一株能减轻海马中小胶质细胞激活的乳酸片球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能减轻海马中小胶质细胞激活的乳酸片球菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

小胶质细胞是最常见的中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)固有免疫细胞，胶质细胞占中枢神经细胞总数的10％-20％，是CNS内最主要的免疫细胞，在维持CNS内环境稳态和诱导神经炎症中发挥关键作用。在早期发育过程中，小胶质细胞通过释放营养因子起到促进神经元回路形成和神经元生长的作用，这一功能对正常的大脑发育至关重要。而CNS内发生病变时，小胶质细胞会被异常激活，并分泌多种细胞因子和炎症因子，从而诱发免疫和炎症反应，进一步加剧中枢神经系统损伤。

益生菌是一类摄入足够量后对宿主长生有益作用的活的微生物。现有研究中披露了益生菌的摄入可以抑制小胶质细胞，例如，使用丁酸梭菌干预善帕金森病小鼠，可改小鼠的运动功能、抑制小胶质细胞激活并改善突触功能障碍。但是，长期超量丁酸梭菌的使用，被发现可能会导致养殖动物拉稀、血粪水等问题。乳酸片球菌作为益生菌之一，是一种公认的安全(GRAS)菌株。现有技术中对乳酸杆菌的研究主要集中在其对肠道有害微生物的抑制，以及增强胃肠道屏障方面的作用。但是，尚无乳酸片球菌在缓解小胶质细胞异常活化及相关症状方面的报道。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有技术中缺乏能够有效缓解海马中小胶质细胞激活及相关症状的乳酸片球菌的问题。

[技术方案]

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CCFM1344，该菌株能够降低血清中的LPS含量以及大脑海马中LPS下游受体TLR4、NF-κB的表达，降低大脑海马中促炎因子TNF α、IL 1β的表达。该菌株还能够降低小胶质细胞标志物Iba1基因和Iba1蛋白表达水平从而缓解慢性应激导致的脑部海马中小胶质细胞的激活。

本发明提供了一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344，所述乳酸片球菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.63800。

所述乳酸片球菌来源于健康成人粪便样品，经16S rDNA鉴定为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。

所述乳酸片球菌CCFM1344为革兰氏阳性菌，显微镜下呈圆球状；在De Man-Rogosaand Sharpe(MRS)琼脂培养基上生长，可形成表面光滑半透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。

本发明还提供了一种含有上述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344的微生物制剂，或其冻干粉。

在一种实施方式中，所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344在微生物制剂中的添加量不低于1×10

在一种实施方式中，所述微生物制剂为固体制剂，或液体制剂。

本发明还提供了含有上述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344，或含有上述微生物制剂的产品。

本发明还提供了上述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344，或上述微生物制剂在制备预防和/或治疗，海马中小胶质细胞激活和/或海马中小胶质细胞激活伴随的精神疾病的产品中的应用。

在一种实施方式中，所述产品中，所述乳酸片球菌CCFM1344活菌的添加量不低于1×10

在一种实施方式中，所述产品包括食品、药品或保健品。

在一种实施方式中，所述食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。

在一种实施方式中，所述乳制品包括发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料、奶油、乳酪、含乳饮料或乳粉。

在一种实施方式中，所述豆制品包括豆奶、豆乳粉。

在一种实施方式中，所述果蔬制品包括以白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃或杨梅制品中至少一种为原料制得的果蔬制品。

在一种实施方式中，所述食品包括固态食品、液态食品或半固态食品。

在一种实施方式中，所述食品包括饮料或零食。

在一种实施方式中，所述药品包括药物载体和/或药用辅料。

在一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒、脂质体中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述药用辅料包括医学上可接受的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

在一种实施方式中，所述预防和/或治疗，海马中小胶质细胞激活和/或海马中小胶质细胞激活伴随的精神疾病包括以下(a)-(g)至少一方面的作用：

(a)恢复慢性应激模型的肠道乳酸含量；

(b)抑制慢性应激导致的肠道致病菌增殖；

(c)提高肠道紧密连接蛋白ZO 1，和/或Occludin，和/或Claudin1的基因表达；

(d)降低血清中LPS的含量；

(e)降低大脑海马中LPS下游受体TLR4和/或NF-κB的表达；

(f)降低大脑海马中促炎因子TNF α和/或IL1β的基因表达；

(g)降低离子钙结合衔接分子1Iba1的表达。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的乳酸片球菌CCFM1344，能够缓解海马中小胶质细胞激活及其伴随的精神疾病，具体体现在：

1、显著上调肠道代谢物中乳酸的含量，CCFM1344处理组是模型组的2.96倍，是乳酸片球菌FSDLZ42M3组的2.91倍；

2、抑制肠道菌群中致病菌异常升高，调节肠道微生态稳态，CCFM1344处理组与模型组相比，大肠杆菌及葡萄球菌的相对丰度分别下降了76.87％(P<0.001)和91.66％(P＝0.004)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比，大肠杆菌及葡萄球菌的相对丰度分别下降了77.26％(P<0.001)和97.59％(P<0.001)；

3、上调肠道紧密连接蛋白ZO1、Occludin、Claudin1的基因表达，CCFM1344处理组与模型组相比，表达ZO-1蛋白的ZO1基因的相对表达量上升了2.63倍(P<0.001)、表达Occludin蛋白的Ocln1基因的相对表达量上升了2.87倍、表达Claudin-1蛋白的Cldn1基因的相对表达量上升了2.28倍(P<0.001)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3相比(P<0.001)，ZO1基因的相对表达量上升了2.75倍(P<0.001)、Ocln1基因的相对表达量上升了4.53倍(P<0.001)、Cldn1基因的相对表达量上升了0.5倍(P＝0.007)；

4、降低血清中LPS的含量，CCFM1344处理组与模型组相比，LPS的含量降低了31.08％(P＝0.0011)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比LPS的含量降低了32.42％(P＝0.0006)；

5、降低大脑海马中表达LPS下游受体TLR4、NF-κB蛋白的基因的相对表达水平，以及LPS下游受体TLR4、NF-κB蛋白表达水平：

CCFM1344处理组与模型组相比表达TLR4蛋白的Tlr4基因的相对表达量下调了58.35％(P<0.001)，表达NF-κB蛋白的Nfkb1基因的相对表达量下调了71.8％(P＝0.008)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比Tlr4基因的相对表达量下调了46.48％(P<0.001)，Nfkb1基因的相对表达量下调了61.75％(P<0.001)；

CCFM1344处理组与模型组相比TLR4、NF-κB蛋白分别降低了43.3％、56.6％(模型组TLR4、NF-κB蛋白的相对表达量分别为1.905、2.21；CCFM1344处理组TLR4、NF-κB蛋白的相对表达量分别为1.08、0.96)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比TLR4、NF-κB蛋白分别降低了46.3％、66.3％(乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组TLR4、NF-κB蛋白的相对表达量分别为2.01、2.845)；

6、降低大脑海马中促炎因子TNF α、IL 1β的表达，CCFM1344处理组与模型组相比表达炎症因子TNFα的基因Tnf的相对表达量下调了55.32％(P<0.001)，表达炎症因子IL 1β的基因Il1b的相对表达量下调了44.63％(P＝0.01)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比Tnf基因的相对表达量下调了44.15％(P＝0.01)，Il1b基因相对表达量下调了50.56％(P<0.001)；

7、抑制慢性应激导致的小胶质细胞过度活化，其中小胶质细胞标志物Iba1mRNA相对表达量为0.784，CCFM1344处理组与模型组相比(Iba1 mRNA相对表达量为1.86)，Iba1基因相对表达量下调了57.85％(P<0.001)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比(Iba1 mRNA相对表达量为1.64)，Iba1基因相对表达量下调了52.2％(P＝0.006)；

CCFM1344处理组与模型组相比Iba1的蛋白表达降低了36.5％(模型组Iba1蛋白的相对表达量为2；CCFM1344处理组Iba1蛋白的相对表达量为1.27，P＝0.013)；与乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组相比降低了46.5％(FSDLZ42M3处理组Iba1蛋白的相对表达量为2.375，P＝0.003)。

本发明拓展了乳酸片球菌作为益生菌的应用范围，也为利用益生菌预防、缓解、治疗神经系统功能障碍提供了理论指导。本发明所述的乳酸片球菌能够用于制备具有减轻海马中小胶质细胞激活、抑制肠道致病菌、缓解肠屏障损伤的功能性食品、保健品和药品，具有非常广泛的应用前景。

生物材料保藏

一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM1344，其分类学命名为：Pediococcus acidilactici，已于2023年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.63800，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

附图说明

图1为不同乳酸片球菌的乳酸产量及肠道代谢物中乳酸相对含量：(A)不同乳酸片球菌乳酸产量；(B)乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CCFM1344及乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)FSDLZ42M3小鼠肠道代谢物中乳酸含量；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图2为乳酸片球菌CCFM1344及乳酸片球菌FSDLZ42M3干预4周后，实验鼠肠道致病菌变化示意图：(A)大肠杆菌相对丰度：(B)葡萄球菌相对丰度；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图3为乳酸片球菌CCFM1344及乳酸片球菌FSDLZ42M3干预4周后，实验鼠肠道通透性水平以及血清中LPS含量示意图：(A)结肠表达ZO-1蛋白的基因ZO-1表达量：(B)结肠表达Occludin蛋白的基因Ocln1表达量；(C)结肠表达Claudin-1蛋白的基因Cldn1表达量；(D)血清LPS含量；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图4为乳酸片球菌CCFM1344及乳酸片球菌FSDLZ42M3干预4周后，实验鼠海马组织中表达LPS下游受体TLR4蛋白的基因Tlr4和NF-κB蛋白的基因Nfkb1，以及表达炎症因子TNFα的基因Tnf、炎症因子IL 1β的基因Il1b的表达水平示意图：(A)海马组织Tlr4基因表达水平；(B)海马组织Nfkb1基因表达水平；(C)海马组织Tnf基因表达水平；(D)海马组织Il1b基因表达水平；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图5为乳酸片球菌CCFM1344及乳酸片球菌FSDLZ42M3干预4周后，实验鼠海马组织中LPS下游受体蛋白表达水平示意图：(A)海马组织TLR4；(B)海马组织NF-κB；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图6为乳酸片球菌CCFM1344及乳酸片球菌FSDLZ42M3干预4周后，实验鼠海马组织中小胶质细胞标志物Iba1基因和蛋白表达水平；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(A)Iba1基因表达水平；(B)Iba1蛋白表达水平；(C)Iba1蛋白表达胶图。

具体实施方式

乳酸片球菌CCFM1344菌剂的制备方法：取活化2代的乳酸片球菌CCFM1344在MRS液体培养基中于37℃下培养12h，于4℃、6000×g离心3min收集菌体，弃去上清并用10％灭菌脱脂乳液重悬菌体，使菌浓度达到5×10

MRS培养基配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温1mL，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g,琼脂粉15g，pH值调至6.2-6.4，高压灭菌15min(101Kpa，121℃)。

液相检测条件：AcquityHPLC：色谱柱，Inert Sustain C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：100％0.02mol/L KH

过氧化氢酶分析方法：挑取MRS固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后加3％过氧化氢溶液1-2滴。静置1min内产生大量气泡为氧化氢酶阳性菌株，不产生气泡为氧化氢酶阴性菌株。

实施例1：乳酸片球菌CCFM1344的筛选、分离、鉴定

(一)乳酸片球菌的分离筛选

取1g健康成年人的新鲜粪便，经过梯度稀释后，将粪便样品涂布在MRS固体培养基上，在厌氧工作站培养48h，厌氧工作站的温度为37℃；

观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；

在MRS液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。

弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。

过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。

(二)益生菌的分子生物学鉴定：

(l)单菌基因组抽提：将获得的益生菌菌液吸取1mL于1.5mL离心管，10000×g离心2min，弃上清得菌体；用lmL无菌水吹洗菌体后，10000×g离心2min，弃上清得菌体；加入200μL SDS裂解液，80℃水浴30min；然后向菌体裂解液中加入酚氯仿混合溶液，其成分及体积比为Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀，在12000×g的条件下离心5min，取上清200μL；加入400μL的冰乙醇或冰异丙醇于200μL上清中， 20℃静置1h，然后在12000×g的条件下离心5min，弃去上清；加入500μL70％(体积分数)冰乙醇重悬沉淀，在12000×g的条件下离心2min，弃上清；然后置于60℃烘箱烘干或者自然晾干；然后用50μLddH

(2)16S rDNA PCR：

A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH

B.PCR条件：95℃，5min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；step2-4 30×；72℃，5min；12℃，2min；

C.制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；

D.将得到PCR产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，鉴定为乳酸片球菌。

(3)全基因组测序

将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定CCFM1344属于乳酸片球菌中的新发现菌株。菌株保藏在 80℃备用。

将保藏的菌液通过接种环蘸取原始菌液，在MRS培养基上进行划线纯化，在37℃下培养箱中培养48h，接种环挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃培养8h。

收集菌液，将发酵后的发酵液进行离心处理(12000×g，5min，4℃)，取上清液，过0.22μm的滤膜后，采用液相色谱质谱法检测提取物中乳酸的含量。以液相出峰的保留时间和质谱图谱进行定性，采用外标法测峰面积进行定量。

乳酸片球菌属中大部分菌株可以发酵葡萄糖、木糖、果糖，进而产生乳酸，结果显示(表1)，CCFM1344所产的乳酸的量为23.143mg/mL，与相同属的乳酸片球菌相比乳酸产量最高。

表1乳酸片球菌发酵生产乳酸产量

实施例2：乳酸片球菌菌剂的制备

取活化2代的乳酸片球菌CCFM1344、FSDLZ42M3以2.5％接种量分别在MRS液体培养基中于37℃下培养8h进行传代活化并扩大培养，于4℃、6000×g离心3min收集菌体，弃去上清并用10％灭菌脱脂乳液重悬菌体，使菌浓度达到5×10

实施例3：乳酸片球菌CCFM1344具有调节肠道乳酸水平的能力

选用24只雄性C57BL/6J小鼠，4周龄，体重18 20g，SPF级。实验鼠适应环境一周后，根据体重随机分为四组：正常对照组、慢性应激模型组、CCFM1344和FSDLZ42M3处理组，每组含6只小鼠。实验鼠的生长环境条件为：饲养环境温度为21-25℃，相对湿度40-60％，以12h光照-12h黑夜进行的昼夜交替光照模式。实验鼠分组及饲养方案见下表：

表2实验鼠分组及饲养方案

饲养方案具体步骤如下：

(1)第一周为适应期，适应期内不干预，实验鼠正常饮食。

(2)第二至五周进行慢性不可预知应激小鼠(CUMS)模型构建、灌胃：

构建慢性不可预知应激小鼠(CUMS)模型：对实验鼠进行以下随机刺激：1)禁食24h；2)禁水+空瓶刺激24h；3)夹尾3min；4)潮湿垫料24h；5)制动1-2h；6)45°倾斜笼盒24h；7)持续光照24h；8)无垫料24h；9)强迫游泳15分钟；10)孤养24h。每天随机采用1-2种刺激，每天刺激的时间随机决定，避免昼夜节律。每种方法不超过4次，为期4周；

灌胃：对实验鼠进行灌胃，灌胃体积为200μL/只/天。

在第六周，对实验鼠眼球取血处死之后，称取20mg的盲肠内容物样品，加入200μLH

实施例4：乳酸片球菌CCFM1344能抑制肠道致病菌

小鼠分组及处理步骤同实施例3，在第六周末取小鼠的新鲜粪便，使用MP DNASpin kit for Faces试剂盒(MP公司，美国)提取小鼠粪便总基因组，利用引物(341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’；806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)对细菌模板DNA进行16srDNA的V3-V4区扩增。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行纯化，并使用Qubit dsDNA BR胶回收试剂盒进行回收。样本测序在Illumina Miseq PE300平台进行，获得文库初始数据后，采用QIIME软件对下级数据进行质控、拼接、注释等分析。

结果如图2所示，相对于正常对照组(大肠杆菌及葡萄球菌的相对丰度分别为0.0000546、0.0000062)，CUMS造模(模型组)会导致小鼠肠道中大肠杆菌和葡萄球菌(相对丰度分别为0.000288、0.00151)等致病菌属的丰度显著提升；相比于模型组，CCFM1344干预后大肠杆菌及葡萄球菌的相对丰度(相对丰度分别为0.0000365、0.000126)分别下降了76.87％(P<0.001)和91.66％(P＝0.004)，可以有效的缓解这一现象；但是乳酸片球菌FSDLZ42M3处理组与模型组相比，大肠杆菌及葡萄球菌的相对丰度分别为0.0000504(P＝0.79)和0.001194(P＝0.4651)，不具有显著性。因此CUMS会造成小鼠肠道中致病菌丰度水平异常升高、肠道微生态失衡，而CCFM1344干预可以通过调节肠道代谢物，调节肠道菌群，抑制致病菌异常升高，而对照菌株FSDLZ42M3没有该作用。

实施例5：乳酸片球菌CCFM1344能修复慢性应激造成的肠屏障损伤

小鼠分组及处理步骤同实施例3，将实验鼠眼球取血处死之后，打开胸腔，取出小鼠结肠段组织(20mg)，加入Trizol试剂裂解结肠组织提取样本中的RNA，并检测其浓度和纯度(A260/A280应大于2.0)，采用Vazyme反转录试剂盒得到cDNA，在荧光定量扩增仪器上进行检测。每个样本设置3个平行孔，反应结束后，采用2

表3引物基因序列

紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudins-1与肠道屏障通透性密切相关，肠道屏障保护肠道细胞免受腔内微生物和抗原的侵害，但是肠道微生物群、肠道免疫系统和新陈代谢的变化也可能导致肠道屏障破坏，出现“肠漏”的现象。

结果如图3所示，其中基因ZO-1表达ZO-1蛋白，基因Ocln1表达Occludin蛋白，基因Cldn1表达Claudin-1蛋白，相对于CUMS组(模型组)(ZO-1 mRNA相对表达量为0.399；Occludin mRNA相对表达量为0.269；Claudins-1 mRNA相对表达量为0.494)，CCFM1320干预(ZO-1 mRNA相对表达量为1.45；Occludin mRNA相对表达量为1.04；Claudins-1 mRNA相对表达量为1.62)可以使小鼠结肠中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudins-1基因相对表达量分别升高2.63倍(P<0.001)、2.87倍(P<0.001)、2.28倍(P<0.001)，恢复到趋于正常的水平；与对照菌FSDLZ42M3相比(ZO-1 mRNA相对表达量为0.387；Occludin mRNA相对表达量为0.188；Claudins-1 mRNA相对表达量为1.02)，CCFM1344干预使小鼠结肠中紧密连接蛋白ZO1基因相对表达量上升了2.75倍(P<0.001)、Occludin基因相对表达量上升了4.53倍(P<0.001)、Claudin 1基因相对表达量上升了0.5倍(P＝0.007)。模型组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudins-1的基因表达显著降低，而在CCFM1344干预后可以恢复这些蛋白相关基因的正常表达，进而修复肠屏障损伤。

实施例6：乳酸片球菌CCFM1344能缓解血清中LPS异常升高

小鼠分组及处理步骤同实施例3，将小鼠在第六周末进行眼球取血处死，获得的血浆静置1h，在3000×g的条件下离心15min，收集上层的血清。LPS的测定采用酶联免疫吸附试剂盒(森贝伽，南京)。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌的细菌被膜的主要组成成分，可以通过激活TLR4通路促进炎症反应。当TLR4接收到LPS或促炎性因子等刺激后，会促使核转录因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)激活并且释放至细胞核，进一步使NF-κB靶基因活化，产生促炎因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白介素(Interleukin，IL)-1β和IL-6等，同时抑制抗炎性因子如IL-10等的产生，参与炎症反应的病理过程。

通过检测血清中LPS的结果(图3D)显示，相对于空白对照组(血清中LPS含量为26.58mg/mL)，CUMS(血清中LPS含量为38.23mg/mL)导致小鼠血清中的LPS升高了43.83％(P＝0.0013)。CCFM1344干预后，血清中LPS含量恢复到正常水平(LPS含量为26.35mg/mL，P＝0.9995)，恢复造模造成的这一现象，然而FSDLZ42M3对照菌组(血清中LPS含量为38.99mg/mL，P＝0.0007)却没有发挥这种效果。

以上结果表明，CUMS导致血清中LPS含量异常，而CCFM1344干预则可以抑制LPS含量的异常升高。

实施例7：乳酸片球菌CCFM1344能减轻慢性应激导致的中枢系统炎症反应

小鼠分组及处理步骤同实施例3，实验鼠在眼球取血之后，迅速剥离小鼠的脑组织，并在冰块上分离出海马组织，海马组织的处理方法同实例5中紧密连接蛋白相关基因表达的测定方法。引物由上海生工生物公司合成。详细的基因序列见下表：

表4引物基因序列

LPS能通过激活TLR4/NF-kB信号通路促进炎症反应，并释放一系列细胞因子和趋化因子，以引发免疫反应并在受伤或病理事件后对微环境做出反应。

结果如图4所示，其中基因Tlr4表达TLR4蛋白，基因Nfkb1表达NF-κB蛋白，基因Tnf表达促炎因子TNF-α，基因Il1b表达促炎因子IL-1β。相比于空白组，模型组中TLR4 mRNA相对表达量为2.296(P＝0.002)；NF-κB mRNA相对表达量为2.173(P＝0.007)，CUMS导致小鼠海马中的TLR4和NF-κB基因上调表达，并促进了下游的促炎因子TNF-α(mRNA相对表达量为2.354，P<0.001)、IL-1β(mRNA相对表达量为1.749，P＝0.02)的基因表达。CCFM1344干预后能下调TLR4、NF-κB以及下游炎症因子的异常升高(TLR4 mRNA相对表达量为0.958，P＝0.001；NF-κB mRNA相对表达量为0.612，P<0.001)。相比于FSDLZ42M3组(TLR4 mRNA相对表达量为1.79，P＝0.008；NF-κB mRNA相对表达量为1.6，P<0.001)，CCFM1344处理组的TLR4、NF-κB分别下调了46.48％、61.75％，同时FSDLZ42M3干预后的炎症因子TNF-α(mRNA相对表达量为1.88，P＝0.02)、IL-1β(mRNA相对表达量为1.96，P<0.001)相对与模型组也无显著差异，说明FSDLZ42M3干预并不能缓解因CUMS造模导致的小鼠中枢神经系统的炎症反应。

称取20mg上述中的海马组织，加入含有蛋白酶抑制剂(碧云天，P1005)的RIPA裂解液(碧云天，P0013B)，使用组织研磨仪55-65Hz，间隔操作将组织匀浆，直至无明显沉淀。12000×g，4℃离心15min取上清后使用BCA(Bicinchonininc acid)法测定蛋白，参考试剂盒方法测定(碧云天，增强型P0010)。运用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳定量分析目标蛋白，具体操作步骤如下：

(1)制样：将经过蛋白定量后的变性蛋白样品，煮沸加热10min备用。根据目标蛋白的分子量配制12％的丙烯酰胺分离胶。根据上样量为20μg计算上样体积。

(2)电泳：恒定电压80V，使样品跑至浓缩胶与分离胶分界处并行成一条直线；再将电压调至120V，跑1.5-2.0h至目标蛋白条带对应的marker清晰分开，loading跑出即可停止。

(3)转膜：取PVDF膜(6mm×8.5mm)在无水甲醇里浸泡20s。在白板面上，依次铺海绵1层、滤纸3层、膜、分离胶、滤纸3层、海绵1层，然后轻压去气泡后合上盖子，安装在转膜装置上。在转膜槽中加入预冷至4℃的转膜液(转膜条件：恒电流300mA，1.5h)。

(4)封闭：将PVDF膜放于BSA配置的封闭缓冲液中进行封闭，于室温摇床轻摇1h。

(5)免疫印迹反应：根据一抗说明书配适合稀释度的抗体，于封闭盒中缓慢摇动，4℃孵育12h后，加入TBST洗膜4次(10min/次)后孵育二抗，根据二抗说明书配制适合稀释度的抗体，于封闭盒中缓慢摇动，室温孵育1-2h。TBST洗膜4次(10min/次)。

(6)显影：将上述PVDF膜置于暗室中，加入商品用显影液30s后化学发光和检测在蛋白成像仪下放射自显影，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

(7)定量分析：蛋白成像仪摄取图像，用ImageJ软件进行灰度分析，计算目的蛋白的相对表达量。

通过蛋白质免疫印迹测定海马中TLR4和NF-κB的蛋白表达也得到一致的结果(图5)，相比于空白对照组，CUMS导致TLR4和NF-κB过量表达(模型组TLR4、NF-κB蛋白的相对表达量分别为1.905、2.21)，CCFM1344处理组CCFM1344处理组TLR4、NF-κB蛋白的相对表达量为1.08、0.96)与模型组相比TLR4、NF-κB蛋白分别降低了43.3％(P＝0.008)、56.6％(P＝0.03)；

而CCFM1344干预能显著缓解此现象。因此以上结果表明CCFM1344干预小鼠能缓解促炎因子在海马组织中过度表达。

实施例8：乳酸片球菌CCFM1344能抑制慢性应激导致的小胶质细胞过度活化

小鼠分组及处理步骤同实施例3，将实验鼠在眼球取血之后，迅速剥离小鼠的脑组织，并在冰块上分离出海马组织，海马组织的处理方法参考实例3中结肠组织相关基因表达的测定方法。引物由上海生工生物公司合成。详细的基因序列见下表：

表5Iba1基因表达水平检测引物序列

在脑部免疫调节系统中小胶质细胞发挥重要作用，是大脑先天免疫反应的关键调节因子之一，它起源于卵黄囊中的原始巨噬细胞、充当大脑中的原代吞噬细胞。小胶质细胞通过表达模式识别受体(PRR)检测危险相关分子模式(DAMPs)和病原体相关分子模式(PAMPs)，如果中枢神经系统发生炎症反应，那么小胶质细胞会发生活化，并作为脑部的免疫细胞发挥呈递细胞(APC)的功能以及影响T辅助细胞(Th)1和Th2细胞介导的免疫反应的脑内平衡的能力。所以小胶质细胞活化是反应中枢神经系统发生炎症的重要指标之一，活化的小胶质细胞产生并释放一系列细胞因子和趋化因子，以引发免疫反应并在受伤或病理事件后对微环境做出反应。离子钙结合衔接分子1(Ionized calcium binding adaptermolecule1，Iba1)是在小胶质细胞中特异性表达的一种钙结合蛋白。Iba1抗体目前已被广泛用作小胶质细胞的标记物。当小胶质细胞异常活化时，Iba1蛋白会异常表达。

结果如图6所示，相对于空白组，CUMS造模会促进小鼠海马组织中Iba1基因异常表达(Iba1 mRNA相对表达量为2，P<0.001)，而CCFM1344干预后，显著减少造模导致的小胶质细胞的活化(Iba1 mRNA相对表达量为1.27，P>0.99)。

称取20mg上述中的海马组织，加入含有蛋白酶抑制剂(碧云天，P1005)的RIPA裂解液(碧云天，P0013B)，使用组织研磨仪55-65Hz，间隔操作将组织匀浆，直至无明显沉淀。12000×g，4℃离心15min取上清后使用BCA(Bicinchonininc acid)法测定蛋白，参考试剂盒方法测定(碧云天，增强型P0010)。运用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳定量分析目标蛋白，具体操作步骤参考实例4。

通过蛋白质免疫印迹测定海马中Iba1的蛋白表达也得到一致的结果(图6)，CUMS导致Iba1过量表达(模型组Iba1蛋白的相对表达量为2)，相比于模型组，CCFM1344干预后Iba1的蛋白表达降低了36.5％(CCFM1344处理组Iba1蛋白的相对表达量为1.27，P＝0.013)，能显著缓解此现象。因此以上结果表明CCFM1344干预小鼠能抑制慢性应激诱导的海马中小胶质细胞激活。

实施例9：含乳酸片球菌CCFM1344的食品的制造

选用新鲜蔬菜(例如黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品或其中多种的混合)，洗净后榨汁，进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接种含乳酸片球菌CCFM1344的菌剂或发酵剂，使接种后的乳酸片球菌CCFM1344浓度达到1×10

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。