因子TNF-α含量；

图21：耐甲氧西林金葡菌感染处理后炎症因子IL-1β含量；

图22：耐甲氧西林金葡菌感染处理后浸润程度；

图23：红景天苷组和PBS组体外吞噬耐甲氧西林金葡菌实验中BacLightgreen的平均荧光强度。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1红景天苷治疗大肠杆菌感染的作用

通过腹腔注射大肠杆菌致小鼠感染炎症，给予不同的处理并分组，随后检测小鼠腹腔中性粒细胞数量、大肠杆菌菌落数以及炎症因子水平，以验证红景天苷可以抑制大肠杆菌感染，其效果与抗生素相当。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

抗生素组：给予12.5mg/kg环丙沙星治疗

红景天苷组：给予红景天苷40mg/kg治疗

3实验方法

给予小鼠实验动物用乙醚麻醉，腹腔注射大肠杆菌(5x10

为了考察红景天苷对大肠杆菌感染是否有治疗作用，治疗后24小时处死小鼠，使用1mlPBS灌洗小鼠腹腔获取灌洗液计算总细胞数并离心，荧光标记Ly6G抗体标记中性粒细胞，通过流式细胞术检测F4/80+以及Ly6G+细胞群，计算中性粒细胞数，离心后的上清采用流式细胞术检测腹腔灌洗液中炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，采用涂布平板法计算大肠杆菌菌落数，以检测不同方法治疗大肠杆菌感染的治疗效果。

4.统计学方法

数据采用平均值±标准差表示，用GraphPad prism8.0进行单因素方差分析(ordinary one-way ANOVA)，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

结果如图1-6所示，与PBS组对比，红景天苷组以及抗生素组的中性粒细胞数、菌落数以及炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β都明显降低，红景天苷组细菌菌落数2.32x10

实施例2红景天苷体外促进巨噬细胞吞噬大肠杆菌

通过在体外培养的巨噬细胞中加入PBS或红景天苷预处理，再加入分子探针BacLightgreen标记的大肠杆菌，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，检测巨噬细胞对大肠杆菌吞噬能力。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

红景天苷组：给予红景天苷治疗

3实验方法

实验动物用乙醚麻醉后腹腔注射1.5毫升浓度为3％的巯基乙酸培养基。72小时后，用5毫升PBS灌洗小鼠腹腔，离心取得腹膜炎细胞，将上述细胞置于已经含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液的低粘附培养皿中培养12小时，去除悬浮细胞留下即为原代的小鼠腹腔巨噬细胞。给予PBS孵育24小时的巨噬细胞为PBS组；给予红景天苷(60uM)孵育的巨噬细胞为红景天苷组。

为了考察红景天苷在体外对巨噬细胞吞噬大肠杆菌能力的影响，取上述巨噬细胞，加入分子探针BacLightgreen标记的大肠杆菌体外孵育30分钟(细胞与细菌比例为：1:10)，收取巨噬细胞后采用荧光标记F4/80抗体标记巨噬细胞，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，以反映巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力。结果以相对值表示，结果如图7所示。

实施例3红景天苷治疗金葡菌感染的作用

通过采用皮肤囊腔注射金葡菌诱导小鼠皮肤金葡菌感染，给予不同的处理并分组，随后检测小鼠腹腔中性粒细胞数量、金葡菌菌落数以及炎症因子水平，以验证红景天苷可以抑制金葡菌感染，其效果与抗生素相当。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

抗生素组：给予50mg/kg万古霉素治疗

红景天苷组：给予红景天苷40mg/kg治疗

3实验方法

给予小鼠背部皮下注射2ml空气制造一个囊腔，3天后在囊腔处再注射2ml空气。3天后，将所需量金黄色葡萄球菌、红景天苷或万古霉素混于0.5mlPBS中，实验动物用乙醚麻醉，皮肤囊腔注射耐金黄色葡萄球菌(2x10

为了考察红景天苷对金葡菌感染是否有治疗作用，治疗后24小时处死小鼠，使用1mlPBS灌洗小鼠皮肤囊腔获取灌洗液计算总细胞数并离心，荧光标记Ly6G抗体标记中性粒细胞，通过流式细胞术检测F4/80+以及Ly6G+细胞群，计算中性粒细胞数，离心后的上清采用流式细胞术检测腹腔灌洗液中炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，采用涂布平板法计算金黄色葡萄球菌菌落数，使用HE染色观察皮肤的炎症浸润程度。以检测不同方法治疗金黄色葡萄球菌感染的治疗效果。

4.统计学方法

数据采用平均值±标准差表示，用GraphPad prism8.0进行单因素方差分析(ordinary one-way ANOVA)，***P≤0.001，****P≤0.0001.

结果如图7-13所示，与PBS组对比，红景天苷组和抗生素组的中性粒细胞数、菌落数以及炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β都明显降低，红景天苷组细菌菌落数228c.f.u.,相较于PBS空白组708，降低了约68％左右，HE染色显示炎症细胞浸润程度轻，表明红景天苷对金葡菌感染有治疗作用；与抗生素组相比，红景天苷组的中性粒细胞数、菌落数、炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β无明显差异，HE皮肤染色显示炎症细胞浸润程度无明显差异，表明红景天苷与万古霉素的效果基本相当。

实施例4红景天苷体外促进巨噬细胞吞噬金葡菌

通过在体外培养的巨噬细胞中加入PBS或红景天苷预处理，再加入分子探针BacLightgreen标记的金葡菌，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，检测巨噬细胞对金葡菌吞噬能力。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

红景天苷组：给予红景天苷治疗

3实验方法

实验动物用乙醚麻醉后腹腔注射1.5毫升浓度为3％的巯基乙酸培养基。72小时后，用5毫升PBS灌洗小鼠腹腔，离心取得腹膜炎细胞，将上述细胞置于已经含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液的低粘附培养皿中培养12小时，去除悬浮细胞留下即为原代的小鼠腹腔巨噬细胞。给予PBS孵育24小时的巨噬细胞为PBS组；给予红景天苷(60uM)孵育的巨噬细胞为红景天苷组。

为了考察红景天苷在体外对巨噬细胞吞噬金葡菌能力的影响，取上述巨噬细胞，加入分子探针BacLightgreen标记的金葡菌体外孵育30分钟(细胞与细菌比例为：1:10)，收取巨噬细胞后采用荧光标记F4/80抗体标记巨噬细胞，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，以反映巨噬细胞对金葡菌的吞噬能力。结果以相对值表示，结果如图15所示。

实施例5红景天苷治疗耐甲氧西林金葡菌感染的作用

通过采用皮肤囊腔注射金葡菌诱导小鼠皮肤耐甲氧西林金葡菌感染，给予不同的处理并分组，随后检测小鼠腹腔中性粒细胞数量、耐甲氧西林金葡菌菌落数以及炎症因子水平，以验证红景天苷可以抑制耐甲氧西林金葡菌感染，其效果与抗生素相当。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

红景天苷组：给予红景天苷40mg/kg治疗

抗生素组：给予50mg/kg万古霉素治疗

3实验方法

给予小鼠背部皮下注射2ml空气制造一个囊腔，3天后在囊腔处再注射2ml空气。3天后，将所需量耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、红景天苷或万古霉素混于0.5mlPBS中，实验动物用乙醚麻醉，皮肤囊腔注射耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(2x105c.f.u)，2小时后，皮肤囊腔注射0.5mlPBS为PBS组；给予红景天苷(40mg/kg)治疗为红景天苷组；给予50mg/kg万古霉素治疗为抗生素组。

为了考察红景天苷对耐甲氧西林金葡菌感染是否有治疗作用，治疗后24小时处死小鼠，使用1mlPBS灌洗小鼠皮肤囊腔获取灌洗液计算总细胞数并离心，荧光标记Ly6G抗体标记中性粒细胞，通过流式细胞术检测F4/80+以及Ly6G+细胞群，计算中性粒细胞数，离心后的上清采用流式细胞术检测腹腔灌洗液中炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，采用涂布平板法计算耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌落数，使用HE染色观察皮肤的炎症浸润程度。以检测不同方法治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗效果。

4.统计学方法

数据采用平均值±标准差表示，用GraphPad prism8.0进行单因素方差分析(ordinary one-way ANOVA)，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001.

结果如图14-20所示，与PBS组对比，红景天苷组的中性粒细胞数、菌落数以及炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β都明显降低，红景天苷组细菌菌落数278,相较于PBS空白组770，降低了约64％左右，HE染色显示炎症细胞浸润程度轻，表明红景天苷对耐甲氧西林金葡菌感染有治疗作用；与抗生素组相比，红景天苷组的中性粒细胞数、菌落数、炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β无明显差异，HE皮肤染色显示炎症细胞浸润程度无明显差异，表明红景天苷与万古霉素的效果基本相当。

实施例6红景天苷体外促进巨噬细胞吞噬耐甲氧西林金葡菌

通过在体外培养的巨噬细胞中加入PBS或红景天苷预处理，再加入分子探针BacLightgreen标记的耐甲氧西林金葡菌，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，检测巨噬细胞对耐甲氧西林金葡菌吞噬能力。

1动物

C57/BL6小鼠，雄性，10-12周龄、体重20-25克，购于第三军医大学实验动物中心，正常饲养于清洁动物房。

2实验分组

PBS组：给予PBS治疗

红景天苷组：给予红景天苷治疗

3实验方法

实验动物用乙醚麻醉后腹腔注射1.5毫升浓度为3％的巯基乙酸培养基。72小时后，用5毫升PBS灌洗小鼠腹腔，离心取得腹膜炎细胞，将上述细胞置于已经含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液的低粘附培养皿中培养12小时，去除悬浮细胞留下即为原代的小鼠腹腔巨噬细胞。给予PBS孵育24小时的巨噬细胞为PBS组；给予红景天苷(60uM)孵育的巨噬细胞为红景天苷组。

为了考察红景天苷在体外对巨噬细胞吞噬耐甲氧西林金葡菌能力的影响，取上述巨噬细胞，加入分子探针BacLightgreen标记的耐甲氧西林金葡菌体外孵育30分钟(细胞与细菌比例为：1:10)，收取巨噬细胞后采用荧光标记F4/80抗体标记巨噬细胞，通过流式细胞术检测巨噬细胞中BacLightgreen的平均荧光强度，以反映巨噬细胞对耐甲氧西林金葡菌的吞噬能力。结果以相对值表示，结果如图23所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。