一种基于免疫磁珠富集古代壁画三种胶结物的方法

技术领域

本发明属于文物分析检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠富集古代壁画三种胶结物的方法。

背景技术

壁画是人类社会最早的绘画活动之一，是展示古代人类社会生活和生产力发展水平的实用资料。在古代壁画中，胶结物通常作为使建筑材料具有一定黏结性的重要组成部分被添加到壁画的灰浆层和颜料层中，从而使其具有一定强度。蛋清、奶类、植物胶和动物胶是绘画中常见的胶结物。蛋清、奶类、动物胶通常是蛋白质胶结物，而植物胶如桃胶大多是多糖胶结物。由于壁画中的胶结物在光照、风砂、可溶性盐、微生物和其他外部环境的影响下容易降解，导致颜料层发生起甲、变色甚至剥落等病害。这些病害可能会导致墙面绘画的外观和内部结构发生重大变化，从而使珍贵的壁画遭受破坏。因此，了解胶结物的组成成分对于及时修复和保护壁画至关重要。由于长期受到风化的作用，壁画中胶结物的含量往往很低，并且复杂的考古样品中通常含有多种干扰物质，这些原因都使得对目标物的检测变得相当困难，并可能导致假阴性结果的出现。为了解决这个问题，有必要富集低含量的胶结物以提高检测的灵敏度。

免疫磁性分离(IMS)为实现从考古样品中富集分离胶结物提供了一种方便快捷的富集方法。IMS技术是基于一种通过抗原-抗体相互作用的免疫磁珠(IMBs)从而快速的将目标抗原从复杂的背景中分离出来的技术。免疫磁珠已经应用到了生物技术领域，实现分离富集病原菌、细胞以及核酸等目标物，能够大大提高目标物的检测效率缩短检测时间。抗体在磁珠上的固定有不同的方法，例如抗体的氨基和磁珠的羧基之间通过共价作用结合，以及proteinA/G对抗体的特异性吸附。在共价结合法中，磁珠的羧基可以通过EDC/NHS来活化，然后结合抗体的氨基。但是这种结合方式由于抗体的随机排列引起空间位阻效应会使抗体的活性被削弱从而降低富集效率。然而，proteinA/G修饰的磁珠可以避免抗体活性减弱的问题，这可以归因于proteinA/G可以特异性结合抗体的Fc区以保护抗原结合位点不被占据。proteinA含有五个能特异性结合IgG抗体分子恒定区(Fc)片段的结构域。作为一种亲和配体，对IgG抗体具有高选择性的proteinA可以与磁珠的琼脂糖基质偶联。修饰了抗体的磁珠可以在复杂的样品溶液中特异性地捕获抗原，并且可以在洗脱液的存在下破坏抗体和抗原之间的结合作用，从而达到富集抗原的目的。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提出了一种从古代壁画中富集卵清蛋白(蛋清)、酪素(奶类)及桃胶三种胶结物和通过酶联免疫吸附(ELISA)技术检测胶结物的方法，该方法可以对低浓度且在多干扰物存在情况下的胶结物进行快速高效分离富集。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种基于免疫磁珠富集古代壁画三种胶结物的方法，包括如下步骤：

1)取proteinA磁珠分别与三种抗体在室温下混合均匀，随后置于磁力架上磁性分离除去上清液，使用TBST(是TBS+吐温20的缩写,TBS是Tris-HCl缓冲盐溶液)洗涤磁珠后弃去上清液得到免疫磁珠；

2)将步骤1)所得的免疫磁珠与待测样品混合均匀，随后置于磁力架上磁性分离除去上清液，使用TBST洗涤磁珠后弃去上清液得到吸附有待测样品的免疫磁珠；

3)将步骤2)所得的吸附有待测样品的免疫磁珠中加入洗脱液，室温静置一段时间后置于磁力架上磁性分离收集洗脱液，随后加入中和液混匀。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)所述三种抗体分别为用于检测蛋清的卵清蛋白抗体、检测奶类的酪蛋白抗体以及检测桃胶的桃胶抗体。

作为进一步地改进，本发明所述卵清蛋白抗体的稀释比例为1：200～1：800，酪蛋白抗体的稀释比例为1：100～1：400，桃胶抗体的稀释比例为1：400～1：2000。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)和步骤2)所述混合均匀的时间均为1～2h。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)和步骤2)所述使用TBST为pH为6.5～7.4，包含0.05％～1％吐温20的TBS。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤2)所述待测样品为标准样品或考古样品的溶液。

作为进一步地改进，本发明所述的所述标准样品为0.001～1μg·mL

作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)所述洗脱液为pH为2.5～3.5的甘氨酸-盐酸酸性洗脱液。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)所述中和液为pH为6.5～7.4的Tris-HCl溶液。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)所述静置时间为5～15min。

静置时间不易超过15min，时间太长会导致蛋白在过于酸性条件下发生变性，失去生物活性。

本发明通过简单高效的检测分析方法实现对胶结物的有效富集，避免复杂样品中的干扰物质对目的蛋白检测分析的影响。该方法不仅实现对古代壁画中胶结物的分析检测，可以推广到对其他考古样品，如灰浆等掺有胶结物的样品。

上述的技术方案与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

1)本发明应用proteinA磁珠进修分离富集，proteinA可以特异性结合抗体的恒定区，使结合抗原的可变区充分暴露在外，抗体可“垂直的”修饰到磁珠表面，从而减小因空间位阻所带来的影响，提高免疫磁珠富集率；

2)蛋清、奶类、桃胶是中国古代壁画样品中常用的胶结物，常被添加到建筑材料中增强材料的粘结性，通过将相应的抗体偶联到磁珠上实现对古代壁画中的蛋清、奶类以及桃胶三种胶结物进行高效富集；

3)该方法不会受到古代壁画中复杂干扰物质的影响，无需特意分离其中的蛋白，能够实现从已发生老化病变的古代壁画复杂样品中分离提取富集目标胶结物；

4)由于古代壁画样品经过长时间风化，胶结物已经有不同程度的降解，直接采用ELISA方法可能出现假阴性的结果，采用本方法对胶结物进行最大程度的浓缩可避免后续ELISA分析检测可能出现的假阴性结果；

5)该方法可不限制于对古代壁画样品中的三种胶结物进行富集，对其他含有三种胶结物的考古样品也可实现蛋清、奶类、桃胶的提取。

附图说明

图1为本发明的(A)磁珠及免疫磁珠(B)的SEM图；

图2为本发明的免疫磁珠(A)SDS-PAGE和(B)ELISA表征富集效果图；

图3为本发明的免疫磁珠对古代壁画样品中胶结物的ELISA检测图。

具体实施方式

现将本发明结合附图说明和具体实施方式进一步对本申请技术方案进行更加详细的说明，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所用材料与试剂均为市售，本领域的技术人员可以从市场获得。

本发明所用proteinA磁珠、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购买于上海碧云天生物科技有限公司。

本发明所用卵清蛋白抗体购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；酪蛋白抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司；桃胶抗体由本实验室自行制备。

本发明所用TBST溶液配制方法为：取8.0g NaCl、0.2g KCl、4.0g Tris-HCl溶解于800mL超纯水中，用1M NaOH调整pH值至6.5～7.4，加0.5～10mL吐温20，定容至1000mL即得。

本发明所用0.1M甘氨酸-盐酸酸性洗脱液的配制方法为：取0.7507g甘氨酸溶于80mL超纯水中，加入1M盐酸调节pH至2.5～3.5，随后定容至100mL。

本发明所用中和液的配制方法为：取6.0570g Tris溶于100mL超纯水中，加入1M盐酸调节pH至6.5～7.4，随后加入0.8766g NaCl，定容至100mL。

本发明根据SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，用于蛋白质电泳分析。

实施例1

一种基于免疫磁珠富集古代壁画三种胶结物的方法，包括如下步骤：

(1)取三份20μL protein A磁珠于1.5mL离心管中，加入TBST溶液至终体积为1mL小心吹打混匀，随后置于磁力架上静置30s磁性分离弃去上清液，对磁珠彻底洗涤。

(2)将酪蛋白抗体稀释400倍，卵清蛋白抗体稀释800倍，桃胶抗体稀释1000倍，取1mL分别加入到洗涤后的磁珠小心吹打混匀，置于旋转混匀仪上于室温混匀2h。

(3)将抗体磁珠混合溶液置于磁力架上静置30s磁性分离，留上清液进行后续验证，加入1mL TBST溶液小心吹打混匀，随后置于磁力架上静置30s磁性分离弃去上清液，进行洗涤得到免疫磁珠。

(4)1mL标准样品加入所得的免疫磁珠，小心吹打混匀，置于旋转混匀仪上于室温混匀2h，随后置于磁力架上静置30s磁性分离，留上清液进行后续验证，加入1mL TBST溶液小心吹打混匀，随后置于磁力架上静置30s磁性分离弃去上清液，进行洗涤得到吸附有待测样品的免疫磁珠。

(5)于吸附有待测样品的免疫磁珠中加入200μL甘氨酸-盐酸洗脱液，小心吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上磁性分离收集洗脱液，立即加入20μL中和液充分混匀，中和酸性洗脱液以防止蛋白变性。

裁取适当大小锡箔纸依次用乙醇、水冲洗干净并烘干，分别取50μL磁珠和免疫磁珠悬液置于干净的锡箔纸上，于60℃烘箱中干燥2h，完成样品制片；将所制备的样品在3.00kv条件下，用扫描电子显微镜观察比较磁珠和免疫磁珠的形貌和尺寸，采集SEM图像，如图1所示。与磁珠相比，抗体偶联后的免疫磁珠被一层薄膜状物质所覆盖，证明抗体成功偶联。

实施例2

免疫磁珠的富集性能

a.SDS-PAGE凝胶电泳检验

(1)将配制的分离胶加入到制胶玻璃板中，加入异丙醇压实，静置40min至胶完全凝固后倾出异丙醇；将配制的浓缩胶加入到制胶玻璃板中至溢出，插入梳子静置40min至胶完全凝固后拔出梳子。

(2)将20μL蛋白样品与4μL 6X蛋白上样缓冲液混合，加热煮沸10分钟。

(3)4μL BeyoColor

(4)将凝胶转移至电泳槽内，加入电泳缓冲液后盖好盖子连接电泳仪，在150V的恒定电压下跑分离胶，然后在100V的恒定电压下跑浓缩胶。

(5)电泳结束后小心地从玻璃板上取下凝胶，用考马斯亮蓝快速染色液染色2小时，随后用考马斯亮蓝染色脱色液进行脱色反应过夜，直到看到清晰的条带。

b.ELISA检验

(1)50μL/孔的样品加入96孔板中于37℃下孵育2h。

(2)每孔加入50μL的封闭液(1％BSA)在37℃下孵育1h后用TBST洗涤一次。

(3)每孔加入50μL一抗溶液，在37℃下孵育1h后用TBST洗涤。

(4)每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG溶液，在37℃下反应45min后用TBST洗涤。

(5)每孔加入100μL 3,3′，5,5′-四甲基联苯胺(TMB)工作液在37℃下反应5分钟。

(6)每孔加入100μL H

(7)使用酶标仪读取450nm处的吸光度。

免疫磁珠的富集效果评价如图2所示。富集前在SDS-PAGE凝胶电泳图上几乎看不到任何条带，富集后的卵清蛋白、酪蛋白以及桃胶都可以观察到有明显的条带出现，结合ELISA方法的表征，富集后的蛋白质吸光度都有明显增大，表明富集方法的可靠性。

实施例3

古代壁画样品分别从浙江杭州六和塔、浙江俞源村、宁夏固原史勿射墓、缅甸苏拉玛尼塔获得。

(1)使用手术刀小心的刮取适量样品，置于研钵中研磨成粉末。

(2)取20mg粉末于1.5mL离心管中，加入1mLTBS缓冲液浸泡30min后超声分散30min。

(3)将超声后的样品置于4℃中浸泡过夜后静置分层。

(4)取1mL上清液加入20μL免疫磁珠小心吹打混匀，置于旋转混匀仪上于室温混匀2h后加入1mLTBST溶液洗涤。

(5)加入200μL甘氨酸-盐酸洗脱液，小心吹打混匀，室温静置5min后置于磁力架上磁性分离收集洗脱液，立即加入20μL中和液充分混匀后进行ELISA测试，测试方法如实施例2所示。

古代壁画样品待测胶结物类型如表1所示，ELISA检测样品富集前后于450nm的吸光度如图3所示。在经过免疫磁珠富集后，ELISA结果包括在可疑值左右的样品都得到不同程度的增大，证明样品中确实存在该类胶结物。

表1古代壁画样品待测胶结物类型

上述实施例描述了本发明的详细情况，但是本发明不局限于此。在本发明的技术构思范围内，对本发明的技术方案进行的任何改进和多种简单变形，均属于本发明的保护范围。