超声响应性气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用

技术领域

本公开属于气体递质供体技术领域，尤其涉及一种超声响应性气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用，更具体地涉及一氧化碳、硫化氢气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用。

背景技术

气体递质作为重要的内源性分子已经受到广泛研究。与一氧化氮(NO)类似，一氧化碳(CO)和硫化氢(H

声动力疗法(SDT)凭其高组织穿透能力、非侵入性、高度聚焦和高安全性等优势已经成为一种有前途的治疗方式，广泛用于抗肿瘤和抗菌应用中。超声也逐渐被设计用于可控释放化疗药物中，其中声敏剂材料作为SDT三要素之一，很大程度上决定了SDT的治疗效果。目前使用的声敏剂材料主要分为有机声敏剂材料和无机声敏剂材料，此类材料的疏水性给材料的生物应用造成了不便，以及超声下ROS量子产率低和不可降解性等问题也在一定程度上限制了SDT的生物适用性。

发明内容

针对上述技术问题，本公开提供了一种超声响应性气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用，以期至少部分地解决上述技术问题。

作为本公开的第一个方面，提供了一种超声响应性气体递质供体分子，其中，该供体分子具有如式(I)所示的结构：

其中，X为O或NH，Y为O或S，R为H或Ph，Ph与相连的苯环形成稠环结构。

作为本公开的第二个方面，提供了一种超声响应性气体递质供体聚合物，其中，该供体聚合物具有式(II)所示的结构：

式(II)中，X为O或NH，Y为O或S，R为H或Ph；a为0～1的任一小数；m选自3～20之间任一整数，n选自5～50之间任一整数。

作为本公开的第三个方面，提供了一种制备超声响应性气体递质供体聚合物的方法，包括：将上述实施例中的供体分子与亲水性单体和链转移剂进行可逆加成-断裂链转移聚合反应，得到上述实施例中的供体聚合物；

其中，亲水性单体的结构如式(III)所示：

式(III)中，m选自3～20之间任一整数；

链转移剂的结构如式(IV)所示：

作为本公开第四个方面，提供了一种超声响应性气体递质供体聚合物作为抗菌和抗炎药物的应用，其中，抗菌和抗炎药物包括上述实施例中的供体聚合物。

根据本公开的实施例，本公开提供的一种超声响应性气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用至少包括以下有益效果之一：

(1)在本公开的实施例中，通过结构设计选用羟基黄酮或羟基黄酮硫酮作为释放气体递质的基元，所构成的供体分子具有超声响应性，在超声刺激下能够释放出一氧化碳(CO)或一氧化碳和硫化氢(CO和H

(2)在本公开的实施例中，将供体分子与亲水单体、链转移剂进行可逆加成-断裂链转移聚合制备供体聚合物，使得该供体聚合物也具有超声响应性，能够在超声下可控地释放气体递质(CO或CO和H

附图说明

图1A为本公开实施例1中SHF供体分子的核磁共振氢谱图；

图1B为本公开实施例1中SHF供体分子的核磁共振碳谱图；

图1C为本公开实施例1中SHF供体分子的质谱图；

图1D为本公开实施例1中SHF供体分子的高效液相色谱图；

图2为本公开实施例1中PSHF供体聚合物的核磁共振氢谱图；

图3为本公开实施例1、实施例3及部分供体聚合物的凝胶渗透色谱曲线图；

图4A为本公开实施例1中SHF供体分子在超声条件下的降解机理示意图；

图4B为本公开实施例1中SHF供体分子在超声条件下的降解产物的分析图；

图5A为本公开实施例1中PSHF供体聚合物随超声时间增加的紫外吸收光谱图；

图5B为本公开实施例1中PSHF供体聚合物产生单线态氧的效果图；

图5C为本公开实施例1中PSHF在超声或不超声条件下释放出一氧化碳的对比图；

图5D为本公开实施例1中PSHF随超声时间增加的硫化氢释放曲线图；

图6A为本公开实施例1中PSHF供体聚合物在超声或不超声条件下对金黄色葡萄球菌的抗菌结果图；

图6B为本公开实施例1中PSHF供体聚合物对RAW264.7巨噬细胞的生物安全性评估图；

图6C为本公开实施例1中不同聚合物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中亚硝酸盐含量检测图；

图6D为本公开实施例1中不同聚合物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中TNF-α含量检测图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本公开作进一步的详细说明。

本公开利用超声具有高组织穿透能力、非侵入性、高聚焦性和安全性的优点，并且针对现有声敏剂材料存在的疏水性问题导致生物应用不佳的问题，本公开提出了一种超声响应性气体递质供体分子、聚合物制备方法和应用，通过结构设计可以对供体聚合物的响应速率、气体递质释放含量和种类进行调节，能够实现对细菌的灭杀和细胞炎症的抑制。

具体地，本公开提供一种超声响应性气体递质供体分子，其中，该供体分子具有式(I)所示的结构：

其中，X为O或NH，Y为O或S，R为H或Ph，Ph与相连的苯环形成稠环结构(如萘环结构)。

在本公开的实施例中，通过结构设计选用羟基黄酮或羟基黄酮硫酮作为释放气体递质的基元，所构成的供体分子具有超声响应性，在超声刺激下能够释放出一氧化碳(CO)或一氧化碳和硫化氢(CO和H

根据本公开的实施例，供体分子的具体结构式如下：

根据本公开的实施例，提供了一种超声响应性气体递质供体聚合物，其中，供体聚合物具有式(II)所示的结构：

式(II)中，X为O或NH，Y为O或S，R为H或Ph；a为0～1的任一小数；m选自3～20之间任一整数，n选自5～50之间任一整数。

在本公开的实施例中，该供体聚合物具有超声响应性，能够在超声下可控地释放气体递质(CO或CO和H

具体地，在供体聚合物中Y为S时，得到如式(II-1)和式(II-2)所示结构的供体聚合物，其能够响应超声刺激释放出一氧化碳和硫化氢两种气体递质；其中，式(II-1)和式(II-2)的结构如下：

在本公开的实施例中，当供体聚合物中的Y为S时，该供体聚合物中的3-羟基黄酮硫酮基元在超声的情况下被超声时产生的单线态氧(

具体地，在供体聚合物中Y为O时，得到如式(II-3)和式(II-4)所示结构的供体聚合物，其能够响应超声刺激释放出一氧化碳气体递质；其中，式(II-3)和式(II-4)的结构如下：

在本公开的实施例中，当供体聚合物中的Y为O时，该供体聚合物中的3-羟基黄酮基元在超声的情况下被超声时产生的单线态氧(

根据本公开的实施例，供体聚合物的分子量为7000～9000Da。

根据本公开的实施例，供体聚合物具有水溶性，解决了现有供体聚合物因疏水性难以生物应用的问题。

根据本公开的实施例，还提供了一种制备超声响应性气体递质供体聚合物的方法，包括：上述实施例中的供体分子与亲水性单体和链转移剂进行可逆加成-断裂链转移聚合反应，得到该供体聚合物；其中，亲水性单体的结构如式(III)所示：

在本公开的实施例中，将供体分子与亲水单体、链转移剂进行可逆加成-断裂链转移聚合制备得到供体聚合物。通过结构设计，能够对供体聚合物材料的超声响应速率、气体递质释放含量和种类进行调控，实现气体递质的有效释放，进而能够实现对细菌的灭杀和细胞炎症的抑制。

根据本公开的实施例，亲水单体与供体分子的当量比为5:1～20:1，在此比例范围内有助于亲水单体和供体分子进行反应，且使得制备的供体聚合物具有一定的亲水性。

根据本公开的实施例，还提供了一种超声响应性气体递质供体聚合物作为抗菌和抗炎药物的应用，其中，抗菌和抗炎药物包括上述实施例中的供体聚合物。

为了使本公开的技术方案和优点更加清楚，以下结合具体的实施例和附图对本公开的技术方案所涉及的超声响应性的气体递质释放策略做进一步的描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

释放CO/H

具体制备供体分子的方法如下：

1)SHF-Boc的制备

原料OHF-Boc是根据先前的报道(Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,13513–13520；doi.org/10.1002/anie.202104024)进行制备的。

对于SHF-Boc的制备，是将反应原料OHF-Boc(1.0g，1.0eq.)和劳森试剂(Lawesson’s reagent，1.26g，1.2eq.)加入双口圆底烧瓶内，加入60mL甲苯后加热至130℃，氩气回流反应约10h。反应过程中溶液颜色逐渐变红加深，反应程度由薄层色谱(TLC)进行监测。反应完成后，将甲苯用旋转蒸发仪除去，再用柱层析纯化分离(二氯甲烷/石油醚)，得到产物SHF-Boc。

2)SHF-NH

称取SHF-Boc(1.0g，1.0eq.)于250mL圆底烧瓶内，加入适量氯仿使原料溶解。然后，向圆底烧瓶内滴加入三氟乙酸(TFA，2.2g，8.0eq.)，室温下进行反应。反应程度由薄层色谱进行监测，约10h原料SHF-Boc基本反应完全。然后将反应混合液沉降至无水乙醚中，收集的沉淀物即为反应产物SHF-NH

3)SHF供体分子的制备

于250mL圆底烧瓶内加入SHF-NH

对得到的超声响应性单体SHF结构和纯度进行核磁氢谱、碳谱、质谱和高效液相色谱表征验证，测试结果如图1A-1D所示。

释放CO和H

合成PSHF供体聚合物的具体方法如下：

将SHF(19mg，1eq.)、亲水单体(OEGMA500，250mg，10eq.)、偶氮二异丁腈引发剂(AIBN，8.2mg，1eq.)和链转移剂Ph-CTA(18mg，1eq.)溶于0.3mLDMSO中，加入到装有磁子的2.0mL聚合封管内。将封管经过三次冷冻-脱气-化冻操作除去封管内氧气，并在真空下封管。将封管于70℃下进行聚合反应8h。反应结束用液氮处理封管并在低温冷冻下打开。将聚合反应液沉降至乙醚中，进行三次沉降操作，于真空干燥箱中充分干燥后最终得到油状聚合物PSHF。

聚合物PSHF用核磁共振氢谱进行表征，结果如图2所示。

实施例2

释放CO气体递质的供体分子OHF合成原理如下：

具体制备供体分子的方法如下：

1)OHF-NH

称取OHF-Boc(1.0g，1.0eq.)于250mL圆底烧瓶内，加入适量氯仿使原料溶解。然后，向圆底烧瓶内滴加入三氟乙酸(TFA，2.3g，8.0eq.)，室温下进行反应。反应程度由薄层色谱进行监测，约10h原料OHF-Boc基本反应完全。然后将反应混合液沉降至无水乙醚中，收集的沉淀物即为反应产物OHF-NH

2)OHF的制备

于250mL圆底烧瓶内加入OHF-NH

释放CO气体递质的供体聚合物POHF的合成原理如下：

合成POHF供体聚合物的具体方法如下：

将OHF(18.3mg，1eq.)、OEGMA500(250mg，10eq.)、AIBN(8.2mg，1eq.)和链转移剂Ph-CTA(18mg，1eq.)溶于0.3mLDMSO中，加入到装有磁子的2.0mL聚合封管内。将封管经过三次冷冻-脱气-化冻操作除去封管内氧气，并在真空下封管。将封管于70℃下进行聚合反应8h。反应结束用液氮处理封管并在低温冷冻下打开。将聚合反应液沉降至乙醚中，进行三次沉降操作，于真空干燥箱中充分干燥后最终得到油状聚合物POHF。

其它相关的聚合物如PSFlav、POFlav等制备步骤与上述PSHF和POHF类似，为控制亲水端和疏水端比例基本一致，各种供体分子与亲水单体(OEGMA)、AIBN及链转移剂Ph-CTA比例保持一致，区别仅在于供体分子的分子量不同，致使所以实际聚合时单体质量稍有区别，部分聚合物的凝胶渗透色谱(GPC)曲线如图3所示。

试验例1

LC-MS研究SHF超声降解过程，具体如下：

首先，配制SHF(实施例1)的DMF母液(5mM)。取100μM母液于10mL混合溶剂(DMF/H

图4A为本公开实施例1中SHF供体分子在超声条件下降解机理示意图。

如图4A所示，在超声(US)条件下，水中的氧气会转变成单线态氧(

试验例2

供体聚合物PSHF双重释放CO/H

得到实施例1中的PSHF供体聚合物后，在超声强度1.0W/cm

图5A为本公开实施例1中PSHF供体聚合物随超声时间增加的紫外吸收光谱图。

如图5A所示，随着超声时间的增加，紫外吸收光谱呈逐渐下降趋势，说明超声过程中产生的

单线态氧检测：用SOSG(单线态荧光探针)作为探针检测了单线态氧的产生，具体过程为：将PSHF(50μM)与SOSG(2.5μM)混合后的溶液分别在超声或不超声条件下处理5min，然后记录515nm-700nm范围内的荧光发射光谱，激发波长为504nm。

图5B为本公开实施例1中PSHF供体聚合物产生单线态氧的效果图。

如图5B所示，在不加超声的条件下，H

一氧化碳(CO)检测：采用气相色谱法检测并定量CO释放，将5mL PSHF聚合物(100μM)加入10mL玻璃样品瓶中，并用橡胶塞密封。在超声强度1.0W/cm

图5C为本公开实施例1中PSHF在超声或不超声条件下释放出一氧化碳的对比图。

如图5C所示，在超声的条件下，PSHF的气相色谱图显示出明显的CO信号峰。

硫化氢检测：使用亚甲基蓝的方法检测H

图5D为本公开实施例1中PSHF随超声时间增加的硫化氢释放曲线图。

如图5D所示，随着超声时间的增加，PSHF供体聚合物释放H

试验例3

气体递质供体聚合物PSHF体外抗菌/抗炎性质研究

体外抗菌性能测试：通过标准菌落形成单位计数统计，对PSHF材料杀灭金黄色葡萄球菌(S.aureus)的能力进行测试。在37℃摇床中，将100μL PSHF和50μL S.aureus(1×10

图6A为本公开实施例1中PSHF供体聚合物在超声或者不超声条件下对金黄色葡萄球菌的抗菌结果图。

如图6A所示，抗菌结果表明PSHF对金黄色葡萄球菌的抗菌效果随着其浓度的增加也逐渐显著。

体外抗炎性能测试：不同样品处理条件下的抗炎性能主要通过测试LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中产生的亚硝酸盐和TNF-α含量进行比较。

首先，用Griess试剂检测了RAW264.7细胞培养基中的亚硝酸盐的含量。简单地说，将RAW264.7巨噬细胞以每孔10

图6B为本公开实施例1中PSHF供体聚合物对RAW264.7巨噬细胞的生物安全性评估图。

如图6B所示，随着PSHF供体聚合物浓度增加，RAW264.7巨噬细胞的存活能力几乎没有发生改变，即说明不同浓度PSHF与RAW264.7巨噬细胞共培养后表现出良好的生物安全性。

通过TNF-αELISA检测试剂盒定量了LPS诱导下RAW264.7细胞在不同处理条件下TNF-α的水平。收集不同处理后的细胞上层培养基(100μL)，根据操作说明书测定每孔中TNF-α浓度，其中未用LPS处理的RAW264.7巨噬细胞用作阴性对照，具体测试结果如图6C-6D所示。

图6C为本公开实施例1中不同聚合物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中亚硝酸盐含量检测图，图6D为本公开实施例1中不同聚合物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中TNF-α含量检测图。

如图6C-6D所示，测试结果表明，在超声作用下PSHF、POHF、PSFlav、POFlav(100μM)处理的LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子中亚硝酸盐和TNF-α水平都存在不同程度的降低。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。