PaCas9核酸酶

发明领域

本发明涉及生物技术、分子生物学和医学领域，特别是涉及核酸酶及其用途。更具体地讲，本发明涉及PaCas9核酸酶。本发明还涉及编码所述核酸酶的核酸；包含所述核酸的遗传构建体、表达载体、递送载体；包含所述核酸酶或编码所述核酸酶的核酸的脂质体；用于产生核酸酶的方法；用于递送的方法；以及包含编码所述核酸酶的核酸的宿主细胞。

背景

在2007年，首次证明CRISPR-Cas为许多细菌和大多数古细菌中的一种适应性免疫系统(Barrangou等人, 2007, Science 315: 17091712, Brouns等人 , 2008, Science321: 960-964)。基于功能和结构标准，到目前为止已表征3种类型的CRISPR-Cas系统，其中大多数使用小RNA分子作为引导以靶向互补DNA序列(Makarova等人, 2011, Nat RevMicrobiol 9: 467-477, Van der Oost等人 , 2014, Nat Rev Microbiol 12: 479-492)。

在由Doudna/Charpentier实验室进行的一项最近研究中，对II型CRISPR-Cas系统(Cas9)的效应酶进行了充分表征，包括证明设计的CRISPR RNA引导(具有特定间隔序列)的引入靶向质粒上的互补序列(前间隔序列)，导致该质粒的双链断裂(Jinek等人 , 2012,Science 337: 816- 821)。后来，Jinek等人, 2012将Cas9用作基因组编辑的工具。

Cas9已被用于改造一系列真核细胞(例如鱼、植物、人)的基因组(Charpentier和Doudna, 2013, Nature 495: 50-51)。

此外，Cas9已被用于通过选择专用的重组事件来提高细菌中同源重组的产率(Jiang等人, 2013, Nature Biotechnol 31: 233-239)。为了实现这一点，将毒性片段(靶向构建体)与携带期望的改变的拯救片段(编辑构建体，携带点突变或缺失)一起共转染。靶向构建体由Cas 9与设计CRISPR和抗生素抗性标记(定义宿主染色体上期望重组的位点)的组合组成；在存在相应抗生素的情况下，选择靶向构建体在宿主染色体中的整合。只有当编辑构建体与宿主染色体上其他位置的CRISPR靶位点发生另外的重组时，宿主才能逃脱自身免疫问题。因此，在存在抗生素的情况下，只有期望的(无标记的)突变体才能存活和生长。还提出了选择随后从染色体中去除整合的靶向构建体的相关策略，从而产生真正的无标记突变体。

近年来已经确定，CRISPR-Cas介导的基因组编辑构成基因工程的有用工具。已经确定原核CRISPR系统作为适应性免疫系统供给其宿主(Jinek等人, 2012, Science 337:816-821)，并且可用于快速有效的基因工程(例如Mali等人 , 2013, Nat Methods 10:957-963)，仅需要修饰引导序列以靶向目标序列。

然而，继续需要开发在各种实验条件下具有改进的序列特异性核酸检测、切割和操纵的试剂，以用于基因研究和基因组编辑领域。

发明简述

本发明涉及具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶。

一方面，本发明涉及一种编码PaCas9核酸酶的分离的核酸分子，其具有SEQ IDNO: 1的核苷酸序列。

一方面，本发明涉及一种表达载体，其包含具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸。

在一些实施方案中，表达载体为如图1所示的遗传构建体PpCas9-T2A-GFP-sgRNA1-MCS-sgRNA2-MCS。

一方面，本发明涉及一种递送治疗剂的载体，所述治疗剂包含具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸。

在本发明的一个实施方案中，载体将治疗剂递送至靶细胞或靶组织。

一方面，本发明涉及一种递送治疗剂的脂质体，所述治疗剂包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶或具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核酸。

在本发明的一个实施方案中，脂质体将治疗剂递送至靶细胞或靶组织。

一方面，本发明涉及一种用于使用以上载体或以上脂质体将治疗剂递送至靶细胞或靶组织的方法。

在方法的一个实施方案中，通过将以上载体或以上脂质体给予哺乳动物体内而将治疗剂递送至靶细胞或靶组织。

一方面，本发明涉及一种用于产生宿主细胞的方法，该宿主细胞产生具有SEQ IDNO: 2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，所述方法包括使用任何以上载体转化所述细胞。

一方面，本发明涉及一种用于产生PaCas9核酸酶的方法，所述方法包括在足以产生所述PaCas9核酸酶的条件下，在生长培养基中培养以上宿主细胞，如果必要的话，随后分离和纯化所获得的PaCas9核酸酶。

附图简述

图1. 旨在于哺乳动物细胞中产生PpCas9核酸酶的质粒PpCas9-T2A-GFP-sgRNA1-MCS-sgRNA2-MCS的环状图式。

AmpR为提供对氨苄青霉素的抗性的β-内酰胺酶基因，

CMV启动子为巨细胞病毒早期基因的启动子，

Kozak序列旨在提高蛋白的翻译效率，

START密码子为起始密码子，

NLS是指核定位信号(NLS)，

PaCas9为SEQ ID NO: 1的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶，

FLAG为用于蛋白检测的FLAG表位序列，

GFP为修饰的绿色荧光蛋白，

TK pA是指用于增加mRNA稳定性的胸苷激酶多聚-A信号序列，

F1 ori为复制起点，其允许在与辅助噬菌体一起共转化时将噬菌粒包装成噬菌体颗粒，

polIII终止子+ U6启动子是指用于表达小RNA分子的盒，每个盒含有U6启动子和RNA聚合酶III转录终止子。

pUC起点为细菌中的pUC复制起点。

图2. 具有结构域分布的PaCas9核酸酶的氨基酸序列。

发明描述

定义和一般方法

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数和复数术语应包括单数。一般地，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学以及蛋白质和核酸的杂交和化学的分类和方法为众所周知的并且被本领域技术人员广泛使用。酶反应和纯化方法根据制造商的说明书如本领域中常见的或如本文所述进行。

“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括灵长类、人类、啮齿动物、狗、猫、牛、小牛、马、猪等。

核酸酶

核酸酶为一组广泛的水解核酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。

取决于其特异性和活性，核酸酶可具有以下类型：外切核酸酶和内切核酸酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶、限制性酶等。限制性酶为应用分子生物学中的重要元素。

PaCas9核酸酶涉及脱氧核糖核酸酶的类型。

当与至少一种识别靶序列的RNA分子结合时，PaCas9核酸酶能够切割包含靶核酸序列的DNA。

PaCas9核酸酶包含两个内切核酸酶结构域，其一个接一个地造成单链断裂，并且当一起作用时则造成双链断裂。

PaCas9核酸酶为II型CRISPR-Cas系统的效应酶(2型核酸酶)。

PaCas9核酸酶能够以高度特异性识别位点(16-20个字母)造成双链DNA断裂。

PaCas9核酸酶的DNA以SEQ ID NO:1表示。

PaCas9核酸酶的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。

图2显示具有结构域分布的PaCas9核酸酶的氨基酸序列。

PaCas9核酸酶与成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)以及CRISPR-Cas系统的以下其他相邻组件缔合：crRNA和tracrRNA序列。

编码tracrRNA的核苷酸序列以SEQ ID NO:3表示。

编码同向重复序列DR的核苷酸序列以SEQ ID NO:4表示。

crRNA由靶标依赖性可变部分和以SEQ ID NO:4表示的同向重复序列DR组成。

本文中的术语“治疗剂”是指具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶或指编码PaCas9核酸酶并具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的分离的核酸分子。

tracrRNA (反式激活crRNA)为小的反式编码RNA。

CRISPR (成簇的规律间隔的短回文重复序列)为特殊的细菌和古细菌基因座，其由以独特序列(间隔区)间隔的同向重复序列组成。

核酸分子

在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”意指修饰或未修饰的核苷酸的精确序列，其确定核酸的片段或区域，含有或不含非天然核苷酸，并且为双链DNA或RNA、单链DNA或RNA或者所述DNA的转录产物。

此处还应包括本发明不涉及处于其天然染色体环境中(即处于天然状态)的核苷酸序列。本发明的序列已经分离和/或纯化，即例如通过拷贝而直接或间接地对其进行采样，其环境已被至少部分地改变。因此，此处还应提及通过重组遗传学(例如通过宿主细胞的方式)获得或通过化学合成获得的分离的核酸。

“分离的”核酸分子为被鉴定并与至少一种核酸分子杂质分离的核酸分子，前者在核酸酶核酸的天然来源中与所述杂质结合。分离的核酸分子不同于其中在天然条件下发现其的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括位于正常表达抗体的细胞中的核酸分子，例如，如果核酸分子的染色体定位不同于其在天然条件下于细胞中的定位的话。

除非另外规定，否则术语“核苷酸序列”涵盖其互补物。因此，具有特定序列的核酸应理解为涵盖具有其互补序列的其互补链的核酸。

术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，其为“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接于所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其可操作地连接于编码序列。通常，“可操作地连接的”意指所连接的DNA序列为连续的，并且在分泌前导的情况下为连续的并处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。

载体

如本文使用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体为质粒，即其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA片段。在一些实施方案中，载体为病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。在一些实施方案中，载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在进一步的实施方案中，载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。

一方面，本发明涉及适合于表达本文所述的任何核苷酸序列的载体。

本发明涉及包含编码PaCas9核酸酶的核酸分子的载体。

在一些实施方案中，本发明的PaCas9核酸酶通过将DNA插入到表达载体中，使得基因在功能上连接于必要的表达控制序列，比如转录和翻译控制序列来表达。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒(比如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒)、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等。可将DNA分子连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节DNA的转录和翻译的功能。可选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。DNA分子可通过标准方法(例如PaCas9核酸酶基因片段和载体上互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点的话则平末端连接)引入到表达载体中。

除PaCas9核酸酶基因之外，本发明的重组载体表达还可携带控制宿主细胞中PaCas9核酸酶基因的表达的调控序列。本领域的技术人员将理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可能取决于因素比如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白的表达水平等。用于在哺乳动物中的表达宿主细胞的优选控制序列包括确保在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，比如衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV) (比如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40) (比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒的主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒的启动子和/或增强子，和强哺乳动物启动子比如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。对于病毒控制元件及其序列的进一步描述，参见例如美国专利号5,168,062、4,510,245和4,968,615。用于在细菌细胞或真菌细胞(例如酵母细胞)中表达多肽的方法也为本领域众所周知的。

除PaCas9核酸酶基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可携带另外的序列，比如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药剂(比如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。例如，选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在甲氨蝶呤选择/扩增期间用于dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。

如本文使用的术语“表达控制序列”旨在是指实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，比如剪接和多聚腺苷酸化信号； 稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；以及在需要时增强蛋白分泌的序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，一般地这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括至少所有组件，其存在对于表达和加工是必不可少的；并且还可包括另外的组件，其存在是有利的，例如前导序列和融合配偶体序列。

宿主细胞

如本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在是指已引入重组表达载体的细胞。本发明涉及的宿主细胞可包含例如以上描述的本发明载体。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅旨在是指特定的主题细胞，而且还指这种细胞的后代。由于可能由于突变或环境影响而在后代中发生改变，因此这种后代实际上可能与亲代细胞不同，然而，这种细胞仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。

本发明的编码PaCas9核酸酶的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物或其细胞、植物或其细胞、细菌或酵母宿主细胞。转化可通过用于将多核苷酸引入到宿主细胞的任何已知技术来进行。用于将异源性多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法为本领域众所周知的，并且包括葡聚糖介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合物转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、将多核苷酸包封于脂质体中和将DNA直接显微注射到细胞核中。另外，核酸分子可通过病毒载体引入到哺乳动物细胞中。用于转染细胞的方法为本领域众所周知的。参见例如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。用于转化植物细胞的方法为本领域众所周知的，包括例如农杆菌介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也为本领域众所周知的。

用作转化宿主的哺乳动物细胞系为本领域众所周知的，并且包括多种可用的永生化细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平和提供所产生的蛋白的必要特性来选择。可使用的其他细胞系为昆虫细胞系，比如Sf9或Sf21细胞。当将编码PaCas9核酸酶的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许PaCas9核酸酶在宿主细胞中表达，或者更优选地分泌PaCas9核酸酶到宿主细胞在其中生长的培养基中的一段时间来产生PaCas9核酸酶。可使用标准蛋白纯化技术从培养基中分离PaCas9核酸酶。植物宿主细胞包括例如烟草(Nicotiana)、拟南芥(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

此外，可使用多种已知技术来提高从生产细胞系产生本发明PaCas9核酸酶的水平。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为用于在某些条件下提高表达的常用方法。GS系统结合EP号0216846、0256055、0323997和0338841全部或部分地进行讨论。

从不同细胞系或从转基因动物获得的PaCas9核酸酶可能彼此相比较具有不同的糖基化特征。然而，不管糖基化状态如何，并且通常不管翻译后修饰存在与否，由本文描述的核酸分子编码的PaCas9核酸酶为本发明的一部分。

脂质体

一方面，本发明涉及包封具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的PaCas9核酸酶的脂质体，或涉及编码PaCas9核酸酶并具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的分离的核酸分子。

脂质体为微小的闭合囊泡，具有被一个或多个脂质双层包围的内相，并具有将水溶性材料保持在内相中和将油溶性材料保持在磷脂双层中的能力。当将活性化合物截留在脂质体中并将其递送至靶组织时，如何高效地将活性化合物截留在脂质体中以及如何确保脂质体稳定地保留活性化合物构成重要的问题。

通常，脂质体被认为是主要大小为几十纳米多至十分之几微米的颗粒，其壳容纳另一种或多种物质的分子。脂质体壳对水分子和离子为“半渗透性的”。

脂质体的特征为含有和保留不同性质的物质的能力。掺入脂质体的物质范围相当广泛，范围从无机离子和低分子量有机化合物到大的蛋白和核酸。

脂质体提供掺入载体中的物质的延长释放。

脂质体可由磷脂制成，特别是由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂、卵/大豆磷脂或其混合物制成。

实施例

提供以下实施例以更好地理解本发明。这些实施例仅出于说明的目的，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过参考结合至本文中。尽管出于清楚理解的目的已经通过说明和实例相当详细地描述了前述发明，但是鉴于本发明的教导，对于本领域的普通技术人员易于显而易见的是可对其进行某些变化和修改而不背离所附实施方案的精神或范围。

材料和一般方法

重组DNA技术

如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述，使用标准方法来操纵DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。

基因合成

从通过化学合成制备的寡核苷酸制备期望的基因区段。侧翼为单个限制性位点的300-4000 kb长的基因区段通过退火和连接寡核苷酸(包括PCR扩增)进行组装，并随后经所示的限制性位点进行克隆。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。

DNA序列测定

DNA序列通过Sanger测序测定。

DNA和蛋白序列分析及序列数据管理

Infomax's Vector NTI Advance套件8.0版用于序列创建、作图、分析、注释和说明。

表达载体

为了表达PaCas9核酸酶，使用旨在于原核细胞(大肠杆菌)中表达，于真核细胞(例如在CHO细胞)中瞬时表达的表达质粒的变体。除PaCas9核酸酶表达盒之外，载体还含有：允许所述质粒在大肠杆菌中复制的复制起点、在大肠杆菌中赋予对各种抗生素(例如氨苄青霉素和/或卡那霉素)的抗性的基因。

实施例1

PaCas9核酸酶的制备方法

为了制备宏基因组序列，从白海地区采集了Homoeodictya palmata海绵动物的样品，通过离心分级该材料，然后分离总DNA并随后进行测序。

使用生物信息学方法在宏基因组序列中检测到PaCas9蛋白的开放阅读框以及CRISPR-Cas系统的相邻组件(CRISPR盒以及crRNA和tracrRNA序列)。

PaCas9核酸酶的DNA以SEQ ID NO:1表示。

PaCas9核酸酶的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。

编码tracrRNA的核苷酸序列以SEQ ID NO:3表示。

编码同向重复序列DR的核苷酸序列以SEQ ID NO:4表示。

实施例2

克隆描述

通过生物信息学搜索获得PaCas9核酸酶基因序列。对序列进行密码子优化以确保在哺乳动物细胞中的最佳表达，并然后使用Gibson方法从化学合成的寡核苷酸从头组装。合成的PaCas9基因从CMV启动子的3’末端在遗传构建体中克隆。从基因的5’末端添加Kozak序列和核定位信号(NLS)，并从3’末端添加用于蛋白检测的FLAG表位序列。在如上列出的PaCas9序列及其缔合元件之后，将T2A元件和作为表达标记的绿色荧光蛋白(EGFP)的开放阅读框以同一阅读框置于构建体中。

在阅读框之后，从3’末端放置胸苷激酶多聚-A信号序列，以增加mRNA的稳定性。在遗传构建体的细菌皮层区域中存在两个串联的盒，用于表达小RNA分子。每个盒含有U6启动子和RNA聚合酶III转录终止子。这些盒对于表达提供PaCas9蛋白与靶DNA分子(细胞基因组)的特异性相互作用的RNA分子是必需的。构建体图如图1所示。该构建体允许表达PaCas9蛋白(其通过NLS转运至细胞核)和引导该蛋白的RNA分子(引导RNA)两者，以及通过FLAG表位检测该蛋白和通过EGFP检测来确定遗传构建体的递送效率。

实施例3

PaCas9蛋白的酶促活性

通过比较各种Cas9家族蛋白的HNH和RuvC结构域与PaCas9结构域(结构域分布如图2所示)的同源性来鉴定参与DNA/RNA酶促水解的氨基酸。在PaCas9中分离出先前显示其参与Cas9蛋白的酶促活性的保守氨基酸。因此，通过分析方法发现，该蛋白的氨基酸残基对于PaCas9蛋白的酶促活性是必需的(氨基酸-位置): D 9; E 527; H 750; D 753; H 613;N 636。

实施例4

PaCas9蛋白的酶促活性的测定

为了确定PAM (前间隔序列邻近基序)序列，我们使用重组核酸酶蛋白(SEQ IDNO: 2)、crRNA (由靶标依赖性可变部分和以SEQ ID NO:4表示的同向重复序列组成)及tracrRNA (SEQ ID NO:3)进行了切割DNA文库的体外反应。DNA文库为包含7个字母的随机序列和可识别的序列(即前间隔序列)的PCR片段。

在使PaCas9-RNA-蛋白复合物与DNA文库一起温育之后，将反应产物加载到凝胶电泳中。从凝胶中提取未切割的片段，并在Illumina平台上进行测序。比较未切割的PaCas9反应产物和对照反应物中含有的PAM序列允许确定所讨论的蛋白的PAM。

在鉴定PAM序列之后，评估体外核酸酶活性。为此，将与RNA引导复合的蛋白与携带前间隔序列和鉴定的PAM的DNA片段一起温育。确定了RNA-蛋白复合物与切割DNA的最佳比率。核酸酶活性基于PaCas9蛋白的量进行评估，该量为切割200 ng长约400个碱基对的靶DNA (含有最佳PAM)的50%所需要的。

因此，证实了PaCas9核酸酶具有酶促活性并在DNA中造成双链断裂。

此外，证实了PaCas9核酸酶能够以高度特异性识别位点(16-20个字母)在DNA中造成双链断裂。