经遗传修饰的人细胞系及其用途

文献发布时间：2024-04-18 19:58:30

优先权声明

本申请要求于2021年3月31日提交的美国临时申请号63/168,727的优先权。将前述申请中的全部披露内容通过引用以其全文并入。

序列表

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背景技术

通过植入经工程化以产生能够治疗慢性和遗传性疾病的治疗物质的细胞来治疗这样的疾病在改善患有这样的疾病的患者的健康方面具有令人兴奋的潜力。为了充分发挥这样的疗法的潜力，植入的细胞必须能够在不需要选择标记的条件下持续几周、几个月甚至更长时间产生治疗水平的所需治疗物质。因此，实现治疗物质的稳定、高水平表达的一般方法是植入来自单克隆细胞系的工程化细胞，其中治疗物质由插入细胞基因组中的一个或多个位置的外源编码序列编码。然而，生成合适的单克隆细胞系是耗时且昂贵的研究工作，因为无法预测哪些基因组位置将允许治疗物质的长期可接受的表达水平，而不会转基因沉默，并且对工程化细胞的功能和生存力的负面影响最小。

发明内容

本披露基于对人视网膜色素上皮(RPE)细胞系中特定开放染色质区的鉴定，这些开放染色质区是外源转录单元的合适的基因组插入位点，例如，实现由外源转录单元编码的多肽的稳定、高表达。

本文描述了经遗传修饰的细胞，其衍生自人细胞(例如，永生化人细胞)并且包含插入位于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13或14号染色体的至少一个特定开放染色质区(OCR)的至少一个外源转录单元。在实施例中，细胞包含位于Chr.1、3、6、7和9的第一组OCR中的插入。在实施例中，细胞包含位于Chr.2、3、4、5、6、7、8、9、10、13和14的第二组19个OCR中的插入。在实施例中，第一组中的OCR都不在第二组中。

在实施例中，本文所述的经遗传修饰的细胞中的OCR的位置通过参考相应染色体(Chr)的基因组参考序列中存在的核苷酸序列(例如，来自hg38的适用Chr序列(如本文定义的))来定义。在实施例中，适用于表达一个或多个插入的外源转录单元的OCR包含选自图1中所示的OCR参考序列(SEQ ID NO:1-23)中的一个的核苷酸序列或与参考序列具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的核苷酸序列。

在实施例中，一个或多个外源转录单元的基因组插入位点(GIS)位于对应于本文所述的OCR参考序列或其子序列的第一个和最后一个核苷酸的两个核苷酸位置之间的任何位置。在实施例中，GIS位置通过参考相应hg38序列中的某些核苷酸位置来定义，例如，如下表1中所示。

表1：两个示例性表达GLA的克隆细胞系中的基因组插入位点。

在实施例中，经遗传修饰的细胞衍生自人上皮细胞。在实施例中，经遗传修饰的细胞衍生自RPE细胞，例如，永生化人RPE细胞。在实施例中，经遗传修饰的细胞衍生自可从美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)获得的人细胞系，例如，ARPE-19(

在一些实施例中，外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列和与编码序列可操作地连接的聚A信号序列。优选地选择启动子序列、聚A信号序列以实现多肽在亲本人细胞系中的高表达。在实施例中，经遗传修饰的细胞衍生自ARPE-19细胞系，启动子基本上由SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25组成，或由其组成，并且聚A信号序列基本上由SEQ ID NO:26组成，或由其组成。优选地，编码序列针对多肽在亲本细胞系中的表达进行密码子优化。在实施例中，当细胞在体外培养时，多肽由经遗传修饰的细胞组成型表达。在实施例中，多肽是酶，例如，α-半乳糖苷酶A(GLA或GALA)。

本披露还提供了包含多种本文所述的经遗传修饰的细胞的组合物以及制造该组合物的方法。在实施例中，组合物包含细胞培养基或储存培养基。在实施例中，组合物包含悬浮细胞的聚合物溶液，例如，本文所述的聚合物溶液(例如，包含藻酸盐和细胞结合物质)。在实施例中，制造该组合物的方法包括培养多种本文所述的经遗传修饰的细胞，直到产生所需数量的培养细胞，以及将所需数量的培养细胞与细胞培养基、储存培养基或聚合物溶液合并。

在又一方面，本披露提供了包含至少一个细胞容纳隔室的装置，该细胞容纳隔室包含一种本文所述的经遗传修饰的细胞或多种这样的细胞。在一些实施例中，装置包含包封一种或多种经遗传修饰的细胞的聚合物组合物。在实施例中，包封聚合物组合物包含至少一种细胞结合物质(CBS)，例如细胞结合肽，例如RGD(SEQ ID NO:34)或RGDSP(SEQ IDNO:35)。在一些实施例中，装置进一步包含如本文所定义的用于减轻当该装置被放置于受试者体内时对该装置的异物反应(FBR)(如本文所定义的)的至少一种器件。在实施例中，用于减轻FBR的器件包含如本文所定义的去纤维化化合物或去纤维化聚合物，其设置在装置的外表面上和/或环绕细胞容纳隔室的屏障隔室内。在实施例中，去纤维化化合物是具有式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量A、L

在一方面，本披露的装置是2隔室水凝胶胶囊(例如，微胶囊(直径小于1mm)或毫胶囊(直径至少1mm))，其中包含多种本文所述的活的经遗传修饰的细胞(以及任选地一种或多种细胞结合物质)的细胞容纳隔室(例如，内隔室)被包含去纤维化聚合物的屏障隔室(例如，外隔室，例如，水凝胶层)环绕。在实施例中，去纤维化聚合物包含去纤维化化合物。在实施例中，去纤维化化合物是具有式(I)的化合物。

在另一方面，本披露的特征在于包含多个(3、6、12、25、50或更多个中的至少任一个)本文所述的细胞容纳装置的制品(例如，组合物)，例如，包封经遗传修饰的RPE细胞的水凝胶胶囊的制品。在一些实施例中，制品是药学上可接受的组合物。在实施例中，水凝胶胶囊制品或组合物中的水凝胶胶囊包含水凝胶胶囊群体，这些水凝胶胶囊是球状或球形形状并且任选地具有约500μm至约5000μm(例如，约500μm至约4000μm、约500μm至约3000μm、约500μm至约2500μm、约500μm至约2000μm、约500μm至约1500μm、约500μm至约1000μm、约1000μm至约2500μm)的平均胶囊直径。在实施例中，水凝胶胶囊不是球状或球形形状。在实施例中，水凝胶胶囊制品或组合物中的水凝胶胶囊包含水凝胶胶囊群体，这些水凝胶胶囊是球状或球形形状并且任选地具有约500μm至约5000μm(例如，约500μm至约4000μm、约500μm至约3000μm、约500μm至约2500μm、约500μm至约2000μm、约500μm至约1500μm、约500μm至约1000μm、约1000μm至约2500μm)的最长线性尺寸(LLD)。在实施例中，水凝胶胶囊不是球状或球形形状。

在另一方面，本披露的特征在于制备或制造装置的方法，该装置包含本文所述的经遗传修饰的细胞。在一些实施例中，该方法包括提供该一种经遗传修饰的细胞或多种这样的细胞，以及将该一种或多种细胞放置于封闭组分(例如，如本文所述的装置的细胞容纳隔室)中。在一些实施例中，封闭组分包含柔性聚合物(例如，PLA、PLG、PEG、CMC或多糖，例如藻酸盐)。在一些实施例中，封闭组分包括非柔性聚合物或金属外壳。在一些实施例中，将装置的表面例如用如本文所述的具有式(I)的化合物化学修饰。

在实施例中，将本文所述的一个装置或多个装置与药学上可接受的赋形剂组合以制备装置制品或装置组合物，该装置制品或装置组合物可施用于需要用通过该装置产生的治疗物质(例如，外源多肽)治疗的受试者(例如，施用至腹膜内腔)。在实施例中，经遗传修饰的细胞衍生自人细胞(例如，RPE细胞、ARPE-19细胞)并且装置制品或组合物能够在持续时间段(例如，3个月、6个月、一年、两年或更长时间中的至少任一个)内向该受试者连续递送有效量的治疗物质。

在另一方面，本披露的特征在于评估本文所述的组合物、装置或装置制品的方法。在一些实施例中，该方法包括提供组合物、装置或装置制品以及评估组合物、装置或装置制品的功能参数。在实施例中，功能参数是由组合物、装置或装置制品中的细胞体外(例如，当置于合适的培养基中时)和/或体内(例如，在植入受试者(例如，非人受试者或人受试者)后)产生的外源多肽的量。

在另一方面，本披露的特征在于用由本文所述的经遗传修饰的细胞表达的外源多肽治疗需要疗法的受试者的方法。该方法包括向受试者施用包含经遗传修饰的细胞的装置或装置制品。在一些实施例中，施用步骤包括向受试者体内放置包含多个装置的药学上可接受的制品，其中的每个装置都具有产生外源多肽的能力。在一些实施例中，将装置或装置制品施用于、放置于、或提供到除中枢神经系统、脑、脊柱、眼睛、或视网膜以外的部位。在一些实施例中，将可植入元件施用于、放置于或注射到受试者的腹膜腔(例如，小囊)、网膜或皮下脂肪中。在实施例中，该方法进一步包括测量取自受试者的组织样品(例如，分离自血液样品的血浆，例如，肝活检)中存在的外源多肽的量或活性。在实施例中，在施用、植入、或放置装置或装置制品后15、30、60或120天取组织样品。在一些实施例中，受试者是人。在实施例中，患者已被诊断患有法布里(Fabry)病，并且多肽是GLA蛋白。在另一个实施例中，患者已被诊断患有黏多糖贮积症I型(MPS I)，并且多肽是α-L-艾杜糖苷酸酶蛋白。

本文阐述了本披露的一个或多个实施例的细节。根据具体实施方式、附图、实例和权利要求，本披露的其他特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1A-1W示出了来自基因组参考联盟人参考38，补丁12，初级组装(GenomeReference Consortium Human Reference 38,Patch 12,Primary Assembly)(hg38)的23个OCR的核苷酸序列，这些OCR含有用于生成本披露的经遗传修饰的细胞的合适的基因组插入位点，其中粗体下划线表示两个克隆细胞系中鉴定的特定插入位点的5’和3’边界，其通过用包含编码GLA蛋白的外源转录单元的载体转染ARPE-19细胞而衍生。

图2A-2D示出了用于生成本披露的示例性经遗传修饰的细胞的各种外源转录单元元件的核苷酸序列，其中图2A和图2B分别示出了两种不同启动子的核苷酸序列(SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25)，图2C示出了聚A信号序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)，并且图2D示出了完整示例性转录单元的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)，其中下划线表示启动子序列，阴影表示Kozak序列，[ORF]表示目的多肽的编码序列的位置，并且粗体斜体表示聚A信号序列。

图3A示出了示例性人前体GLA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)，其中下划线表示信号肽。

图3B和3C示出了用于在本披露的经遗传修饰的细胞中表达图3A的人GLA蛋白的示例性密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30)。

图3D示出了示例性GLA融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)，其中下划线表示异源信号肽。

图3E示出了用于在本披露的经遗传修饰的细胞中表达图3D的GLA融合蛋白的示例性密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)，其中下划线表示信号肽的编码序列。

图3F示出了用于在本披露的经遗传修饰的细胞中表达图3D的GLA融合蛋白的示例性转录单元的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)，其中下划线表示启动子序列，粗体下划线表示GLA融合蛋白的编码序列，并且粗体斜体表示聚A信号序列。

图4展示了本披露的示例性装置(例如，两隔室水凝胶胶囊)，其中线表示：由与细胞结合肽共价附接的聚合物形成的第一内隔室和包封在其中的经遗传修饰的细胞；第二隔室(例如，层)；以及设置在第二隔室内和胶囊表面上的去纤维化化合物。图4披露“GRGDSP”为SEQ ID NO:37。

图5比较了从包含图3F的外源转录单元的多个插入的两个克隆细胞系分泌到细胞培养基中的GLA的量，如本文实例中进一步所述的。

具体实施方式

本披露的特征在于经遗传修饰的人细胞(例如，衍生自人RPE细胞，例如，ARPE-19细胞)，其已被工程化以通过将外源转录单元插入一个或多个特定基因组OCR来产生目的外源多肽，这些特定基因组OCR已被证明允许由转录单元编码的多肽稳定、高水平表达。本披露还提供包含这样的经遗传修饰的细胞的组合物、装置和装置制品。在一些实施例中，装置被配置成当放置于受试者(例如，人受试者)体内时减轻FBR。在一些实施例中，经遗传修饰的细胞、组合物、和装置可用于向需要用治疗性多肽治疗的受试者递送治疗性多肽。在一些实施例中，装置被配置成当放置于受试者(例如，人受试者)体内时减轻FBR。

定义

因此，可以更容易地理解本披露，本文使用的某些技术和科学术语在下面特别定义。除非在本文件的其他地方特别定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本披露所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文(包括所附权利要求书)所用，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式的词如“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括它们相应的复数指示物。

“约”或“大约”(当在本文中用来修饰数值定义的参数(例如，组合物或装置(例如，水凝胶胶囊)中的经遗传修饰的细胞的量，装置的物理描述，如直径、球度、包封在其中的细胞数量、制品中的装置数量)时)意指所列举的数值在如本领域普通技术人员所确定的定义参数的可接受的功能范围内，这将部分取决于如何测量或确定该数值，例如，测量系统的局限性，包括测量系统可接受的误差范围。例如，“约”可以表示在所列举的数值之上和之下的20％的范围。作为非限制性实例，定义为具有约1.5毫米(mm)直径并包封约500万(M)个细胞的装置可具有1.2至1.8mm的直径，并可包封4M至6M个细胞。作为另一个非限制性实例，约100个装置(例如，水凝胶胶囊)的制品包括具有80至120个装置的制品。在一些实施例中，术语“约”意指修改的参数可以在该参数的所述数值之上或之下变化多达15％、10％或5％。

如本文所用，“获取”(“acquire”或“acquiring”)是指通过“直接获取”或“间接获取”值或物理实体来获得该值(例如，数值)或图像或物理实体(例如，样品)的占有。“直接获取”意指执行一个过程(例如，执行分析方法或方案)来获得值或物理实体。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收值或物理实体。直接获取值或物理实体包括进行包括物理物质的物理变化或使用机器或装置的过程。直接获取值的实例包括从人受试者获得样品。直接获取值包括执行使用机器或装置的过程，例如使用荧光显微镜以获取荧光显微镜数据。

如本文所用，术语“施用”(administer、administering或administration)是指将本文所述的实体(例如，装置或装置的制品)植入、吸收、摄取、注射、放置或以其他方式引入至受试者，或向受试者提供用于施用的这样的实体。

如本文所用，“去纤维化”意指减轻对植入装置的异物反应(FBR)的化合物或材料。例如，通过植入包含去纤维化化合物(例如，包含经表3中列出的化合物共价修饰的聚合物的水凝胶胶囊)的装置(例如，水凝胶胶囊)的组织诱导的生物组织中的FBR的量低于通过植入去纤维化无效参考装置(即，缺乏任何去纤维化化合物但具有基本相同的组成(例如，相同的CBP-聚合物、相同的细胞类型)和结构(例如，尺寸、形状、隔室的数量)的装置)诱导的FBR。在实施例中，通过含有植入装置(例如，水凝胶胶囊)的组织中的免疫反应来评估FBR的程度，其可以包括例如蛋白质吸附、巨噬细胞、多核异物巨细胞、成纤维细胞和血管生成，该评估使用本领域已知的测定，例如，如WO 2017/075630中所述，或使用Vegas,A.等人,Nature Biotechnol[自然生物技术](同上)中所述的一种或多种测定/方法，例如，植入胶囊的皮下组织蛋白酶测量、马森三色(Masson’s trichrome，MT)、组织切片苏木精或伊红染色、胶原密度定量、细胞染色和巨噬细胞共聚焦显微镜检查(CD68或F4/80)、肌成纤维细胞(α-肌肉肌动蛋白，SMA)或一般细胞沉积、已知炎症因子和免疫细胞标志物的79个RNA序列的定量、或在合适的测试受试者(例如免疫活性小鼠)的腹膜内空间中14天后对回收的装置(例如胶囊)上的巨噬细胞和中性粒细胞进行FACS分析。在实施例中，FBR是通过测量含有植入物的组织中一种或多种免疫反应生物标志物(例如，组织蛋白酶、TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-4、CCL2或CCL4)的水平来评估的。在一些实施例中，由本发明的装置(例如，包含设置于外表面上的去纤维化化合物的水凝胶胶囊)诱导的FBR比由FBR无效参考装置(例如，与测试或要求保护的装置基本相同的装置，除了缺乏用于减轻FBR的器件，例如，不含去纤维化化合物，但在其他方面基本上与要求保护的胶囊相同的水凝胶胶囊)诱导的FBR低至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，FBR(例如，一种或多种生物标志物的水平)是在约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月、或更长时间后测量的。

“α-半乳糖苷酶A”、“α-Gal A”、“α-D-半乳糖苷酶-A”、“α-半乳糖苷半乳糖水解酶”、“半乳糖苷酶α”、和“GLA蛋白”在本文中可互换使用，并且是指包含由野生型哺乳动物GLA基因编码的成熟氨基酸序列或具有其保守取代的氨基酸序列的同型二聚体蛋白。在实施例中，保守取代的GLA蛋白的酶活性在相应的野生型哺乳动物成熟GLA蛋白的80％-120％、85％-115％、90％-110％、或95％-105％内，如通过本领域公认的GLA活性测定所测量的。该野生型人GLA基因编码429个氨基酸的多肽，其中N-末端31个氨基酸构成信号肽。图3A中示出了野生型人前体α-Gal A的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)。在一些实施例中，术语“GLA蛋白”(和前述同义词中的任一个)是指包含图3A中所示的野生型成熟氨基酸序列并且任选地在该GLA信号肽(图3A中加下划线的)或针对不同分泌性蛋白(例如，由人细胞(例如，人上皮细胞)分泌的蛋白)的信号肽(例如针对如图3D所示的HSPG2(在本文中也称为GLA融合蛋白)的信号肽)之前的多肽。

可以直接在来自受试者的血液白细胞中测量GLA活性，裂解细胞，并在添加酶底物(如4-甲基伞形酮(methylumbelliferal)α-D-半乳糖苷)后确定裂解物中的酶活性。用于测量GLA活性和蛋白质以确定血液和血浆中α-半乳糖苷酶的浓度的免疫测定描述于Fuller等人,Clin Chem.[临床化学]2004；50(11):1979-85中。在实施例中，使用以下实例中所述的酶促测定法在培养基或从受试者收集的尿液样品或组织样品(例如，从血液中分离的血浆；肝、肾或心脏组织样品的匀浆)中测量GLA活性。

GLA活性的间接评估基于测量从受试者收集的血液血浆和/或尿液样品中或者从目的组织(例如，肝、肾、心脏)的活检中的底物，例如Gb3和生物标志物lysoGb3的水平。可以使用本文实例中所述的测定或本领域已知的任何测定来测量Gb3和lysoGb3水平。例如，用于测量受法布里病影响的人的血浆和尿液中的Gb3水平的方法描述于例如Boscaro等人,Rapid Commun Mass Spectrom.[质谱学快讯]2002；16(16):1507-14中。在此方法中，使用流动注射分析-电喷雾电离-串联质谱法(FIA-ESI-MS/MS)进行分析。使用“穿孔(punch)”装置获得的皮肤活检中的Gb3积累可以使用免疫电子显微镜方法检测，如Kanekura等人,Br JDermatol.[英国皮肤病杂志]2005,153(3):544-8中描述的。用于检测Gb3和其他替代性生物标志物的不同活检技术和测定描述于美国专利申请公开US2010/0113517中。GLA活性和/或法布里病进展的其他血浆替代性生物标志物(例如，各种炎症和心脏重塑生物标志物)描述于Yogasundaram,H.等人,J Am Heart Assoc.[美国心脏学会杂志]2018；7:e009098。

如本文所用，“α-L-艾杜糖苷酸酶蛋白”或“IDUA蛋白”意指包含由野生型哺乳动物IDUA基因编码的成熟氨基酸序列或具有其保守取代的氨基酸序列的多肽，该多肽能够水解糖胺聚糖(GAG)(例如硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素)中的非还原性末端α-L-艾杜糖醛酸残基。在实施例中，保守取代的IDUA蛋白的酶活性在相应的野生型哺乳动物成熟IDUA蛋白的80％-120％、85％-115％、90％-110％、或95％-105％内，如通过本领域公认的IDUA酶活性测定(例如，底物4-甲基伞形酮基-α-L-艾杜糖苷(iduronide)(4MU-艾杜糖苷)的水解)所测量的，参见，例如，Ou,L.等人,Mol Genet Metab.[分子遗传学与代谢]2014年2月:111(2):113-115。可以由本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自人上皮细胞系，例如ARPE-19细胞系)表达的IDUA蛋白包括野生型灵长类动物(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这样的野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体(包括沉默变体)。野生型人IDUA基因编码653个氨基酸前体蛋白，其中N-末端26个氨基酸构成信号肽。

如本文所用，“细胞”是指工程化的(经遗传修饰的)人细胞或者未经工程化的(未经遗传修饰的)人细胞。在实施例中，细胞是永生化细胞或衍生自永生化人细胞系的工程化细胞。在实施例中，细胞是活细胞，例如，如通过本文所述或本领域已知的任何技术测量的是有活力的。

如本文所用，“细胞结合肽(CBP)”意指包含如下氨基酸序列的线性或环状肽，该氨基酸序列衍生自用于细胞粘附分子(CAM)(例如，介导细胞基质连接或细胞间连接)的配体的细胞结合结构域。CBP的长度为少于50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在实施例中，CBP的长度在3与12个氨基酸之间、4与10个氨基酸之间，或长度为3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。CBP氨基酸序列可以与天然存在的结合结构域序列相同或可以是其保守取代的变体。在实施例中，CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，CAM配体是选自公开的国际申请WO 2020/198685中的表1中所列蛋白的组的人蛋白。在实施例中，CBP包含WO 2020/198685的表1中列出的细胞结合序列或其保守取代的变体，基本上由其组成，或由其组成。在实施例中，CBP是RGD肽(SEQ ID NO:34)，这意指该肽包含氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:34)，并且任选地包含位于N-末端和/或C-末端的一个或多个另外的氨基酸。在实施例中，CBP是包含RGD的环状肽(SEQ ID NO:34)，例如，Vilaca,H.等人,Tetrahedron[四面体]70(35):5420-5427(2014)中所述的环状RGD肽(SEQ ID NO:34)中的一种。在实施例中，CBP是包含RGD(SEQ ID NO:34)的线性肽并且长度少于6个氨基酸。在实施例中，CBP是基本上由RGD(SEQ ID NO:34)或RGDSP(SEQ ID NO:35)组成的线性肽。

如本文所用，“CBP-聚合物”意指包含至少一个细胞结合肽分子的聚合物，该分子经由接头共价附接到聚合物。在实施例中，CBP-聚合物中的聚合物不是肽或多肽。在实施例中，CBP-聚合物中的聚合物是合成的或天然存在的多糖(例如，藻酸盐，如藻酸钠)。在实施例中，接头是氨基酸接头(即，基本上由单个氨基酸或具有几个相同或不同氨基酸的肽组成)，其经由肽键连接至CBP的N-末端或C-末端。在实施例中，氨基酸接头的C-末端连接至CBP的N-末端，并且氨基酸接头的N-末端经由酰胺键连接至多糖中的至少一个侧羧基基团。在实施例中，接头-CBP的结构表示为G

如本文所用，“细胞结合多肽(CBPP)”意指如下多肽，其长度为至少50、至少75、或至少100个氨基酸并且包含CAM配体的细胞结合结构域的氨基酸序列或其保守取代的变体。在实施例中，CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，CBPP氨基酸包含全长CAM配体的天然存在的氨基酸序列，例如表1或WO 2020/198685中列出的蛋白质中的一种或其保守取代的变体。

如本文所用，“细胞结合物质(CBS)”意指任何化学、生物学或其他类型的物质(例如，小的有机化合物、肽、多肽)，其能够模仿用于细胞粘附分子(CAM)的配体或介导细胞基质连接或细胞间连接或其他受体介导的信号传导的其他细胞表面分子的至少一种活性。在实施例中，当存在于包封活细胞的聚合物组合物中时，CBS能够与一个或多个细胞形成瞬时或永久的键或接触。在实施例中，CBS促进包封在聚合物组合物中的两个或更多个活细胞之间的相互作用。在实施例中，CBS物理附接至聚合物组合物中的一个或多个聚合物分子。在实施例中，如本文所定义，CBS是细胞结合肽或细胞结合多肽。

如本文所用，“保守修饰的变体”或“保守取代”是指参考肽或与参考分子相同的多肽的变体，除了在其氨基酸序列中具有一个或多个保守氨基酸取代。在实施例中，保守修饰的变体由与参考氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成。保守氨基酸取代是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的氨基酸取代氨基酸，并且对得到的取代肽或多肽的生物活性的影响最小。功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的，并且通过功能特征分组的示例性取代列于下表2中。

表2.示例性保守氨基酸取代基团。

如在整个说明书和权利要求书中所用，“基本上由……组成(consistsessentially of)”和变体(如“基本上由……组成(consist essentially of或consistingessentially of)”)表示包括任何列举的要素或要素组，以及可任选地包括与所述要素具有相似或不同的性质的其他要素(其不会实质上改变特定分子、组合物、装置或方法的基本或新颖性质)。作为非限制性实例，基本上由所列举氨基酸序列组成的细胞结合肽、GLA蛋白或FVIII蛋白还可以包括一个或多个氨基酸，该一个或多个氨基酸包括所列举氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的取代，其各自不会实质上影响细胞结合肽、GLA蛋白或FVIII蛋白的相关生物活性。

如本文关于一种或多种细胞所用，“衍生自”是指从组织、细胞系或细胞获得的细胞，其任选地随后被培养、传代、永生化、遗传修饰、分化和/或诱导等以产生一种或多种衍生的细胞。

如本文所用，“装置”是指任何可植入物体(例如，颗粒、水凝胶胶囊、植入物、医疗装置)，其含有能够在该装置植入后表达并且任选地分泌外源多肽的一种或多种活的经遗传修饰的人细胞(例如，衍生自RPE细胞)，并且具有通过允许细胞营养进入装置来支持细胞生存力的配置。在一些实施例中，装置允许从装置释放由细胞产生的代谢副产物。

如本文所用，“有效量”是指产生足以引发所需的生物反应的外源多肽的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自人细胞(例如，上皮细胞))的量或者产生足以引发所需的生物反应的多肽的装置制品的量。在实施例中，所需的生物反应是在细胞内，或者对于分泌的多肽，在从用经遗传修饰的细胞，含有这样的细胞的装置或装置制品治疗(例如，植入)的受试者中取出的组织样品中，外源多肽的水平增加。如本领域普通技术人员将理解的，有效量可以根据因素，如所需的生物学终点，外源多肽、组合物或装置的药代动力学，所治疗的病症，施用模式，以及受试者的年龄和健康状况而改变。有效量涵盖治疗性和预防性治疗。

如本文所用，“内源核酸”是天然存在于受试者细胞中的核酸。

如本文所用，“内源多肽”是天然存在于受试者细胞中的多肽。

“工程化人细胞”和“经遗传修饰的人细胞”，可以在本文中互换使用，并且每个术语意指具有非天然存在的遗传改变(例如，在细胞基因组中)的人细胞(例如，上皮细胞)，并且典型地包含不存在(或以不同的水平存在)于其他类似的未被工程化的人细胞(例如，上皮细胞)中的外源核酸序列(例如，DNA或RNA)。在实施例中，工程化人细胞(例如，工程化RPE细胞)包含编码多肽(例如，治疗性蛋白)的外源核酸。在实施例中，外源核酸序列是染色体的(例如，外源核酸序列是设置在内源染色体序列中的外源序列)或是染色体外的(例如，未整合的表达载体)。在实施例中，外源核酸序列包含RNA序列，例如mRNA。在实施例中，外源核酸序列包含染色体或染色体外外源核酸序列，该染色体或染色体外外源核酸序列包含表达为RNA(例如mRNA或调节性RNA)的序列。在实施例中，外源核酸序列包含第一染色体或染色体外外源核酸序列，该第一染色体或染色体外外源核酸序列调节第二核酸序列的构象或表达，第二核酸序列可以是外源的或内源的。例如，工程化细胞可包含控制内源序列表达的外源核酸。在实施例中，工程化细胞包含外源核酸序列，其包含目的多肽的密码子优化的编码序列，并且与天然存在的编码序列相比实现多肽的更高表达。密码子优化的编码序列可以使用可商购的算法生成，例如，GeneOptimizer(赛默飞世尔公司(ThermoFisherScientific))、OptimumGene

如本文所用，“外源核酸”是不天然存在于受试细胞中的核酸。

如本文所用，“外源多肽”是由受试细胞中的外源核酸编码的多肽。提及特定序列的氨基酸位置意指所述氨基酸在参考氨基酸序列，例如全长成熟(在信号肽切割后)野生型蛋白的序列(除非另有说明)中的位置，且不排除在参考氨基酸序列中其他位置上存在变异，例如缺失、插入和/或取代。

如本文所用，“因子VII蛋白”或“FVII蛋白”意指包含天然存在的因子VII蛋白或其具有FVII生物活性(例如，促进血液凝固，如通过本领域内公认的测定确定的)的变体的氨基酸序列的多肽(除非另有说明)。天然存在的FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式(FVIIa)存在。在一些实施例中，对FVII的提及包括其单链和双链形式，包括酶原样和FVIIa。可以由本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自人上皮细胞系，例如ARPE-19细胞系)产生的FVII蛋白包括野生型灵长类动物(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这样的野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体。在一些实施例中，变体FVII蛋白能够被活化成完全活化的双链形式(因子VIIa)，其具有野生型因子VIIa的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的活性。FVII和FVIIa的变体是已知的，例如，marzeptacog alfa(活化的)(MarzAA)和欧洲专利号1373493、美国专利号7771996、美国专利号9476037和美国公开申请号US20080058255中所述的变体。

除非另有说明，因子VII生物活性可通过本领域公认的测定定量。例如，可以通过以下方式来定量生物流体(例如，血浆)样品中的FVII生物活性：(i)测量在包含嵌入脂质膜中的组织因子(TF)的系统中产生的因子Xa和因子X的量(Persson等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272:19919-19924,1997)；(ii)测量水性系统中的因子X水解；(iii)使用基于表面等离子体共振的仪器测量其与TF的物理结合(Persson,FEBS Letts.[FEBS通讯]413:359-363,1997)；或(iv)测量合成基质的水解；和/或(v)在TF非依赖性体外系统中测量凝血酶的产生。在实施例中，通过可商购的显色测定法(BIOPHEN FVII，HYPHEN BioMed公司，瓦兹河畔纳维尔，法国)评估FVII活性，其中含有FVII的生物样品与促凝血酶原激酶钙、因子X和SXa-11(因子Xa特异性的显色底物)混合。

如本文所用，“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”意指包含天然存在的因子VIII多肽或其具有FVIII生物活性(例如，凝血活性，如通过本领域内公认的测定确定的)的变体的氨基酸序列的多肽(除非另有说明)。可以由本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自人上皮细胞系，例如，ARPE-19细胞系)表达的FVIII蛋白包括野生型灵长类动物(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这样的野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体、B结构域缺失(BDD)变体、单链变体和任何前述野生型或变体与延长半衰期的多肽的融合体。在实施例中，将细胞工程化以编码具有B结构域的完全或部分缺失的前体因子VIII多肽(例如，具有信号序列)。在实施例中，将细胞工程化以编码单链因子VIII多肽，该多肽含有变体FVIII蛋白，优选具有相应的野生型因子VIII的凝血活性的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)。用于测量FVIII蛋白的凝结活性的测定包括一阶段或两阶段凝结测定(Rizza等人,1982,Coagulation assay of FVIII:C and FIXa[FVIII:C和FIXa的凝结测定],Bloom编辑,The Hemophelias.[血友病]纽约Churchill Livingston[丘吉尔利文斯通出版公司]1992)或显色底物FVIII:C测定(the chromogenic substrateFVIII:C assay)(Rosen,S.1984.Scand J Haematol[扫描血液学杂志]33:139-145,增刊)。

许多FVIII-BDD变体是已知的，并且包括例如具有以下任何美国专利号中披露的全部或部分B结构域缺失的变体：4,868,112(例如，第2栏第2行至第19栏第21行和表2)；5,112,950(例如，第2栏第55-68行，图2和实例1)；5,171,844(例如，第4栏第22行至第5栏第36行)；5,543,502(例如，第2栏第17-46行)；5,595,886；5,610,278；5,789,203(例如，第2栏第26-51行和实施5-8)；5,972,885(例如，第1栏第25行至第2栏第40行)；6,048,720(例如，第6栏第1-22行和实例1)；6,060,447；6,228,620；6,316,226(例如，第4栏第4行至第5栏第28行和实例1-5)；6,346,513；6,458,563(例如，第4栏第25-53行)和7,041,635(例如，第2栏第1行至第3栏第19行，第3栏第40行至第4栏第67行，第7栏第43行至第8栏第26行和第11栏第5行至第13栏第39行)。

在一些实施例中，由本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自人上皮细胞系，例如，ARPE-19细胞系)产生的FVIII-BDD蛋白在B结构域中具有一个或多个以下氨基酸缺失：(i)大多数B结构域，除了将初级翻译产物细胞内加工成两条多肽链所必需的氨基末端B结构域序列之外的(WO 91/09122)；(ii)缺失氨基酸747-1638(Hoeben R.C.,等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265(13):7318-7323(1990))；氨基酸771-1666或氨基酸868-1562(Meulien P.等人Protein Eng.[蛋白质工程]2(4):301-6(1988)；氨基酸982-1562或760-1639(Toole等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]83:5939-5942(1986))；氨基酸797-1562(Eaton等人,Biochemistry[生物化学]25:8343-8347(1986))；741-1646(Kaufman,WO 87/04187)，747-1560(Sarver等人,DNA6:553-564(1987))；氨基酸741-1648(Pasek,WO 88/00831))，氨基酸816-1598或741-1689(Lagner(BehringInst.Mitt.[贝林研究所通报](1988)82期:16-25,EP 295597)；包括弗林蛋白酶识别序列中的一个或多个残基的缺失，包括美国专利号9,956,269第10栏第65行到第11栏第36行中所列举的任何特定缺失。

在其他实施例中，FVIII-BDD蛋白保留以下任何B结构域氨基酸或氨基酸序列：(i)B结构域中的一个或多个N-连接的糖基化位点，例如，残基757、784、828、900、963或任选地943，前226个氨基酸或前163个氨基酸(Miao,H.Z.等人,Blood[血液]103(a):3412-3419(2004)，Kasuda,A.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓形成和止血杂志]6:1352-1359(2008)，和Pipe,S.W.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓形成和止血杂志]9:2235-2242(2011))。

在一些实施例中，FVIII-BDD蛋白是通过取代或缺失弗林蛋白酶识别序列LKRHQR(SEQ ID NO:36)中的一个或多个氨基酸产生的单链变体，其阻止此位点处的蛋白水解切割，该取代包括美国专利号10,023,628、9,394,353和9,670,267中所述的R1645和/或R1648位置的任何取代。

在一些实施例中，任何上述FVIII-BDD蛋白可进一步包含以下变异中的一种或多种：F309S取代，以改善FVIII-BDD蛋白的表达(Miao,H.Z.等人,Blood[血液]103(a):3412-3419(2004)；白蛋白融合物(WO 2011/020866)；和Fc融合物(WO 04/101740))。

除非另有说明，否则本文提及的所有FVIII-BDD氨基酸位置均指全长人FVIII中的位置。

如本文所用，“因子IX蛋白”或“FIX蛋白”意指包含天然存在的因子IX蛋白或其变体的氨基酸序列的多肽，其具有如本领域公认的测定所确定的FIX生物活性，例如凝血活性，除非另有说明。FIX作为无活性酶原产生，该酶原通过因子XIa切除活化肽产生通过一个或多个二硫键保持在一起的重链和轻链而转化为活性形式。可以由本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，衍生自RPE细胞系，例如，ARPE-19细胞系)产生的FIX蛋白包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这样的野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体、以及任何前述野生型或变体蛋白与延长半衰期的多肽的融合体。在实施例中，将细胞工程化以编码全长野生型人因子IX多肽(例如，具有信号序列)或其功能变体。变体FIX蛋白优选具有野生型因子VIX的凝血活性的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)。用于测量FIX蛋白的凝结活性的测定包括Biophen因子IX测定(Hyphen BioMed)和一阶段凝血测定(活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT))(例如，如EP 2 032 607中所述)、凝血酶产生时间测定(TGA)和旋转血栓弹力测定法(例如，如WO2012/006624中所述)。

许多功能性FIX变体是已知的并且可以由包封在本文所述的装置中的工程化细胞表达，包括以下国际专利公开中所述的任何功能性FIX变体：WO 02/040544，第4页第9-30行和第15页第6-31行；WO 03/020764，表2和3中，第14-24页和第12页第1-27行；WO 2007/149406，第4页第1行至第19页第11行；WO 2007/149406 A2，第19页第12行至第20页第9行；WO 08/118507，第5页第14行至第6页第5行；WO 09/051717，第9页第11行至第20页第2行；WO09/137254，第2页第[006]段至第5页第[011]段和第16页第[044]段至第24页第[057]段；WO09/130198A2，第4页第26行至第12页第6行；WO 09/140015，第11页第[0043]段至第13页第[0053]段；WO 2012/006624；WO 2015/086406。

在某些实施例中，FIX多肽包含与延长FIX蛋白的半衰期的异源多肽或非多肽部分融合的野生型或变体序列。示例性的延长半衰期的部分包括Fc、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28个氨基酸C-末端肽(CTP)及其4个O-聚糖)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子、或其任何组合。示例性FIX多肽是WO 2012/006624中所述的rFIXFc蛋白，其是通过Fc铰链区中的两个二硫键结合在一起的FIXFc单链(FIXFc-sc)和Fc单链(Fc-sc)。

FIX变体还包括功能获得性和功能缺失性变体。功能获得性变体的实例是人FIX的“帕多瓦(Padua)”变体，其在成熟蛋白质的338位具有L(亮氨酸)而不是R(精氨酸)(对应于SEQ ID NO:20的氨基酸位置384)，并且与野生型人FIX相比具有更高的催化和凝结活性(Chang等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],273:12089-94(1998))。功能缺失性变体的实例是在成熟蛋白质的起始的第五个氨基酸位置上丙氨酸取代赖氨酸，其导致与胶原蛋白IV的结合降低(例如，功能缺失)的蛋白。

如本文所用，“胰岛细胞”意指包含任何天然存在的或任何合成产生的或经修饰的细胞的细胞，其旨在部分或全部地重现、模拟或以其他方式表达朗格汉斯胰岛的细胞的部分或全部功能。术语“胰岛细胞”包括葡萄糖响应性胰岛素生成细胞，其衍生自干细胞，例如来自诱导性多能干细胞系。

如本文所用，“聚合物组合物”是包含一种或多种聚合物的组合物(例如，溶液、混合物)。作为一类，“聚合物”包括均聚物、杂聚物、共聚物、嵌段聚合物、嵌段共聚物，可以是天然的也可以是合成的。均聚物包含一种类型的结构单元或单体，而共聚物包含超过一种类型的单体。

如本文所用，“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并具有至少两个并且在一些实施例中至少3、4、5、10、50、75、100、150或200个氨基酸残基的聚合物。

如本文所用，“预防”(“prevention”、“prevent”和“preventing”)是指包括在适合用外源多肽治疗的疾病或病症的一种或多种症状发作之前，施用包封表达外源多肽的经遗传修饰的细胞的装置的组合物(或制品)以排除一种或多种症状的身体表现的治疗。在一些实施例中，“预防”(“prevention”、“prevent”和“preventing”)需要疾病或病症的体征或症状尚未发展或尚未观察到。

如本文所用，“RPE细胞”是指具有一种或多种以下特征的细胞：a)它包含视网膜色素上皮细胞(RPE)(例如，使用RPE细胞系(例如，ARPE-19细胞系(

“序列同一性”或“相同百分比”，当在本文中用于指代两个核苷酸序列或两个氨基酸序列时，意指当比较两个序列并对齐以在比较窗口或特定区域上进行最大对应时，两个序列在特定区域内相同，或在特定区域内在特定百分比的核苷酸或氨基酸位置具有相同核苷酸或氨基酸。序列同一性可以使用本领域已知的标准技术确定，包括但不限于美国专利申请公开号2017/02334455A1所述的任何算法。在实施例中，相同核苷酸或氨基酸位置的特定百分比为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。

如本文所用，“球形”意指具有形成球体(例如，完全圆形球)或球状形状的弯曲表面(例如，在表面上可以具有波和起伏)的装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)。球体和球状物体可以通过围绕三个垂直轴a、b和c中的每一个的圆形、椭圆形或组合的旋转来数学地定义。对于球体，三个轴的长度相同。通常，球状形状是具有彼此在10％、或5％或2.5％之内的半主轴的椭圆体(对于其平均表面)。球体或球状形状的直径是平均直径，例如半主轴的平均值。

如本文所用，术语“球状体”是指装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)，意指该装置具有(i)完美或经典的扁球形或长球形，或(ii)具有粗略地形成一个球体的表面，例如可能具有波浪和起伏，和/或可能是半主轴彼此在100％之内的椭圆体(对于其平均表面)。

如本文所用，“受试者”是指人或非人动物。在实施例中，受试者是人(即，男性或女性，任何年龄组，例如，儿科人受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成年人受试者(例如，年轻成人、中年成人、或老年成人))。在实施例中，受试者是非人动物，例如哺乳动物(例如，小鼠、狗、灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴))。在实施例中，受试者是商业上相关的哺乳动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或禽(例如，商业上相关的禽，例如，鸡、鸭、鹅或火鸡)。在某些实施例中，动物是哺乳动物。动物可以是雄性的或雌性的并且处于任何发育阶段。非人动物可以是转基因动物。

“转录单元”意指例如存在于外源核酸中的DNA序列，其包含与编码序列可操作地连接的至少一个启动子序列，并且还可以包含控制或增强编码序列转录成RNA分子或RNA分子翻译成多肽分子的一个或多个另外的元件。在一些实施例中，转录单元还包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列和聚A位点。在实施例中，转录单元作为整合在本文所述的特定OCR插入位置中的一个或多个中的外源序列存在。

如本文所用，“治疗”(“treatment”、“treat”、和“treating”)是指减轻、逆转、缓解、延迟疾病(例如，法布里病或A型血友病)的一种或多种症状、表现或潜在病因的发作或抑制其进展中的一种或多种。在实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟与该疾病相关的症状或病症的发作或抑制其进展。在实施例中，治疗包括增加有需要的受试者的至少一种组织(例如，血浆、肝、肾和心脏中的一种或多种)中的治疗性多肽的水平。在一些实施例中，“治疗(“treatment”、“treat”和“treating”)”需要与该疾病或病症相关的体征或症状已经发展或已经观察到。在其他实施例中，可以在没有疾病或病症的体征或症状时施用治疗，例如预防性治疗。例如，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，由于症状史和/或由于遗传因素或其他易感因素)。症状已经消退后也可以继续治疗，例如，以延迟或预防复发。在一些实施例中，治疗包含预防，而在其他实施例中则不包含。

“野生型”(wt)是指物种中多核苷酸、多肽或蛋白质的天然形式，包括序列。野生型形式不同于由一种或多种基因突变产生的多核苷酸、多肽或蛋白质的突变形式。

选定的化学定义

在下面更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。化学元素是根据PeriodicTable of the Elements[元素周期表],CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics[化学与物理手册],第75版,内封面来鉴别的，并且特定官能团通常如本文所述来定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述于以下中：Thomas Sorrell,Organic Chemistry[有机化学],University Science Books[大学科学书籍],索萨里托(Sausalito),1999；Smith和March,March’s Advanced Organic Chemistry[March高级有机化学],第5版,John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子公司],纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH Publishers,Inc.[VCH出版社],纽约,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis[一些现代有机合成方法],第3版,Cambridge University Press[剑桥大学出版社],剑桥,1987。

本文使用的缩写具有它们在化学和生物领域内的常规含义。本文阐述的化学结构和式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建的。

当列出值的范围时，旨在涵盖该范围内的每个值和子范围。例如，“C

如本文所用，“烷基”是指具有1至24个碳原子的直链或支链的饱和烃基的基团(“C

如本文所用，“烯基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳-碳双键、且没有三键的直链或支链烃基的基团(“C

如本文所用，术语“炔基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃基的基团(“C

如本文所用，术语“杂烷基”是指包括至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子的非环状稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、P、S和Si可被置于杂烷基基团的任意位置处。示例性杂烷基基团包括但不限于：-CH

除非另有说明，术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”或“杂亚烷基”单独或作为另一取代基的一部分分别意指衍生自烷基、烯基、炔基或杂烷基的二价基团。亚烷基、亚烯基、亚炔基或杂亚烷基基团可描述为例如C

如本文所用，“芳基”是指具有6-14个环碳原子以及提供在芳族环系统中的零个杂原子的单环或多环的(例如，二环或三环的)4n+2芳族环系统(例如，在环阵列中具有6、10、或14个π电子)的基团(“C

如本文所用，“杂芳基”是指具有环碳原子以及提供在芳族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧以及硫)的5-10元单环的或二环的4n+2芳族环系统(例如，在环阵列中具有6或10个π电子)的基团(“5-10元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基基团中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基二环环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”也包括环系统，其中该杂芳基环，如上所定义的，是与一个或多个芳基基团融合的(其中附接点或者在芳基上或者在杂芳基环上)，并且在这样的情况下，环成员的数目继续称作在该融合(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数目。在其中一个环不包含杂原子的二环杂芳基基团(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中附接点可以是在其中一环上，即，该环带有杂原子(例如，2-吲哚基)或该环不含有杂原子(例如，5-吲哚基)。杂芳基基团可以描述为例如6-10元杂芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。

在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在芳族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-10元芳族环系统(“5-10元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在芳族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-8元芳族环系统(“5-8元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在芳族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-6元芳族环系统(“5-6元杂芳基”)。在一些实施例中，5-6元杂芳基具有1-3个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂芳基具有1-2个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂芳基具有1个选自氮、氧和硫的环杂原子。杂芳基基团的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未经取代的(“未经取代的杂芳基”)或经一个或两个取代基取代的(“经取代的杂芳基”)。

含有一个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于，吡咯基、呋喃基和苯硫基。含有两个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于，咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有三个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于，三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含有四个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括但不限于，四唑基。含有一个杂原子的示例性6元杂芳基基团包括但不限于，吡啶基。含有两个杂原子的示例性6元杂芳基基团包括但不限于，哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有三或四个杂原子的示例性6元杂芳基基团分别包括但不限于，三嗪基和四嗪基。含有一个杂原子的示例性7元杂芳基基团包括但不限于，氮杂卓基、氧杂卓基和硫杂卓基。示例性5,6-二环杂芳基基团包括但不限于，吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、异苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基和嘌呤基。示例性6,6-二环杂芳基基团包括但不限于，萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。其他示例性杂芳基基团包括血红素和血红素衍生物。

如本文所用，术语“亚芳基”和“亚杂芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价基团。

如本文所用，“环烷基”是指在非芳族环系统中具有3至10个环碳原子(“C

如本文所用，“杂环基”是指具有环碳原子以及1至4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的3至10元非芳族环系统的基团(“3-10元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基基团中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂环基基团可以是单环(“单环杂环基”)或稠合、桥联或螺环系统，例如二环系统(“二环杂环基”)，并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。杂环基二环的环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上所定义的杂环基环与一个或多个环烷基基团稠合的环系统，其中附接点是在该环烷基或杂环基环或者其中如上所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基基团稠合的环系统上，其中附接点是在该杂环基环上，并且在这样的情况下，环成员的数目继续指示该杂环基环系统中的环成员的数目。杂环基基团可以描述为例如3-7元杂环基，其中术语“元”是指在该部分内的非氢环原子，即碳、氮、氧、硫、硼、磷和硅。杂环基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未经取代的(“未经取代的杂环基”)或经一个或两个取代基取代的(“经取代的杂环基”)。在某些实施例中，杂环基基团是未经取代的3-10元杂环基。在某些实施例中，杂环基基团是经取代的3-10元杂环基。

在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的5-10元非芳族环系统(“5-10元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、和硫)的5-8元非芳族环系统(“5-8元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、和硫)的5-6元非芳族环系统(“5-6元杂环基”)。在一些实施例中，5-6元杂环基具有1-3个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂环基具有1-2个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂环基具有一个选自氮、氧和硫的环杂原子。

含有一个杂原子的示例性3元杂环基基团包括但不限于，氮丙啶基、环氧乙烷基(oxiranyl)、环硫乙烷基(thiorenyl)。含有一个杂原子的示例性4元杂环基基团包括但不限于，氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基以及硫杂环丙烷基。含有一个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于，四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢苯硫基、二氢苯硫基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。含有两个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于，二氧环戊烷基、氧杂硫环戊烷基、二硫环戊烷基和噁唑烷-2-酮。含有三个杂原子的示例性5元杂环基基团包括但不限于，三唑啉基、噁二唑啉基以及噻二唑啉基。含有一个杂原子的示例性6元杂环基基团包括但不限于，哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、二氢吡啶基以及硫杂环己烷基(thianyl)。含有两个杂原子的示例性6元杂环基基团包括但不限于，哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二氧杂环己烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基基团包括但不限于，三嗪基或硫代吗啉基-1,1-二氧化物。含有一个杂原子的示例性7元杂环基基团包括但不限于，氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基以及硫杂环庚烷基。含有一个杂原子的示例性8元杂环基基团包括但不限于，氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。稠合至C

如本文所用，“氨基”是指基团-NR

如本文所用，“氰基”是指基团-CN。

除非另有说明，否则如本文所用，“卤代”或“卤素”独立地或作为另一取代基的一部分意指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)原子。

如本文所用，“羟基”是指基团-OH。

如本文所定义的烷基基团、烯基基团、炔基基团、杂烷基基团、环烷基基团、杂环基基团、芳基基团和杂芳基基团是任选地取代的(例如，“经取代的”或“未经取代的”烷基基团、“经取代的”或“未经取代的”烯基基团、“经取代的”或“未经取代的”炔基基团、“经取代的”或“未经取代的”杂烷基基团、“经取代的”或“未经取代的”环烷基基团、“经取代的”或“未经取代的”杂环基基团、“经取代的”或“未经取代的”芳基基团或者“经取代的”或“未经取代的”杂芳基基团)。通常，术语“经取代的”，无论是否在术语“任选地”之后，意指存在于基团(例如，碳或氮原子)上的至少一个氢是被允许的取代基替换的，例如，取代后的取代基产生稳定的化合物，例如，不能自发地通过重排、环化、消除或其他反应进行转化的化合物。除非另有说明，“经取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置具有取代基，并且当在任何给出的结构中的多于一个位置被取代时，在每个位置的取代基或是相同的或是不同的。术语“经取代的”预期包括被有机化合物的所有允许的取代基的取代，例如本文所述的导致稳定的化合物的形成的取代基的任何一个。本披露考虑了任何和所有这样的组合以获得稳定的化合物。出于本披露的目的，杂原子(例如，氮)可以具有氢取代基和/或如本文所述的满足杂原子的化合价并且导致稳定部分的形成的任何合适的取代基。

两个或更多个取代基可任选地连接以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环基基团。这样的所谓的成环取代基典型地但不一定与环状基础结构相附接。在一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的相邻成员上。例如，附接到环状基础结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠合的环结构。在另一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的单一成员上。例如，附接到环状基础结构的单一成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又一实施例中，成环取代基附接到基础结构的非相邻成员上。

本文所述的具有式(I)的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且因此能以不同异构体形式存在，例如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以呈单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可以呈立体异构体的混合物的形式，该混合物包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法(包括手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶)从混合物中分离；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。参见，例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和拆分](WileyInterscience[威利国际科学出版社],纽约,1981)；Wilen等人,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill[麦格劳-希尔公司],纽约,1962)；和Wilen,Tables of Resolving Agentsand Optical Resolutions[拆分剂表和光学拆分]第268页(E.L.Eliel编辑,Univ.ofNotre Dame Press[诺特丹大学出版社],诺特丹,印第安纳州1972)。另外，本披露涵盖如本文所述的呈单一的异构体(基本上不含其他异构体)的化合物，并且可替代地，呈多种异构体的混合物。

如本文所用，纯对映异构体化合物基本上不含该化合物的其他对映异构体或立体异构体(即，是对映异构体过量的)。换句话说，化合物的“S”形式基本上不含该化合物的“R”形式，并且因此呈“R”形式对映异构体过量。术语“对映异构纯的”或“纯对映异构体”表示化合物包含按重量计超过75％、按重量计超过80％、按重量计超过85％、按重量计超过90％、按重量计超过91％、按重量计超过92％、按重量计超过93％、按重量计超过94％、按重量计超过95％、按重量计超过96％、按重量计超过97％、按重量计超过98％、按重量计超过99％、按重量计超过99.5％或按重量计超过99.9％的对映异构体。在某些实施例中，重量基于化合物的所有对映异构体或立体异构体的总重量。

本文所述的具有式(I)的化合物还可包含一个或多个同位素取代。例如，H可以呈任何同位素形式，包括

术语“药学上可接受的盐”意指包括活性化合物的盐，这些活性化合物取决于本文所述的化合物上发现的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备。当本披露中使用的用于制备装置的具有式(I)的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使这样的化合物的中性形式与足量的所需碱(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本披露中使用的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使这样的化合物的中性形式与足量的所需酸(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自以下无机酸的那些，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等；以及衍生自以下有机酸的盐，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志]66:1-19(1977))。本披露的装置(例如，颗粒、水凝胶胶囊)中使用的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团，其允许化合物转化成碱或酸加成盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载剂适用于本披露。

本披露的装置可以含有前药形式的具有式(I)的化合物。前药是那些在生理条件下容易发生化学变化以提供可用于减轻对本披露的装置的FBR的化合物。另外，前药可以通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为有用的具有式(I)的化合物。

本文所述的某些具有式(I)的化合物能以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。一般来说，溶剂化形式等效于非溶剂化形式并且涵盖在本披露的范围中。本文所述的某些具有式(I)的化合物能以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本披露所设想的用途是等同的，并且旨在落入本披露的范围内。

术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂相缔合的化合物的形式。这种物理缔合可以包括氢键合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可以制备为例如结晶形式，并且可以是被溶剂化的。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物两者。

术语“水合物”是指与水缔合的化合物。典型地，化合物的水合物中所含的水分子的数量与水合物中化合物分子的数量呈一定的比率。因此，化合物的水合物可以例如由通式R·x H

如本文所用，术语“互变异构体”是指以下化合物，这些化合物具有可互换形态的化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动而处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过用酸或碱处理来快速地相互转化。互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。

如文本所用，符号

基因组插入位点和外源转录单元

本披露的经遗传修饰的人细胞(例如，经遗传修饰的人RPE细胞)包含稳定整合到基因组中的23个靶OCR中的一个或多个中的至少一个外源转录单元。靶OCR的5’和3’边界可以根据以下定义：(i)人参考基因组序列组装，例如，基因组参考联盟人参考38，补丁12(组装：GCA_0000014505.27，本文称为GRCh38.p12)，该组装基于欧洲分子生物学实验室的欧洲生物信息研究所(European Molecular Biology Laboratory’s EuropeanBioinformatics Institute，EMBL-EBI)(剑桥，英国)和/或(ii)SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:23中所列举的OCR核苷酸序列中的一个。

在实施例中，将外源转录单元插入经遗传修饰的人细胞的一个或多个靶基因组OCR中(在定义一个或多个靶OCR的5’和3’边界的两个核苷酸位置之间的任何位置)，例如，在SEQ ID NO:1-23中的任一个内。在一些实施例中，将外源转录单元插入参考基因组序列中的两个连续核苷酸位置之间。在其他实施例中，插入的转录单元两侧的两个基因组核苷酸位置在靶OCR中是不连续的，例如，插入事件导致OCR中一个或多个核苷酸的缺失。在实施例中，定义插入位点的两个核苷酸位置在与SEQ ID NO:1-23中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列内。在实施例中，经遗传修饰的细胞系中的靶OCR与SEQ ID NO:1-23中的相应参考序列具有的序列同一性是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。这些序列可以与靶向基因组编辑技术组合使用，以在一个或多个靶OCR中的一个或多个所需位点(例如，在表1中所述的基因组插入位点中)将转录单元插入到人细胞(例如上皮细胞)中。靶向基因组编辑技术可以是本领域已知的任何技术，例如，采用定点核酸酶(如CRISPR-Cas、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和兆核酸酶)的技术。

在一些实施例中，外源转录单元的基因组插入位点(GIS)位于SEQ ID NO:1中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 2GIS位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 3GIS位于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 4GIS位于SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 5GIS位于SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 6GIS位于SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 7GIS位于SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 8GIS位于SEQ ID NO:18中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 9GIS位于SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 10GIS位于SEQ ID NO:21中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 13GIS位于SEQ ID NO:22中的位置x

在一些实施例中，外源转录单元的Chr 14GIS位于SEQ ID NO:23中的位置x

在实施例中，将外源转录单元插入经遗传修饰的细胞的Chr 1、Chr 2、Chr 3、Chr4、Chr 5、Chr 6、Chr 7、Chr 8、Chr 9、Chr 10、Chr 13和Chr 14中的靶OCR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个中。

在实施例中，将外源转录单元插入SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16和SEQ ID NO:20中定义的五个OCR中的每一个中。在实施例中，将外源转录单元插入SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中定义的18个OCR中的每一个中。在实施例中，将外源转录单元插入这18个OCR以及不包含SEQID NO:1-23中的任一个的至少一个另外的OCR中。

每个插入位点中的转录单元可以编码相同或不同的物质，例如多肽。可以将两个或更多个转录单元串联插入靶OCR中的单个位点中，并且这些转录单元可以编码相同或不同的物质。在实施例中，上游转录单元中的启动子与下游转录单元中的启动子不同。

每个插入的转录单元中的启动子序列可以是针对能够驱动与经遗传修饰的细胞中的启动子可操作地连接的编码序列的表达的任何启动子。在实施例中，启动子序列基本上由SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24基本上相同(例如，与SEQ ID NO:24至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同)的核苷酸序列组成，或由其组成。在实施例中，启动子由SEQID NO:24组成。在实施例中，启动子序列基本上由SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25基本上相同(例如，与SEQ ID NO:25至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同)的核苷酸序列组成，或由其组成。在实施例中，启动子由SEQ ID NO:25组成。

每个插入的转录单元中的编码序列可以与聚A信号序列可操作地连接，该序列在每个转录单元中可以相同或不同。在实施例中，聚A信号序列基本上由SEQ ID NO:26或与SEQ ID NO:26基本上相同(例如，与SEQ ID NO:26至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同)的核苷酸序列组成，或由其组成。在实施例中，聚A信号序列由SEQ ID NO:26组成。

在一些实施例中，外源转录单元编码治疗性多肽(例如，蛋白质)，例如凝结因子(clotting factor)、生长因子、激素、酶、细胞因子(例如促炎细胞因子或抗炎细胞因子)、细胞因子受体、嵌合蛋白、融合蛋白或脂蛋白。由外源转录单元编码的多肽可以具有天然存在的氨基酸序列或可以含有天然存在的序列的变体。变体可以是相对于参考(例如，天然存在的)序列的非天然存在的或天然存在的氨基酸取代、突变、缺失或添加。天然存在的氨基酸序列可以是多态性变体。天然存在的氨基酸序列可以是人或非人氨基酸序列。在一些实施例中，天然存在的氨基酸序列是人序列。在一些实施例中，治疗性多肽具有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、或小于50个氨基酸。在一些实施例中，多肽的平均分子量是5kD、10kD、25kD、50kD、100kD、150kD、200kD、250kD、500kD或更大。

在一些实施例中，多肽是激素。示例性激素包括抗利尿激素(ADH)、催产素、生长激素(GH)、催乳素、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促黄体激素释放激素(LHRH)、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素(PTH)、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素、雌激素、黄体酮和睾酮。在一些实施例中，多肽是胰岛素(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。在一些实施例中，多肽是生长激素，例如人生长激素(hGH)、重组人生长激素(rhGH)、牛生长激素、甲硫氨酸-人生长激素、去苯丙氨酸人生长激素和猪生长激素。

在一些实施例中，多肽是生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)。

在一些实施例中，多肽是凝结因子或凝固因子，例如凝血因子(blood clottingfactor)或血液凝固因子。在一些实施例中，多肽参与凝固，即血液从液体转化为固体或凝胶的过程。示例性凝结因子和凝固因子包括因子I(例如，纤维蛋白原)、因子II(例如，凝血酶原)、因子III(例如，组织因子)、因子V(例如，前加速因子、不稳定因子)、因子VI、因子VII(例如，稳定因子、转变素原)、因子VIII(例如，抗血友病因子A)、因子VIIIC、因子IX(例如，抗血友病因子B)、因子X(例如，斯图亚特因子(Stuart-Prower)因子)、因子XI(例如，血浆促凝血酶原激酶前体)、因子XII(例如，哈格曼(Hagerman)因子)、因子XIII(例如，纤维蛋白稳定因子)、冯维勒布兰德因子(vWF)、前激肽释放酶、肝素辅因子II、高分子量激肽原(例如，菲茨杰拉德(Fitzgerald)因子)、抗凝血酶III和纤连蛋白。在一些实施例中，多肽是抗凝结因子，如蛋白质C。

在一些实施例中，多肽是免疫球蛋白链(重链或轻链)或其片段，其包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列，并且任选地包含免疫球蛋白Fc区。在实施例中，多肽是全长免疫球蛋白链。

在一些实施例中，多肽是细胞因子或细胞因子受体，或包括细胞因子或其受体的嵌合蛋白，包括例如肿瘤坏死因子α和β、其受体及其衍生物、肾素；脂蛋白；秋水仙碱；促肾上腺皮质激素；加压素；生长抑素；赖氨酸加压素；促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；心房利钠因子；肺表面活性剂；除组织型纤溶酶原激活子(t-PA)之外的纤溶酶原激活子，例如尿激酶；铃蟾肽；凝血酶；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；绒毛膜促性腺激素；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；整合素；蛋白质A或D；类风湿因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；干扰素如干扰素-α(例如，干扰素α2A)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ和复合干扰素；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1、IL-2至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；运输蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制剂，如前列腺素；生育促进剂；调节蛋白；抗体(包括其片段)和嵌合蛋白，如免疫粘附素。合适的多肽可以是天然的或重组的，包括例如融合蛋白。

可以由外源转录单元编码的多肽的实例还包括CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1(KC)、CXCL2(SDF1a)、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8(IL8)、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、TNFA、TNFB(LTA)、TNFC(LTB)、TNFSF4、TNFSF5(CD40LG)、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF13B、EDA、IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31、OSM、LIF、CNTF、CTF1、IL12a、IL12b、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL34、IL10、IL22、IL19、IL20、IL24、IL26、IL29、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IL28、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1、IFNG、IL1A(IL1F1)、IL1B(IL1F2)、IL1Ra(IL1F3)、IL1F5(IL36RN)、IL1F6(IL36A)、IL1F7(IL37)、IL1F8(IL36B)、IL1F9(IL36G)、IL1F10(IL38)、IL33(IL1F11)、IL18(IL1G)、IL17、KITLG、IL25(IL17E)、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、SPP1、TGFB1、TGFB2、TGFB3、CCL3L1、CCL3L2、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、AIMP1(SCYE1)、MIF、Areg、BC096441、Bmp1、Bmp10、Bmp15、Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp5、Bmp6、Bmp7、Bmp8a、Bmp8b、C1qtnf4、Ccl21a、Ccl27a、Cd70、Cer1、Cklf、Clcf1、Cmtm2a、Cmtm2b、Cmtm3、Cmtm4、Cmtm5、Cmtm6、Cmtm7、Cmtm8、Crlf1、Ctf2、Ebi3、Edn1、Fam3b、Fasl、Fgf2、Flt3l、Gdf10、Gdf11、Gdf15、Gdf2、Gdf3、Gdf5、Gdf6、Gdf7、Gdf9、Gm12597、Gm13271、Gm13275、Gm13276、Gm13280、Gm13283、Gm2564、Gpi1、Grem1、Grem2、Grn、Hmgb1、Ifna11、Ifna12、Ifna9、Ifnab、Ifne、Il17a、Il23a、Il25、Il31、Iltifb、Inhba、Lefty1、Lefty2、Mstn、Nampt、Ndp、Nodal、Pf4、Pglyrp1、Prl7d1、Scg2、Scgb3a1、Slurp1、Spp1、Thpo、Tnfsf10、Tnfsf11、Tnfsf12、Tnfsf13、Tnfsf13b、Tnfsf14、Tnfsf15、Tnfsf18、Tnfsf4、Tnfsf8、Tnfsf9、Tslp、Vegfa、Wnt1、Wnt2、Wnt5a、Wnt7a、Xcl1、肾上腺素、褪黑激素、三碘甲腺原氨酸、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓烷、胰岛淀粉样多肽、苗勒管抑制因子或激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、升压素、精氨酸升压素、心房肽激素、脑利钠肽、降钙素、缩胆囊素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、促卵泡激素、甘丙肽、胃抑制多肽、胃泌素、食欲刺激素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、抑制素、生长调节素、瘦素、促脂素、促黑素细胞激素、胃动素、食欲素、催产素、胰腺多肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、松弛素、肾素、促胰液素、生长激素抑制素、血小板生成素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、雄激素、α-葡糖苷酶(也称为酸性麦芽糖酶)、糖原磷酸化酶、糖原脱支酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、乳酸脱氢酶、肉碱棕榈酰基转移酶、肉碱和肌腺苷酸脱氨酶。

在一些实施例中，多肽是替代疗法或替代蛋白。

在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白质是凝结因子或凝固因子，例如，因子VII、因子VIII或因子IX。

在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是酶，例如α-半乳糖苷酶A(GLA)、α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)、葡糖脑苷脂酶或N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)。

在一些实施例中，转录单元编码GLA蛋白，例如，人GLA蛋白。在一些实施例中，GLA蛋白是包含SEQ ID NO:31、基本上由其组成、或由其组成的融合蛋白。

在一些实施例中，经遗传修饰的细胞包含插入本文所定义的一个以上GIS中的编码GLA蛋白(例如，SEQ ID NO:31的融合蛋白)的外源转录单元。在实施例中，包含通过培养此经遗传修饰的细胞获得的多个细胞的组合物能够在培养基中分泌至少5皮克/细胞/天，如通过本领域已知的任何直接或间接GLA活性测定测量的，例如以下实例中所述的酶促测定法。在实施例中，基本上如下进行测定。将约400,000个细胞(通过培养经遗传修饰的细胞获得)的悬浮液添加到含有2mL的完全生长培养基(具有10％FBS的DMEM:F12)的6孔板的孔中(一式两份)，并将板在37℃、5％CO

在实施例中，经遗传修饰的细胞不是如本文所定义的胰岛细胞。在实施例中，经遗传修饰的细胞具有以下特征中的一个或多个：(i)不能以有效治疗可以用胰岛素治疗的糖尿病或另一种疾病或病症的量产生胰岛素(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)；(ii)不能以葡萄糖反应性方式产生胰岛素；或(iii)不是衍生自被工程化或分化为产胰岛素的胰腺β细胞的诱导性多能干细胞。

装置

可以将一种本文所述的经遗传修饰的细胞(例如，经遗传修饰的RPE细胞)或多种这样的细胞掺入(例如，包封在)用于在向受试者提供由插入的转录单元编码的多肽中使用的可植入装置中。

示例性可植入装置包含如金属、金属合金、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料及其组合的材料。装置可以具有适合于在植入到预期的目标位置之后支持包封的细胞的生存力和生产力的任何配置和形状。在一些实施例中，装置是水凝胶胶囊，例如毫胶囊或微胶囊(例如，水凝胶毫胶囊或水凝胶微胶囊)。作为非限制性实例，装置形状可以是圆柱体、矩形、盘形、卵形、星状或球体。装置可以包括网状或嵌套结构。在一些实施例中，装置能够防止超过一定尺寸的材料通过孔或开口。在一些实施例中，装置(例如，颗粒)能够防止大于50kD、75kD、100kD、125kD、150kD、175kD、200kD、250kD、300kD、400kD、500kD、750kD、或1,000kD的材料通过。

装置(例如，胶囊、颗粒)可以包含(并且任选地配置为释放)不被工程化细胞表达的一种或多种外源药剂。这样的外源药剂可以包括，例如，核酸(例如，RNA或DNA分子)，蛋白质(例如，激素、酶(例如，葡萄糖氧化酶、激酶、磷酸酶、加氧酶、氢化酶、还原酶))，抗体，抗体片段，抗原，小分子，脂质，药物，疫苗，或其任何衍生物，蛋白质或多肽的小分子、活性或无活性片段。在一些实施例中，装置包含至少一种用于减轻异物反应(FBR)(例如，减轻当将装置植入受试者体内或之上时的FBR)的器件。

装置可以包含一个或多个水凝胶胶囊。装置中的一个或多个水凝胶胶囊可以具有以下各种形状中的任一个：圆柱体、具有半球形末端的圆柱体(也称为球柱体)、圆盘、条状体(例如，如WO 2015/191547中所述)、球体(例如，如本文所定义)或球状体(例如，如本文所定义)。在实施例中，装置中的一个或多个水凝胶胶囊是如本文所定义的球体。

在实施例中，装置是宏包封装置。宏装置的非限制性实例描述于：WO2019/068059，WO 2019/169089，美国专利号9,526,880、9,724,430和8,278,106；欧洲专利号EP742818B1，以及Sang,S.和Roy,S.,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]113(7):1381-1402(2016)中。

在实施例中，装置是具有一个或多个细胞容纳隔室的宏装置。可以配置具有两个或更多个细胞容纳隔室的装置以产生两种或更多种蛋白质，例如，表达ARSB融合蛋白的细胞将被放置在一个隔室中，并且表达不同蛋白质(例如，可以缓解MPS-6的一种或多种症状的治疗性蛋白)的细胞将被放置在不同的隔室中。WO 2018/232027描述了具有多个细胞容纳隔室的装置，这些细胞容纳隔室在微制造体中形成并被多孔膜覆盖。

在实施例中，装置被配置为如美国专利号10,493,107中所述的细的柔性股线(strand)。该股线包括基材、环绕该基材的内部聚合物涂层和环绕该内部聚合物涂层的外部水凝胶涂层。表达蛋白质的细胞被放置于外部涂层中。

本文所述的装置可以作为用于植入或施用于受试者的制品或组合物提供(即，装置制品或装置组合物)。在一些实施例中，装置制品或装置组合物包含至少2、4、8、16、32、64或更多个装置，并且制品或组合物中的至少20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的装置具有如本文所述的特征，例如平均胶囊直径或细胞容纳隔室中的细胞数量。

在一些实施例中，装置(例如，颗粒)具有最大线性尺寸(LLD)，例如平均直径或大小是至少约0.5毫米(mm)，优选地约1.0mm、约1.5mm或更大。在一些实施例中，装置的直径或大小可以大至10mm。例如，本文所述的装置或颗粒的大小范围是0.5mm至10mm、1mm至10mm、1mm至8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm、1.5mm至2mm、2mm至8mm、2mm至7mm、2mm至6mm、2mm至5mm、2mm至4mm、2mm至3mm、2.5mm至8mm、2.5mm至7mm、2.5mm至6mm、2.5mm至5mm、2.5mm至4mm、2.5mm至3mm、3mm至8mm、3mm至7mm、3mm至6mm、3mm至5mm、3mm至4mm、3.5mm至8mm、3.5mm至7mm、3.5mm至6mm、3.5mm至5mm、3.5mm至4mm、4mm至8mm、4mm至7mm、4mm至6mm、4mm至5mm、4.5mm至8mm、4.5mm至7mm、4.5mm至6mm、4.5mm至5mm、5mm至8mm、5mm至7mm、5mm至6mm、5.5mm至8mm、5.5mm至7mm、5.5mm至6mm、6mm至8mm、6mm至7mm、6.5mm至8mm、6.5mm至7mm、7mm至8mm、或7.5mm至8mm。

装置、装置制品或装置组合物可以被配置用于植入，或被植入或设置在身体的任何部位或部分中或上。在一些实施例中，可植入装置或装置制品被配置用于植入到腹膜腔(例如，小囊(lesser sac)，也称为网膜囊(omental bursa)或法氏囊网膜(bursalisomentum))中。可以经由注射或导管将装置、装置制品或装置组合物植入腹膜腔(例如，网膜，例如小囊)中或者设置在腹膜腔内的表面(例如，网膜，例如小囊)上。将装置、装置制品或装置组合物植入或设置于网膜(例如小囊)中的另外的考虑因素在M.Pellicciaro等人(2017)CellR4[细胞R4]5(3):e2410中提供。

在一些实施例中，可植入装置包括至少一个细胞容纳隔室，该细胞容纳隔室包含被聚合物组合物包封的多种活的经遗传修饰的细胞。在实施例中，装置含有两个、三个、四个或更多个细胞容纳隔室，每个隔室均包含本文所述的多种活的工程化细胞。在实施例中，当将装置植入受试者体内时，至少一个隔室中的细胞能够表达和分泌酶，例如GLA蛋白或IDUA蛋白。

在实施例中，待引入本文所述的装置(例如，水凝胶胶囊)中的细胞以细胞悬浮液的形式制备，然后被包封在该装置内。悬浮液中的细胞可以采取单细胞的形式(例如，来自单层细胞培养物)，或以另一种形式提供，例如，设置在微载体(例如，珠粒或基质)上或作为细胞的三维聚集体(例如，细胞簇或球状体)。细胞悬浮液可包含多个细胞簇(例如，作为球状体)或微载体。

在一些实施例中，在一个或多个细胞容纳隔室中的聚合物组合物包含多糖或其他水凝胶形成聚合物(例如，藻酸盐、透明质酸盐或软骨素)。在一些实施例中，聚合物是藻酸盐，其是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)组成的多糖。在一些实施例中，藻酸盐具有低分子量(例如，分子量大约<75kD)且G:M比率≥1.5，(ii)中等分子量藻酸盐，例如具有大约75-150kDa的分子量且G:M比率≥1.5，(iii)高分子量藻酸盐，例如具有大约150kDa-250kDa的MW且G:M比率≥1.5，(iv)或两种或更多种这些藻酸盐的共混物。

在一些实施例中，一个或多个细胞容纳隔室进一步包含至少一种细胞结合物质(CBS)，例如细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。在实施例中，CBS包含经由接头(“CBP-聚合物”)共价附接到聚合物组合物中聚合物分子上的CBP。在实施例中，CBP-聚合物中的聚合物是多糖(例如，藻酸盐)或其他水凝胶形成聚合物。本文描述了用于在本披露的装置中使用的多种细胞结合肽。在实施例中，细胞结合肽的长度为25个氨基酸或更少(例如，20、15、10或更少)并且包含用于细胞粘附分子(CAM)的配体的细胞结合序列。在实施例中，细胞结合肽基本上由WO 2020/198685的表1中所示的细胞结合序列组成。在实施例中，细胞结合序列是RGD(SEQ ID NO:34)或RGDSP(SEQ ID NO:35)。在实施例中，细胞结合肽的氨基末端经由氨基酸接头共价附接到聚合物。在实施例中，氨基酸接头基本上由一至三个甘氨酸残基组成。在实施例中，细胞结合肽基本上由RGD(SEQ ID NO:34)或RGDSP(SEQ IDNO:35)组成，并且接头基本上由单个甘氨酸残基组成。

在一些实施例中，装置进一步包含至少一种用于减轻异物反应(FBR)(例如，减轻当将装置植入受试者体内或之上时的FBR)的器件。本文描述了用于减轻这些装置的FBR的各种器件，但与参考装置相比能够降低对该装置的FBR的任何生物、化学或物理元素在本文中都被考虑。

例如，本文披露的装置中用于减轻FBR的器件可以包括用半透性生物相容性膜环绕细胞，该膜的孔径经选择可允许氧气和对细胞存活和功能重要的其他分子穿过该半透性膜，同时防止免疫细胞穿过孔。在实施例中，该半透性膜具有小于1000kD或在50-700kD、70-300kD之间或在70-150kD之间、或在70-130kD之间的分子量截留值。

另一种减轻FBR的器件包括用由无细胞生物相容性材料形成的屏障隔室围绕细胞容纳隔室，如，WO 2014/153127、WO 2016/019391中所述的两层或三层胶囊，或者Ma,M等人,Adv.Healthc Mater.[先进的医疗保健材料],2(5):667-672(2012)中描述的核-壳微胶囊。这样的屏障隔室可以与半透性膜器件一起使用或不与其一起使用。减轻FBR的器件可包括在装置上或装置内放置从植入装置释放的抗炎药以抑制FBR，例如，如美国专利号9,867,781中所述。如WO 2017/176792和WO 2017/176804中所述，其他减轻FBR的器件采用CSF-1R抑制剂，其被设置在装置表面上或包封在装置内。如Veiseh,O.等人,Nature Materials[自然材料]14:643-652(2015)中所述，其他FBR减轻器件采用将装置配置为直径大于1mm的球形。

在一些实施例中，用于减轻FBR的器件包括将去纤维化化合物或去纤维化聚合物设置在装置的外表面上和/或设置在环绕细胞容纳隔室的屏障隔室内。在实施例中，去纤维化聚合物包含生物相容性两性离子聚合物，例如，如WO 2017/218507、WO 2018/140834或Liu等人,Nature Communications[自然通讯](2019)10:5262中所述。示例性去纤维化化合物包括下文所述的具有式(I)的化合物。在一些实施例中，装置可以包含上述FBR减轻器件中的两个或更多个的组合。

在一些实施例中，装置具有两个水凝胶隔室，其中细胞容纳内隔室完全被第二外(例如，屏障)隔室环绕。在实施例中，第二隔室的内边界与第一隔室的外边界形成界面，例如，如图7中所示。

在一些实施例中，装置中的一个或多个隔室包含去纤维化聚合物，例如共价附接到与CBP-聚合物中的聚合物相同或不同的聚合物的具有式(I)的去纤维化化合物(下文所定义的)。在实施例中，用相同的具有式(I)的化合物修饰去纤维化聚合物中的一些或所有单体。在一些实施例中，用不同的具有式(I)的化合物修饰去纤维化聚合物中的一些或所有单体。在其中装置是两隔室水凝胶胶囊的一些实施例中，去纤维化聚合物仅存在于外屏障隔室(包括其外表面)中。

可以使用本领域已知的任何合适的方法用具有式(I)的化合物对去纤维化聚合物中的藻酸盐进行化学修饰。例如，可以活化藻酸盐羧酸部分以与一个或多个胺官能化化合物偶联，以获得用具有式(I)的化合物修饰的藻酸盐。可以将藻酸盐聚合物溶解于水(30mL/克聚合物)中并用激活剂(例如，2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量))和碱(例如，N-甲基吗啉(1当量))处理。可向此混合物中添加具有式(I)的化合物在乙腈(0.3M)中的溶液。将反应温热至55℃持续16h，然后冷却至室温并且经由旋转蒸发平缓浓缩，然后可将残余物溶于例如水中。然后可以将混合物过滤，例如通过氰基修饰的硅胶床(Silicycle)过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后可将所得溶液对水透析(10,000MWCO膜)24小时，例如，更换水两次，。可以例如经由冷冻干燥浓缩所得溶液，得到所需的经化学修饰的藻酸盐。可以将去纤维化聚合物中的藻酸盐使用本领域已知的任何合适的方法用具有式(I)的化合物化学修饰，例如，如WO 2019/195055、WO 2018/067615、WO 2017/075631、WO 2016/019391和WO2012/167223中的任一个所述。

装置中的一个或多个隔室可以包含未经修饰的聚合物，该聚合物与CBP-聚合物中以及该装置中存在的任何去纤维化聚合物中的聚合物相同或不同。在实施例中，装置中的第一隔室、第二隔室或所有隔室都包含未经修饰的聚合物。在一些实施例中，未经修饰的聚合物是未经修饰的藻酸盐。在实施例中，未经修饰的藻酸盐的分子量为150kDa–250kDa，并且G:M比率≥1.5。

具有式(I)的化合物

在一些实施例中，本文所述的装置包含具有式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(R

M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

P是不存在、环烷基、杂环基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、-OR

每个R

或者R

每个R

x是1或2；并且

y是2、3或4。

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-a)的化合物：

或其盐，其中：

A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

P是任选被一个或多个R

Z是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

每个R

或者R

每个R

x是1或2；并且

y是2、3或4。

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，L

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，M是不存在、烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是不存在。在一些实施例中，M是烷基(例如，C

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，P是不存在、杂环基、或杂芳基。在一些实施例中，P不存在。在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是三环、二环或单环杂芳基。在一些实施例中，P是单环杂芳基。在一些实施例中，P是含氮杂芳基。在一些实施例中，P是单环含氮杂芳基。在一些实施例中，P是5元杂芳基。在一些实施例中，P是5元含氮杂芳基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基、吡咯基、噁唑基、或噻唑基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基、或吡咯基。在一些实施例中，P是咪唑基。在一些实施例中，P是

在一些实施例中，P是杂环基。在一些实施例中，P是5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，P是咪唑啉酮。在一些实施例中，P是

在一些实施例中，P是

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，Z是杂环基。在一些实施例中，Z为单环或二环杂环基。在一些实施例中，Z是含氧杂环基。在一些实施例中，Z是4元杂环基、5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是四氢吡喃基。在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，Z是二环含氧杂环基。在一些实施例中，Z是邻苯二甲酸酐。在一些实施例中，Z是含硫杂环基。在一些实施例中，Z是6元含硫杂环基。在一些实施例中，Z是含有氮原子和硫原子的6元杂环基。在一些实施例中，Z是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，Z是二环杂环基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R

-3,8-二氮杂螺[4.5]癸-2-酮。在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是芳基。在一些实施例中，Z是单环芳基。在一些实施例中，Z是苯基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基(例如，被1个R

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是烷基。在一些实施例中，Z是C

在一些实施例中，对于式(I)或(I-a)，Z是杂烷基。在一些实施例中，Z是C

在一些实施例中，Z是-OR

在一些实施例中，Z是氢。

在一些实施例中，L

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-b)的化合物：

或其盐，其中环M

在一些实施例中，具有式(I-b)的化合物是具有式(I-b-i)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环M

在一些实施例中，具有式(I-b-i)的化合物是具有式(I-b-ii)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-c)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-c-i)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-d)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-e)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-f)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中M是任选地被一个或多个R

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中M是键、烷基或芳基，其中烷基和芳基任选地被一个或多个R

在一些实施例中，具有式(II)的化合物是具有式(II-a)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中L

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中Z

在一些实施例中，具有式(III)的化合物是具有式(III-a)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-b)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-c)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)

在一些实施例中，具有式(III-c)的化合物是具有式(III-d)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)

在一些实施例中，化合物是具有式(I)的化合物。在一些实施例中，L

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III-e)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III-f)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III-g)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III-h)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III-i)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)

在一些实施例中，X是S(O)

在一些实施例中，R

在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，q是2、3、4、或5。在一些实施例中，q是3。在一些实施例中，m是1。在一些实施例中，p是0。在一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I)的化合物。在一些实施例中，L

在一些实施例中，化合物是具有式(I-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，L

在一些实施例中，化合物是具有式(III-c)的化合物。在式(III-c)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-a)的化合物。在式(I-a)的一些实施例中，L

在一些实施例中，化合物是具有式(I-a)的化合物。在一些实施例中，A不存在；P不存在，L

在式(I-a)的一些实施例中，A不存在；P不存在，L

在一些实施例中，化合物是具有式(I-b-i)的化合物。在式(I-b-i)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-b-ii)的化合物。在式(I-b-ii)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-c)的化合物。在式(I-c)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-d)的化合物。在式(I-d)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-f)的化合物。在式(I-f)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(II-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，R

在式(II-a)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(III)的化合物。在式(III)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(III-b)的化合物。在式(III-b)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(III-d)的化合物。在式(III-d)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(III-d)的化合物。在式(III-i)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(III-d)的化合物。在式(III-d)的一些实施例中，R

在一些实施例中，化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-e)的化合物。在一些实施例中，化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(II)的化合物。在一些实施例中，化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-f)的化合物。在一些实施例中，化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(III)的化合物。

具有式(I)的示例性化合物可以如WO 2019/169333中所述或本领域技术人员已知的任何其他方法来制备。

在一些实施例中，具有式(I)的化合物不是WO 2012/112982、WO 2012/167223、WO2014/153126、WO 2016/019391、WO 2017/075630、US 2012-0213708、US2016-0030359或US2016-0030360中披露的化合物。

在一些实施例中，具有式(I)化合物包含表3中所示的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本文所述的装置包含表3中所示的化合物或其药学上可接受的盐。

表3：具有式(I)的示例性化合物

在一些实施例中，化合物是具有式(I)(例如，式(I-a)、(I-b)、(I-b-i)、(I-b-ii)、(I-c)、(I-d)、(I-e)、(I-f)、(II)、(II-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)、(III-e)、(III-f)、(III-g)或(III-i))的化合物或其药学上可接受的盐，并且选自：

和/>

在一些实施例中，本文所述的装置包含

在实施例中，本文所述的装置包含与藻酸盐聚合物共价结合的具有式(I)的化合物(例如，表3中所示的化合物)。可以将藻酸盐聚合物使用本领域已知的任何合适的方法(例如，如WO 2019/195055中所述)用具有式(I)的化合物化学修饰。

治疗方法

本文描述了通过向受试者施用产生治疗疾病、障碍或病症的治疗剂的多种本文所述的经遗传修饰的细胞来预防或治疗该受试者中的该疾病、障碍或病症的方法。可以通过向受试者植入含有如本文所述的细胞的装置或这样的装置的制品来施用细胞。在实施例中，将装置或制品植入(例如，经由腹腔镜检查)腹膜内空间(例如，腹膜腔的大囊(greatersac))中。在实施例中，经遗传修饰的细胞是工程化RPE细胞，并且该方法包括施用(例如，植入)有效量的具有两隔室藻酸盐水凝胶胶囊的组合物，这些水凝胶胶囊在内隔室中包含本文所述的工程化RPE细胞和细胞结合聚合物，并且在胶囊外表面上包含具有式(I)的化合物(例如化合物101)。在一些实施例中，治疗的方法直接或间接减少或缓解疾病、障碍或病症的至少一个症状，并且/或者该方法预防或减缓疾病、障碍或病症的发作。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症影响身体系统，例如神经系统(例如，周围神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，该疾病、障碍或病症影响身体的一部分，例如血液、眼、脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、足、手、肝、心脏、肾、骨、胰腺、脾脏、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是神经系统变性疾病、糖尿病、心脏病、自身免疫疾病、癌症、肝病、溶酶体贮积病、凝血障碍或凝固障碍、骨科病症、氨基酸代谢紊乱。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是神经系统变性疾病。示例性神经系统变性疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)和大脑性瘫痪(CP)、齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩(dentatorubro-pallidoluysianatrophy，DRPLA)、神经元核内透明包涵体病(NIHID)、路易体痴呆、唐氏综合征、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、朊病毒病、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(cortocobasal degeneration)、拳击性痴呆、弥漫性神经原纤维缠结、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、库贾氏病(Jakob-Creutzfeldt disease)、尼曼－皮克病(Niemann-Pick disease)3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、皮克病(Pick’s disease)和齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是自身免疫性疾病，例如硬皮病、多发性硬化、狼疮或过敏。

在一些实施例中，该疾病是肝病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、NASH。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是癌症。示例性癌症包括白血病，淋巴瘤、黑素瘤、肺癌、脑癌(例如，胶质母细胞瘤)、肉瘤、胰腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、前列腺癌或子宫癌。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是骨科病症。示例性骨科病症包括骨质疏松症、骨坏死、佩吉特病(Paget’s disease)或骨折。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是溶酶体贮积病。示例性溶酶体贮积病包括戈谢病(例如，I型、II型、III型)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、法布里病、法伯病(Farber disease)、黏多糖贮积症I型(MPS I)(也称为赫尔勒综合征)、亨特综合征(Huntersyndrome)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、尼曼－皮克病、唾液酸贮积病(Salla disease)、圣菲利波综合征(Sanfilippo syndrome)(也称为黏多糖贮积症IIIA型(MPS3A))、多种硫酸酯酶缺乏症、马罗托-拉米综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(Krabbe disease)、施艾氏综合征(Scheie syndrome)、贺勒氏-施艾氏综合征(Hurler-Scheie syndrome)、斯莱综合征(Sly syndrome)、透明质酸酶缺乏症、蓬佩病(Pompe disease)、达农病(Danon disease)、神经节苷脂贮积病或莫基奥综合征(Morquiosyndrome)。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是凝血障碍或凝固障碍。示例性凝血障碍或凝固障碍包括血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯维勒布兰德病、血小板减少症、尿毒症、贝尔纳-苏利耶综合征、因子XII缺乏、维生素K缺乏或先天性无纤维蛋白原血症。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是氨基酸代谢障碍，例如苯丙酮尿症、酪氨酸血症(例如，1型或2型)、尿黑酸尿症、同型胱氨酸尿症、高同型半胱氨酸血症、枫糖尿病。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是脂肪酸代谢障碍，例如高脂血症、高胆固醇血症、半乳糖血症。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是嘌呤或嘧啶代谢障碍，例如莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)。在一些实施例中，该疾病、障碍或病症不是I型糖尿病。在一些实施例中，该疾病、障碍或病症不是II型糖尿病。

示例性列举的实施例

1.一种经遗传修饰的细胞，其衍生自人细胞并且包含选自由以下组成的组的至少一个基因组插入位点(GIS)中的至少一个外源转录单元：

(a)位于SEQ ID NO:1内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的Chr 1GIS或与SEQ ID NO:1具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(b)位于SEQ ID NO:2内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 2GIS或与SEQ ID NO:2具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(c)位于SEQ ID NO:3内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 2GIS或与SEQ ID NO:3具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(d)位于SEQ ID NO:4内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 3GIS或与SEQ ID NO:4具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(e)位于SEQ ID NO:5内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 3GIS或与SEQ ID NO:5具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(f)位于SEQ ID NO:6内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第三Chr 3GIS或与SEQ ID NO:6具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(g)位于SEQ ID NO:7内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 4GIS或与SEQ ID NO:7具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(h)位于SEQ ID NO:8内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 4GIS或与SEQ ID NO:8具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(i)位于SEQ ID NO:9内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 5GIS或与SEQ ID NO:9具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(j)位于SEQ ID NO:10内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 5GIS或与SEQ ID NO:10具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(k)位于SEQ ID NO:11内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 6GIS或与SEQ ID NO:11具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(l)位于SEQ ID NO:12内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 6GIS或与SEQ ID NO:12具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(m)位于SEQ ID NO:13内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第三Chr 6GIS或与SEQ ID NO:13具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(n)位于SEQ ID NO:14内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第四Chr 6GIS或与SEQ ID NO:14具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(o)位于SEQ ID NO:15内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第五Chr 6GIS或与SEQ ID NO:15具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(p)位于SEQ ID NO:16内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 7GIS或与SEQ ID NO:16具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(q)位于SEQ ID NO:17内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 7GIS或与SEQ ID NO:17具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(r)位于SEQ ID NO:18内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的Chr8GIS或与SEQ ID NO:18具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(s)位于SEQ ID NO:19内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第一Chr 9GIS或与SEQ ID NO:19具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(t)位于SEQ ID NO:20内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的第二Chr 9GIS或与SEQ ID NO:20具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(u)位于SEQ ID NO:21内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的Chr 10GIS或与SEQ ID NO:21具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

(v)位于SEQ ID NO:22内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的Chr 13GIS或与SEQ ID NO:22具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；以及

(w)位于SEQ ID NO:23内两个连续或不连续核苷酸位置x和y之间的Chr 14GIS或与SEQ ID NO:23具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的人基因组核苷酸序列；

任选地其中，对于(a)至(w)中定义的每个GIS，这些x和y位置独立地选自由以下组成的组：

x和y是100和1700；

x和y是200和1600；

x和y是400和1400；

x和y是800和1000；

x和y是850和950；

x和y是875和925；

x和y是890和910；以及

x和y是898和903。

2.如实施例1所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(a)。

3.如实施例1-2中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(b)。

4.如实施例1-3中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(c)。

5.如实施例1-4中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(d)。

6.如实施例1-5中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(e)。

7.如实施例1-6中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(f)。

8.如实施例1-7中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(f)。

9.如实施例1-8中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(g)。

10.如实施例1-9中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(h)。

11.如实施例1-10中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(i)。

12.如实施例1-11中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(j)。

13.如实施例1-12中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(k)。

14.如实施例1-13中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(l)。

15.如实施例1-14中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(m)。

16.如实施例1-15中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(n)。

17.如实施例1-16中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(o)。

18.如实施例1-17中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(p)。

19.如实施例1-18中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(q)。

20.如实施例1-19中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(r)。

21.如实施例1-20中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(s)。

22.如实施例1-21中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(t)。

23.如实施例1-22中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(u)。

24.如实施例1-23中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(v)。

25.如实施例1-24中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该基因组插入位点(GIS)包含(v)。

26.如实施例1-25中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入这些基因组插入位点中的任两个、三个、四个或五个中。

27.如实施例1-26中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入这些基因组插入位点中的任六个、七个、八个或九个中。

28.如实施例1-27中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入这些基因组插入位点中的任10个、11个、12个或13个中。

29.如实施例1-28中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入这些基因组插入位点中的任14个、15个、16个或17个中。

30.如实施例1-29中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入这些基因组插入位点中的任18个、19个、20个、21个或22个中。

31.如实施例1-30中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入该23个基因组插入位点中的每一个中。

32.如实施例1-31中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入五个基因组插入位点中的每一个中，这些基因组插入位点是该Chr 1GIS、该第一Chr3GIS、该第四Chr 6GIS、该第一Chr 7GIS和该第二Chr 9GIS。

33.如实施例1-32中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中将该外源转录单元插入18个基因组插入位点中的每一个中，这些基因组插入位点是该第一和第二Chr 2GIS，该第二和第三Chr 3GIS，该第一和第二Chr 4GIS，该第一和第二Chr 5GIS，该第一、第二、第三和第五Chr 6GIS，该第二Chr7GIS，该Chr 8GIS，该第一Chr 9GIS，该Chr 10GIS，该Chr13GIS和该Chr 14GIS。

34.如实施例1至9中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该细胞进一步包含不包含SEQ ID No:1-23中任一个的至少一个OCR中的外源转录单元。

35.如实施例1至10中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中对于如实施例1所述的基因组插入位点中的一个或多个，位置x和y是890和910。

36.如实施例1至11中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中对于如实施例1所述的基因组插入位点中的一个或多个，位置x和y是898和903。

37.如实施例1至12中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中对于如实施例1所述的基因组插入位点中的至少两个、三个、四个、五个或更多个，x和y是898和903。

38.如实施例8所述的经遗传修饰的细胞，其中对于五个基因组插入位点中的每一个，x和y是898和903。

39.如实施例9所述的经遗传修饰的细胞，其中对于18个基因组插入位点中的每一个，x和y是898和903。

40.如实施例1至39中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其衍生自人永生化细胞。

41.如实施例1至40中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其衍生自人视网膜上皮细胞系。

42.如实施例41所述的经遗传修饰的上皮细胞，其中该人视网膜上皮细胞系是ARPE-19细胞系。

43.如实施例1至41中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，任选地其中该多肽选自由以下组成的组：FVII蛋白、FVIII蛋白、FIX蛋白、GLA蛋白和IDUA蛋白。

44.如实施例1至43中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该多肽是FVII蛋白。

45.如实施例1至43中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该多肽是FVIII蛋白。

46.如实施例1至43中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该多肽是FIX蛋白。

47.如实施例1至43中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该多肽是GLA蛋白。

48.如实施例1至43中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该多肽是IDUA蛋白。

49.如实施例43-48中任一项所述的经遗传修饰的细胞，其中该启动子序列基本上由SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25组成或由其组成。

50.如实施例49所述的经遗传修饰的细胞，其中该启动子序列基本上由SEQ IDNO:24组成或由其组成。

51.如实施例49所述的经遗传修饰的细胞，其中该启动子序列基本上由SEQ IDNO:25组成或由其组成。

52.如实施例49所述的经遗传修饰的细胞，其中该编码序列与聚A信号序列可操作地连接，该聚A信号序列基本上由SEQ ID NO:26组成或由其组成。

53.如实施例43、47和49-52所述的经遗传修饰的细胞，其中该多肽是GLA蛋白并且该外源转录单元包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、或SEQ ID NO:32。

54.如实施例43、47和49-52所述的经遗传修饰的细胞，其中该多肽是GLA蛋白并且该外源转录单元包含SEQ ID NO:29。

55.如实施例43、47和49-52所述的经遗传修饰的细胞，其中该多肽是GLA蛋白并且该外源转录单元包含SEQ ID NO:30。

56.如实施例43、47和49-52所述的经遗传修饰的细胞，其中该多肽是GLA蛋白并且该外源转录单元包含SEQ ID NO:32。

57.如实施例53所述的经遗传修饰的细胞，其中该外源转录单元包含SEQ ID NO:33，由其组成，或基本上由其组成。

58.一种组合物，其包含多种经遗传修饰的细胞，其中该多种经遗传修饰的细胞中的每种细胞均是如实施例1至57中任一项所述的经遗传修饰的细胞。

59.如实施例24所述的组合物，其中该多种细胞通过培养单克隆细胞系获得。

60.如实施例58-59所述的组合物，其中该外源转录单元编码GLA蛋白，并且该多种细胞产生5pg/细胞/天或10pg/细胞/天中的至少任一个，至少持续至少2天、4天、1周或2周，如通过本文所述的测定测量的。

61.如实施例58-60中任一项所述的组合物，其进一步包含储存培养基，例如，培养基、冷冻保存培养基。

62.一种装置，其包含如实施例58-61中任一项所述的组合物。

63.一种可植入装置，其包含含有一种或多种经遗传修饰的细胞的至少一个细胞容纳隔室和当将该装置植入受试者中时用于减轻异物反应(FBR)的至少一个器件，其中该经遗传修饰的细胞或该多种经遗传修饰的细胞中的每种细胞均是如实施例1至62中任一项所述的经遗传修饰的细胞。

64.如实施例63所述的装置，其中该至少一个细胞容纳隔室包含包封多种工程化RPE细胞的聚合物组合物，并且任选地包含至少一种细胞结合物质(CBS)。

65.如实施例63或64所述的装置，其中该细胞容纳隔室包含藻酸盐水凝胶，并且被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含藻酸盐水凝胶，并且任选地包含设置在该屏障隔室的外表面上的具有式(I)的化合物，例如化合物101。

66.如实施例63-65所述的装置，其中该细胞容纳隔室包含藻酸盐水凝胶并且被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含藻酸盐水凝胶，并且包含设置在该屏障隔室的外表面上的具有式(I)的化合物。

67.如实施例63-66所述的装置，其中该细胞容纳隔室包含藻酸盐水凝胶并且被屏障隔室环绕，该屏障隔室包含藻酸盐水凝胶，并且包含设置在该屏障隔室的外表面上的化合物101。

68.如实施例65-67中任一项所述的装置，其中该屏障隔室包含用化合物101化学修饰的藻酸盐，并且任选地其中该屏障隔室中的藻酸盐水凝胶是离子交联的。

69.如实施例65-68中任一项所述的装置，其中该屏障隔室包含用化合物101化学修饰的藻酸盐，并且其中该屏障隔室中的藻酸盐水凝胶是离子交联的。

70.如实施例63-69中任一项所述的装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GRGDSP(SEQ ID NO:37)、GGRGDSP(SEQ ID NO:38)或GGGRGDSP(SEQ ID NO:39)组成或由其组成。

71.如实施例63-69中任一项所述的装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GRGDSP(SEQ ID NO:37)组成或由其组成。

72.如实施例63-69中任一项所述的装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GGRGDSP(SEQ ID NO:38)组成或由其组成。

73.如实施例63-69中任一项所述的装置，其中该聚合物组合物包含用肽共价修饰的藻酸盐，其中该肽基本上由GGGRGDSP(SEQ ID NO:39)组成或由其组成。

74.如实施例63-73中任一项所述的装置，其是直径为约0.75mm至约2mm的水凝胶胶囊，其中该水凝胶胶囊包含被外隔室环绕的内隔室，其中在该内隔室中含有该经遗传修饰的细胞，并且该外隔室基本上不含这些细胞。

75.一种装置的制品，其中该制品中的每个装置均是如实施例62-74中任一项所述的装置，并且该制品任选地包含药学上可接受的溶液。

76.一种治疗人受试者的法布里病的方法，该方法包括：

提供装置的制品，该制品含有多种表达GLA蛋白的经遗传修饰的细胞；以及

将该制品放置于该受试者体内；

其中该多种经遗传修饰的细胞中的每种细胞均是如实施例53-57所述的经遗传修饰的细胞。

77.如实施例76所述的方法，其中该放置步骤包括将该制品置于腹膜内空间中。

78.如实施例76或77所述的方法，其中该放置步骤包括将该制品置于腹膜腔的大囊中。

实例

为了使本文所述的本披露可以得到更完全的理解，列出了以下实例。提供了本申请所述的实例以说明本文提供的经遗传修饰的细胞、组合物和可植入装置和方法，并且这些实例不应被解释为以任何方式限制其范围。

实例1：表达GLA蛋白的克隆的生成和评估

将ARPE-19细胞工程化以使用PiggyBac转座子系统表达人GLA蛋白，其能够通过“剪切和粘贴”机制介导质粒载体和TTAA染色体位点之间的转录单元的转移。将ARPE-19细胞分开并以每6孔培养板400,000个细胞接种，然后用不同量的以下两种质粒共转染：(1)转座子载体，其包含插入由PiggyBac转座酶识别的反向末端重复(ITR)元件之间的编码SEQID NO:31的转录单元，以及(2)辅助质粒，其表达piggyBac转座酶和荧光报告蛋白(FRP)。转录单元包含SEQ ID NO:33。

将转染的池在6孔板中培养至达到75％汇合(2-3天)，用新鲜培养基更换培养基，24小时后收集细胞上清液并使用GLA活性测定测定GLA蛋白浓度，基本上如下所述。

将待评估的每个克隆的约400,000个细胞数的悬浮液添加到具有2mL的完全生长培养基(DMEM:F12，具有10％FBS以及1x青霉素-链霉素-新霉素抗生素，吉博科公司(Gibco))的6孔板的孔中(一式两份)。将板在37℃、5％CO

如上所述选择具有最高GLA上清液水平的池用于克隆分离和GLA表达的筛选，并且具有最高GLA产量的两个克隆的数据示于图5中。克隆1和2中的每一个均分泌GLA，其水平超过5pg/细胞/天的所需的最低量。在评估的1500个克隆中，几乎所有克隆都未能达到这一所需的最低量。分析克隆1和2的基因组以确定插入的转录单元的数量和位置，其中结果示于上表1中。

实例2：用于包封的示例性经遗传修饰的ARPE-19细胞的培养

可以培养包含如本文所述的稳定整合的外源转录单元的经遗传修饰的ARPE-19细胞以产生适用于包封在两隔室水凝胶胶囊中的细胞组合物。使细胞在150cm

实例3：示例性经修饰的聚合物的制备

经化学修饰的聚合物。

添加的化合物和偶联试剂的量取决于与藻酸盐结合的化合物的所需的浓度，例如缀合密度。化合物101的中等缀合密度的范围典型地为2％至5％N，而化合物101的高缀合密度的范围典型地为5.1％至8％N。为了制备用中等缀合密度的化合物101化学修饰的低分子量藻酸盐(CM-LMW-Alg-101-中等聚合物)的溶液，将溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)和化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)处理。为了制备用高缀合密度的化合物101化学修饰的低分子量藻酸盐(CM-LMW-Alg-101-高聚合物)的溶液，将溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(大约MW<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)和化合物101(10.5mmol/g藻酸盐)处理。

将反应温热至55℃持续16h，然后冷却至室温并且经由旋转蒸发平缓浓缩，然后将残余物溶于水中。将混合物通过氰基修饰的硅胶床(Silicycle公司)过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后将所得溶液彻底透析(10,000MWCO膜)并经由冷冻干燥浓缩藻酸盐溶液以提供所需的作为固体的经化学修饰的藻酸盐或使用适于产生粘度为25cP至35cP的经化学修饰的藻酸盐溶液的任何技术浓缩。

通过氮百分比燃烧分析来测量经化学修饰的藻酸盐的缀合密度。通过将经化学修饰的藻酸盐溶液对水透析(10,000MWCO膜)24小时，更换水两次，然后冻干至恒重来制备样品。

CBP-藻酸盐

例如，在藻酸盐的情况下，用50mM的2-(N-吗啉代)-乙磺酸水合物缓冲溶液(含有0.5M NaCl，pH 6.5)制备藻酸盐溶液(1％，w/v)，并依次与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)混合。N-羟基琥珀酰亚胺与EDC的摩尔比是0.5:1.0。将目的肽添加到藻酸盐溶液中。添加的肽和偶联试剂的量取决于与藻酸盐结合的肽的所需的浓度，例如肽缀合密度。通过增加肽和偶联试剂的量，可以获得更高的缀合密度。反应24h后，将反应物通过超纯去离子水(diH2O)(MWCO 3500)透析3天进行纯化，用活性炭处理30min，过滤(0.22mm过滤器)，并浓缩至所需的粘度。

通过氮百分比燃烧分析来测量经肽修饰的藻酸盐的缀合密度。通过将经化学修饰的藻酸盐溶液对水透析(10,000MWCO膜)24小时，更换水两次，然后冻干至恒重来制备样品。

实例4：用于制造水凝胶胶囊的示例性藻酸盐溶液的制备

经化学修饰的和未经修饰的藻酸盐的70:30混合物。

未经修饰的藻酸盐溶液

包含细胞结合位点的藻酸盐溶液。

实例5：示例性两隔室水凝胶胶囊的形成

根据以下所述的方案，将经遗传修饰的细胞的悬浮液作为单细胞包封在两隔室水凝胶胶囊中。

在包封之前，将所需体积的包含细胞的组合物(例如，来自如实例1中所述的细胞培养物)以1,400r.p.m.离心1分钟，并且用无钙Krebs-Henseleit(KH)缓冲液(4.7mM KCl、25mM HEPES、1.2mM KH

在制备水凝胶胶囊之前，通过使用无菌工艺通过0.2-μm过滤器过滤来对缓冲液和藻酸盐溶液进行灭菌。

为了制备直径为约1.5mm的两隔室水凝胶毫胶囊，如下设置静电液滴发生器：ES系列0-100kV，20瓦高压发电机(EQ系列，松山(Matsusada)，北卡罗莱纳州，美国)连接到同轴针的顶部和底部(内腔22G，外腔18G，Ramé-Hart仪器公司(Ramé-Hart Instrument Co.)，苏卡桑那(Succasunna)，新泽西州，美国)。将内腔附接到第一5-ml Luer-lock注射器(BD公司，新泽西州，美国)，该注射器连接到垂直定向的注射泵(Pump 11Pico Plus，哈佛设备公司(Harvard Apparatus)，霍利斯顿(Holliston)，马萨诸塞州，美国)。外腔经由鲁尔接头连接到第二5-ml Luer-lock注射器，该注射器连接到水平定向的第二注射泵(Pump 11PicoPlus)。将含有悬浮于经GRGDSP修饰的藻酸盐溶液中的经遗传修饰的细胞(作为单细胞)的第一藻酸盐溶液放置于第一注射器中，并且将包含经化学修饰的藻酸盐和未经修饰的藻酸盐的混合物的无细胞藻酸盐溶液放置于第二注射器中。两个注射泵使第一和第二藻酸盐溶液从注射器移动通过同轴针的两个腔，并且含有两种藻酸盐溶液的单个液滴从针头挤出到含有交联溶液的玻璃皿中。每个Pico Plus注射泵的设置直径为12.06mm，并且调节每个泵的流速以使两种藻酸盐溶液的流速比为1:1。因此，在总流速设置为10ml/h的情况下，每种藻酸盐溶液的流速约为5mL/h。以相同方式制备对照(空)胶囊，除了用于内隔室的藻酸盐溶液是无细胞溶液之外。

在挤出所需体积的藻酸盐溶液后，将藻酸盐液滴在交联溶液(含有25mM HEPES缓冲液、20mM BaCl

等效物和范围

本申请引用了不同发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物，将其全部通过引用以其全文并入本文。如果在任一个并入的参考文献和本说明书之间有冲突，以本说明书为准。另外，在现有技术之内的本披露的任何特定实施例可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为这样的实施例被视为对于本领域普通技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本披露的任何特定实施例可以因为任何原因从任一权利要求中排除，不管是否与存在的现有技术相关。

本领域技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的特定实施例的许多等效形式。本文所述的实施例的范围不旨在限制以上说明书、附图或实例，而是如在所附权利要求中所陈述的。本领域的普通技术人员要认识到的是，在不脱离如在以下权利要求中所定义的本披露的精神或范围下，可以对本说明书进行各种改变和修改。

序列表

<110> 西吉隆医疗股份有限公司（SIGILON THERAPEUTICS, INC.）

<120> 经遗传修饰的人细胞系及其用途

<130> S2225-7043WO

<140>

<141>

<150> 63/168,727

<151> 2021-03-31

<160> 40

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1800

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

cgactcttca gataaaacca agcataaggg ttgggagagg gaagcaagta tgtgaaggaa 60

atagagaagt tatcagcaca ataggaaggg aattatgaag ttgactgcag tgtgaggatc 120

agctgtggag aaagccacta ccaatgcgaa ggcgtgaaat taaagtgggg agcatggagg 180

aaaagagaaa ggctgtctgc agctcagata aaatccttga tgtatcactg ttgaaaatgg 240

agtggacctc agtgatttga ggaaggcaaa gatcacacat tgaagtttaa cagtaaagaa 300

aggaagacac tggatgatag ctgggtggag gaaaagtcaa cagaacaagc gtgaagaatt 360

cagtgaggtc ccaaaggaga cacaaacagg tcacagggga tagatgtgaa aaaaaagaat 420

aaggatatct ttcctgaaat aggaagaaat ggagaaagag atattttgag gaatgcacct 480

ccattttcac acaaagaaga agacaagatc atctattatg aaagggaaag gtgcatttgg 540

aaaccaaaag aaagcattca agatatagaa ctgattcttg gaaacaattt gctctttgtc 600

aggaagccag caatgataaa ctctatcact aattttagta tcaattcctt aaaaatgatt 660

ttcaatatat gagaaaagtt ggaaagcgat taggggagtg tgtgagggta cagatgaaac 720

aagaaaggaa atgaactgat attacttcta ttctttctac gttatgtttg aaatctccca 780

aaaccttttt ttcaatttta aggaacgcaa ttaattcctc atcgttcata tttctaagat 840

caaacaaaga cattgcttgg taaataagaa tacggaatgc acctatttcc cttacttctt 900

aatgacaaat gccttttcca tctttatttt gttgaataga acagctctca aaaactatga 960

aatattcaaa atgaatgcca gggatttctg tcttctgaat taattcagat cttgcaaaac 1020

ataacttatg atgtcaatac aatagggcaa ctgagagtca aaaacaacta tttaagtgaa 1080

acaaatctcc cagcattgtc aaaatcatgt cttagtttaa aaatatataa aaaatattct 1140

ttacttacat aagaaaaaca atcccagaac tttggaagaa attgagggaa tttatgaaga 1200

atcaatataa taatccattc tataaaatat tttatggatg cttgattgtt ggtgaaacca 1260

gcctggaaaa tcctgtcaat aattccattc aagaaattct gagaaaaaaa gttcacaatt 1320

aaccagttac agttattcat tttaatttaa aaatagtctc catttaaaat aaaatagctt 1380

aaagttttta tcataagtaa tttattggat ctacaactct ccgagcaaag actctaaaaa 1440

ctactgatta aaatataatg atgaagtacc ttcattcagt actttataat ttacctggac 1500

atcagttcta tctataagga aggttatcca tcacctgtat ttttacaggg aaaggaaaag 1560

actcagaaaa gctgaataac cctcccaaag tcacatacct agtaagtgga agaattcagg 1620

ttcaaatcaa gatctgccaa gatgccaggg cttaaacctt gtaacaaggg atggtacaga 1680

gactgaagtc agcaggtggg aaacagcatc ccagaggggc aggtcttggg ccactgagcc 1740

ctctgttcag gctcgtcgtc ctcctgccct catggtctgt gttgccccac aactaccgca 1800

<210> 2

<211> 1800

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

tcgagaccag cctgcccaac gtggtgaaac ccgtctctac taaaaataca aaaaaattag 60

ctgggcatgg tggcgggggc ctgtaatctc agctactcgg gttaggagaa tgaacccagg 120

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cagtaagttt tcatactgcc ttcatttcct ctttaaaaaa taatcaattt taggctgggt 1560

gcagtggctc atgcctgtaa ccctagcact ttgggaggac gaggcaggtg gctcacctga 1620

ggtcaggagt tcgagaccag cctggccaac atggcgaaac tccatctcta ctaaaaatac 1680

aaaaattagc caggtgttgt ggcatatgcc tataatccca gctactcagg aggctcaggc 1740

aagagaatca cttgaacccg tgggcagagg ttgcagtgag cagagatcgc gccactgcac 1800

<210> 3

<211> 1800

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

tgttgcaagg tatatctgat caaaggggaa cccaggcatc aggaggaggc tagggacagg 60

ggaccacgcc attgcatggt gacactcagc agacatctgc ctctcaaata aaccagaatc 120

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gagacggaag gaactcagcc taggtccaag ggggagctca ttccacctag aaagagaatc 240

ctgatctctc tggaaaaaaa ggagagatgt tgagctacaa ggaggcaagg ctcacagagc 300

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acaaatctgt aaggcaggga ctggagggag ctgaagctag agacacaggg agctaagatg 1800

<210> 4

<211> 1800

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

gcaggggtag tgcacttgcc attagtcctt ttaagttgca attcttccca ccagctaaag 60

agaaatatat aaattatttc tagctaggtg gcaaaactcc cccagccatc ttgtcaaatg 120

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gtaacataga tgtttgtaaa catacagtca tttgatggct aaggaagttt tgccacccag 720

ctagaagtaa cttatgtatt gttagctaga agaatttcaa cctgaaattg acccaatttt 780

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ttatcttaca ttttagttgg tcaaacctta atggcttttt caaagactta gagaaagttt 900

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ctgagttttc tttttgaatt ttcctctact aaattatatc tttagttttg gaatcatacg 1020

tcacatcaaa ttttagatta gagatggtaa actgtttggc ctgtgagcca gatacggctt 1080

gcaggtatgt attttttggc ctgcccagtt tgttaaattc tgaataaagc catcatttaa 1140

aaaccacaag ttttaggcgg ggcgtggtgg ctcacagctg taatcctagc actttgggag 1200

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aaccccgtct ctactaaaaa tgcaaaaatt agtcgggcat ggtggcacat gcctgtaatc 1320

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ctagcccggt gtggcaatgt gcgcctgtag tcccagctac tctgggatga ggcaggaaaa 1800

<210> 5

<211> 1800

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5