一种含牛磺胆酸或其盐的艰难拟梭菌选择培养基

技术领域

本发明属于微生物选择培养领域，具体涉及一种含牛磺胆酸或其盐的艰难拟梭菌选择培养基。

背景技术

艰难拟梭菌(旧称艰难梭菌)是一种革兰染色阳性的专性厌氧菌，可以产生生物膜和芽孢，并主要以芽孢的形式在环境中存活，芽孢也是艰难拟梭菌传播的主要形式。艰难拟梭菌是导致抗生素相关腹泻和医疗机构相关腹泻的主要病原体之一，其导致的腹泻可以比较轻微，也可能发展成中毒性巨结肠，甚至威胁生命，在美国艰难拟梭菌被列为抗生素耐药紧迫公共威胁之一。近年来，我国艰难拟梭菌的研究也明显增加，在一项关于内地艰难拟梭菌感染的meta分析中，腹泻患者中产毒艰难拟梭菌的检出率为14％。也有相关研究表明，在社区腹泻患者中，艰难拟梭菌核酸检出率达14％，培养阳性率约为6％。

目前对于从临床和环境样本中艰难拟梭菌的培养主要用的是环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂选择性培养基(CCFA培养基)，该培养基中含有头孢西丁、环丝氨酸和果糖，可以抑制除艰难拟梭菌外的大部分厌氧菌的生长。该培养基可以培养大部分艰难拟梭菌营养细胞以及部分芽孢，但是作为一种严格厌氧菌，在临床和环境中的艰难拟梭菌大部分是以芽孢的形式存在的，如果使用一般不含帮助芽孢萌发试剂的培养基进行培养，可能使样本中部分芽孢不能成功萌发成为营养细胞，因而无法反应样本中艰难拟梭菌的真实存在情况。

因此，如何在抑制艰难拟梭菌外的其他菌生长的同时，帮助艰难拟梭菌芽胞萌发，更准确地反映样本中艰难拟梭菌的真实存在情况，提高艰难拟梭菌的检出率，还有待对艰难拟梭菌选择培养基进行进一步优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型艰难拟梭菌选择培养基。

本发明提供了牛磺胆酸或其盐在艰难拟梭菌选择培养基中的应用，所述牛磺胆酸或其盐在艰难拟梭菌选择培养基中的质量分数为0.4％～0.6％。

进一步地，上述牛磺胆酸或其盐在艰难拟梭菌选择培养基中的质量分数为0.5％。

进一步地，上述牛磺胆酸盐是牛黄胆酸钠。

进一步地，上述艰难拟梭菌选择培养基是艰难拟梭菌选择培养基CDA，由如下组分制成：

环丝氨酸0.08～0.12g/L、头孢西丁3.0～3.4mg/L、酪蛋白胨9.8～10.2g/L、肉蛋白胨9.8～10.2g/L、酵母浸粉2.8～3.2g/L、葡萄糖0.8～1.2g/L、可溶性淀粉0.8～1.2g/L、氯化钠4.8～5.2g/L、碳酸氢钠0.3～0.5g/L、丙酮酸钠0.8～1.2g/L、L-半胱氨酸0.9～1.1g/L、L-精氨酸0.8～1.2g/L、可溶性焦磷酸铁0.20～0.30g/L、果糖5.8～6.2g/L、琥珀酸0.4～0.6g/L、氯化血红素0.005～0.015g/L、中性红0.02～0.04g/L、琼脂14～16g/L；余量为水。

更进一步地，上述艰难拟梭菌选择培养基CDA由如下组分制成：

环丝氨酸0.1g/L、头孢西丁3.2mg/L、酪蛋白胨10.0g/L、肉蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉3.0g/L、葡萄糖1.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、碳酸氢钠0.4g/L、丙酮酸钠1.0g/L、L-半胱氨酸1.0g/L、L-精氨酸1.0g/L、可溶性焦磷酸铁0.25g/L、果糖6.0g/L、琥珀酸0.5g/L、氯化血红素0.01g/L、中性红0.03g/L、琼脂15g/L；余量为水。

本发明还提供了一种艰难拟梭菌选择培养基，它是在艰难拟梭菌选择培养基中添加了芽孢萌发剂制成的；所述芽胞萌发剂是牛磺胆酸或其盐，质量分数为0.4％～0.6％。

进一步地，上述芽胞萌发剂的质量分数为0.5％。

进一步地，上述芽胞萌发剂是牛磺胆酸钠。

进一步地，上述艰难拟梭菌选择培养基是艰难拟梭菌选择培养基CDA，由如下组分制成：

环丝氨酸0.08～0.12g/L、头孢西丁3.0～3.4mg/L、酪蛋白胨9.8～10.2g/L、肉蛋白胨9.8～10.2g/L、酵母浸粉2.8～3.2g/L、葡萄糖0.8～1.2g/L、可溶性淀粉0.8～1.2g/L、氯化钠4.8～5.2g/L、碳酸氢钠0.3～0.5g/L、丙酮酸钠0.8～1.2g/L、L-半胱氨酸0.9～1.1g/L、L-精氨酸0.8～1.2g/L、可溶性焦磷酸铁0.20～0.30g/L、果糖5.8～6.2g/L、琥珀酸0.4～0.6g/L、氯化血红素0.005～0.015g/L、中性红0.02～0.04g/L、琼脂14～16g/L；余量为水。

更进一步地，上述艰难拟梭菌选择培养基CDA由如下组分制成：

环丝氨酸0.1g/L、头孢西丁3.2mg/L、酪蛋白胨10.0g/L、肉蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉3.0g/L、葡萄糖1.0g/L、可溶性淀粉1.0g/L、氯化钠5.0g/L、碳酸氢钠0.4g/L、丙酮酸钠1.0g/L、L-半胱氨酸1.0g/L、L-精氨酸1.0g/L、可溶性焦磷酸铁0.25g/L、果糖6.0g/L、琥珀酸0.5g/L、氯化血红素0.01g/L、中性红0.03g/L、琼脂15g/L；余量为水。

本发明的有益效果：本发明在传统艰难拟梭菌选择培养基的基础上添加了牛磺胆酸钠，作为艰难拟梭菌的孢子萌发剂，能够显著促进艰难拟梭菌芽胞萌发效率，更大限度地把样本中的艰难拟梭菌都培养为营养细胞，使得艰难拟梭菌的检出更接近真实情况，提高检出率。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为含不同浓度牛黄胆酸钠的CDA培养基中艰难拟梭菌萌发数量比较分析。

图2为含0.5％w/w牛黄胆酸钠的CDA培养基中艰难拟梭菌培养结果。

图3为不含牛黄胆酸钠的CDA培养基中艰难拟梭菌培养结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、本发明艰难拟梭菌选择培养基的配制

本发明艰难拟梭菌选择培养基所使用的原料均可以通过购买获得，向艰难拟梭菌选择培养基CDA中添加0.5％w/w的牛黄胆酸钠制成。

即通过如下方法自行配制：

牛磺胆酸钠5g、环丝氨酸0.1g、头孢西丁3.2mg、酪蛋白胨10.0g、肉蛋白胨10.0g、酵母浸粉3.0g、葡萄糖1.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、碳酸氢钠0.4g、丙酮酸钠1.0g、L-半胱氨酸1.0g、L-精氨酸1.0g、可溶性焦磷酸铁0.25g、果糖6.0g、琥珀酸0.5g、氯化血红素0.01g、琼脂15g，加水定容至1L。由于环丝氨酸和头孢西丁属于抗生素，不能耐受高温，故该培养基的配置分两步，第一步：把除了环丝氨酸和头孢西丁的其他成分定溶后，于高压灭菌锅中121℃灭菌15min；第二步：待培养基冷却至55℃再添加相应浓度溶解好的环丝氨酸和头孢西丁，同时加入50％的卵黄液50ml。

对比例1、艰难拟梭菌选择培养基CDA的配制

环丝氨酸0.1g、头孢西丁3.2mg、酪蛋白胨10.0g、肉蛋白胨10.0g、酵母浸粉3.0g、葡萄糖1.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、碳酸氢钠0.4g、丙酮酸钠1.0g、L-半胱氨酸1.0g、L-精氨酸1.0g、可溶性焦磷酸铁0.25g、果糖6.0g、琥珀酸0.5g、氯化血红素0.01g、琼脂15g，加水定容至1L。由于环丝氨酸和头孢西丁属于抗生素，不能耐受高温，故该培养基的配置分两步，第一步：把除了环丝氨酸和头孢西丁的其他成分定溶后，于高压灭菌锅中121℃灭菌15min；第二步：待培养基冷却至55℃再添加相应浓度溶解好的环丝氨酸和头孢西丁，同时加入50％的卵黄液50ml。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、牛磺胆酸钠用量的筛选

1、实验方法

1.1按照实施例1的方法，仅改变你牛黄胆酸钠的加入量，配制含0.01％、0.05％、0.1％、0.5％和1％的牛黄胆酸钠的筛选培养基以及不含牛黄胆酸钠的筛选培养基；

1.2将制备好的芽孢稀释至同一浓度后涂布于含不同浓度牛黄胆酸的培养基上，并于厌氧环境中培养48h，每个浓度的平板设置两重复；

1.3对各组进行细菌计数，并对结果使用GraphPad进行分析。

2、实验结果

如图1所示，可见，在5g/L(0.5％w/w)的浓度时，芽孢萌发数量最多，并且与不加牛黄胆酸钠和只加0.01％的牛黄胆酸钠时的萌发数量有差异，且差异有统计学意义。因此，5g/L(0.5％w/w)是最优选的牛磺胆酸钠添加浓度。

实验例2、本发明艰难拟梭菌选择培养基的应用

1、实验方法

1.1按照实施例1和对比例1的方法分别配置含0.5％w/w牛黄胆酸钠和不含牛黄胆酸钠的CDA培养基；

1.2取医院污水处理站入水口的污水50ml，用定性滤纸过滤后，4700rpm离心10min；

1.3离心后的污水去掉上清，用200ul的BHIS肉汤重悬，并加入等量的无水乙醇，在室温静置30min；

1.4将处理好的污水，涂布至两种培养基中，每个培养基设置两重复；

1.5对各个平板上的菌落进行计数，并比较不同培养基中的艰难拟梭菌数量。

2、实验结果

2.1含0.5％w/w牛黄胆酸钠CDA培养基(实施例1)中艰难拟梭菌培养结果如图2，两个平板中菌落数分别为47和59(平均53)。

2.2不含牛黄胆酸钠的CDA培养基(对比例1)中艰难拟梭菌培养结果如下图，两个平板中菌落数分别为27和29(平均28)。

以上结果可以证明，使用本发明添加牛黄胆酸钠的选择培养基，能够更大限度地把样本中的艰难拟梭菌都培养为营养细胞，提高检出率。

综上，本发明在艰难拟梭菌选择培养基的基础上添加了牛磺胆酸钠，作为艰难拟梭菌的孢子萌发剂，能够显著促进艰难拟梭菌芽胞萌发效率，更大限度地把样本中的艰难拟梭菌都培养为营养细胞，使得艰难拟梭菌的检出更接近真实情况，提高检出率。