一种银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备方法

技术领域

本发明涉及化妆品的技术领域，具体涉及一种银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备方法。

背景技术

衰老为困扰人们的首要皮肤问题之一，其形成原因有多重，皮肤长期缺水、胶原蛋白流失、皮肤过氧化、血液循环差等均会造成皮肤弹性变差，皮肤失去组织支撑而导致的皮肤松弛，出现皱纹等衰老迹象，先如今由于不良生活习惯以及工作压力等问题，人们出现衰老迹象越来越年轻化了，可知具有显著抗衰功效产品具有良好的市场前景；

但经过调研，市面上的抗衰老功效产品的功效单一，无法很好地对应衰老形成原因，在补水保湿、促进胶原蛋白生成、抗氧化等作用上一般仅达到其中的一种或几种功效，因此其产品并不适用于大部分使用者，且其中添加的保湿成分绝大部分选用常规的具有瞬时保湿效果的化学试剂，其抗衰老功效成分也只有瞬时效果，并不能真正改善皮肤问题，因此市场上需要一款集保湿、抗衰老紧致等多重功效的真正作用起效的护肤品。

发明内容

针对上述的问题，本发明的目的在于提供一种银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备方法。

本发明的技术内容如下：

本发明提供一种银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将水加热至80-90℃，保温20-40分钟，降温至70-90℃，加入聚谷氨酸钠、银耳多糖，搅拌均匀使溶解，为A相；

步骤2：取原料丁二醇和对羟基苯乙酮加热至40-50℃搅拌使溶解，然后加入植物复合油混合均匀为B相；

步骤3：A相原料降温至40-50℃，加入B相原料，30-40℃时加入C相原料植物提取物、精氨酸多肽、皮肤调理剂、卡波姆、乳酸钠、透明质酸钠和预好的D相原料丁二醇、聚山梨醇酯-20和棕榈酰五肽-4和保湿剂搅拌均匀，合格后出料,灌装，入库；

所述A相包含以下重量份组份：聚谷氨酸钠0.02-0.08份、银耳多糖0.01-0.07份、水90-100份。

所述B相包含以下重量份组份：丁二醇2-3份、对羟基苯乙酮0.4-0.6份、植物复合油0.2-0.4份。

所述植物复合油包含北非雪松树皮油0.0001-0.0003质量份和依兰花油0.0001-0.0003质量份。

所述C相包含以下重量份组份：精氨酸多肽0.0001-0.0003份、卡波姆0.001-0.003份、乳酸钠0.02-0..04份、透明质酸钠0.01-0.03份、皮肤调理剂0.0001-0.0003份和植物提取物0.2-0.4份。

所述皮肤调理剂包含以下重量份组份：鱼卵提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸钾。

所述皮肤调理剂包含以下重量份组份：鱼卵提取物2-4份、氯化钠0.5-1份、氯化钾0.5-1份、磷酸氢二钠0.2-0.4份和磷酸钾0.1-0.3份。

所述植物提取物包含以下重量份组份：蛹虫草提取物0.5-1份、马铃薯果肉提取物0.8-1份、积雪草叶提取物0.6-1份、紫玉兰花提取物0.8-1.2份、滨海当归叶/茎提取物1-1.4份、古钩藤花/叶提取物2-4份。

所述D相包含以下重量份组份：精氨酸多肽0.0001-0.0003份、聚山梨醇酯-200.01-0.03份和棕榈酰五肽-4 0.001-0.003份、保湿剂0.3-0.5份。

所述保湿剂为铁皮石斛茎提取物1.5-2.5份、1,2-己二醇2-4份、甘油4-6份、1,2-戊二醇2-4 2-4份。

有益效果：本发明提供的银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备工艺，通过不同温度下对A相、B相、C相和D相混合，能保留各成分活性，克服了护肤品成分在加工生产时容易造成功效损失的缺点，使产品成分在生产前后其抗衰抗皮肤松弛的功效稳定；含有银耳多糖、聚谷氨酸钠这两种高效保湿成分，能激活水通道蛋白的表达，进而提高皮肤表皮甘油含量及含水量，以此来维护表皮弹性、屏障及损伤修复的功能；同时含有铁皮石斛茎提取物以及二元醇的保湿剂，含有蛹虫草提取物、马铃薯果肉提取物、积雪草叶提取物、紫玉兰花提取物、滨海当归叶/茎提取物、古钩藤花/叶提取物的植物提取物以及含有鱼卵提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸钾的皮肤调理剂，保湿剂具有吸水以及增加毛细血管的血流量、抗氧化作用，皮肤调理剂通过PH缓冲液成分能辅助激活鱼卵提取物的活性成分，具有抗氧化和促进胶原蛋白再生的作用，植物提取物含有的活性成分对荧光酶的活化率和对干细胞的增殖作用，能辅助紧致皮肤、抗衰。

附图说明

图1空白对照组，阳性对照组和样品组细胞状态图；

图2为免疫荧光细胞化学染色结果图；

图3为校正后总细胞荧光结果图，*p<0.05表示与NC组比较；

图4为护肤液浓度对弹性蛋白酶的抑制率的影响统计图。

具体实施例

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

本发明所用的银耳多糖来源于广州熙研生物科技有限公司。

实施例1

一种银耳多糖复合多肽抗皱抗松弛护肤液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将水加热至85℃，保温30分钟，降温至80℃，加入聚谷氨酸钠、银耳多糖，搅拌均匀使溶解，为A相；

步骤2：取原料丁二醇和对羟基苯乙酮加热至45℃搅拌使溶解，然后加入植物复合油混合均匀为B相；

步骤3：A相原料降温至45℃，加入B相原料，35℃时加入C相原料植物提取物、精氨酸多肽、皮肤调理剂、卡波姆、乳酸钠、透明质酸钠和预好的D相原料丁二醇、聚山梨醇酯-20和棕榈酰五肽-4和保湿剂搅拌均匀，合格后出料,灌装，入库；

所述A相包含以下重量份组份：聚谷氨酸钠0.05份、银耳多糖0.04份、水95份。

所述B相包含以下重量份组份：丁二醇2份、对羟基苯乙酮0.5份、植物复合油0.3份。

所述植物复合油包含北非雪松树皮油0.0002质量份和依兰花油0.0002质量份。

所述C相包含以下重量份组份：精氨酸多肽0.0002份、卡波姆0.002份、乳酸钠0.03份、透明质酸钠0.02份、皮肤调理剂0.0002份和植物复合提取物0.3份。

所述皮肤调理剂包含以下重量份组份：鱼卵提取物3份、氯化钠0.8份、氯化钾0.8份、磷酸氢二钠0.3份和磷酸钾0.2份。

所述植物提取物包含以下重量份组份：蛹虫草提取物0.8份、马铃薯果肉提取物0.9份、积雪草叶提取物0.8份、紫玉兰花提取物1份、滨海当归叶/茎提取物1.2份、古钩藤花/叶提取物3份。

所述D相包含以下重量份组份：精氨酸多肽0.0002份、聚山梨醇酯-20 0.02份和棕榈酰五肽-4 0.002份、保湿剂0.4份。

所述保湿剂为铁皮石斛茎提取物2份、1,2-己二醇3份、甘油5份、1,2-戊二醇2-4 3份。

功效验证

一、检测银耳多糖的功效

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是贯穿生物膜形成水通道的完整膜蛋白。AQPs的主要功能是通过生物膜运输水、甘油和其他小分子溶质。其中，AQP3在角质形成细胞的质膜中高度表达，并在皮肤表皮的基底层中作为水和甘油转运蛋白起作用。缺失了AQP3的皮肤表皮甘油含量及含水量会降低，还会影响表皮弹性、屏障功能及损伤修复的功能。因此理论上有效的补水方式，就是激活水通道蛋白或增多水通道蛋白，从真皮层中运输水分到表皮层。

试验目的：将样品添加至人永生化角质形成细胞(HaCaT)中培养，通过免疫荧光细胞化学技术来检测样品对HaCaT细胞AQP3表达的影响。

试验细胞：人永生化角质形成细胞(HaCaT)：购自中国科学院昆明细胞库。

样品制备，毒性试验分组如表1所示，AQP3表达检测试验分组如表2所示，将样品使用DMEM完全培养基稀释至所需检测浓度，共制备1mL的样品工作液。

表1

表2试验分组

1、细胞毒性检测

(1)以1E4/孔种板，96孔板加入HaCaT细胞培养；

(2)按试验分组加入样品继续培养；

(3)取出96孔板拍照记录后，加MTT，避光培养；

(4)吸弃上清，加DMSO溶解结晶，摇床震荡；

(5)酶标仪上以490nm测定吸光度；

细胞存活率计算

存活率(％)＝OD490e/OD490b×100％

式中：OD490e—试验样品组、阳性、阴性对照组吸光度；OD490b—空白对照组吸光度。

实验结果用平均值表示，计算每个样品细胞存活率。

以上检测结果如表3所示，阳性对照组和样品组细胞状态图如图1所示。

表3样品毒性检测结果

根据细胞毒性试验结果可知，银耳多糖样品对细胞几乎没有毒性，1.125、0.56、0.28mg/mL三个浓度的样品对细胞的毒性作用最小，细胞存活率达到100％以上。

2、AQP3表达检测

(1)取出无菌细胞爬片，放入培养板中；

(2)T25瓶中收集汇合度达80％～90％的HaCaT细胞悬液，计数，调整细胞密度接种于培养板，于二氧化碳培养箱中培养；

(3)取出培养板，弃去孔中培养液，按照试验分组列表分别加入不同浓度的工作液，于二氧化碳培养箱中继续培养。

(4)取出培养板，弃去孔中培养液，加入PBS洗涤；

(5)加入4％多聚甲醛固定液固定细胞，加入PBS洗涤；

(6)加入0.2％曲拉通X-100溶液透化处理，加入PBS洗涤；

(7)加入牛血清白蛋白溶液封闭处理；

(8)分别加入Anti-AQP3 Antibody及Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa

(9)DAPI染色液复染，加入PBS洗涤；

载玻片上加入一滴抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照，免疫荧光细胞化学染色检测结果如图2所示，从左到右分别为AQP3、DAPI、Merge。。

3、校正后总细胞荧光计算

使用ImageJ 1.53t软件测量荧光强度，并计算校正后总细胞荧光(Correctedtotal cell fluorescence,CTCF)，计算公式如下：

CTCF＝累积光密度–(待测细胞面积×背景平均光密度)

数据统计使用GraphPad Prism 7.00软件和独立样本t检验，所有数据显示为平均值±标准差，若p值小于0.05，则认为具有统计显著性，校正后总细胞荧光结果如图3所示。

综上所述，本次检测试验观察免疫荧光细胞化学染色结果，与空白对照组相比，阳性对照组细胞AQP3 CTCF提高，且差异具有显著性(p<0.01)，试验系统正常工作。

与空白对照组相比，1.125mg/mL、0.56mg/mL、0.28mg/mL银耳多糖样品组细胞AQP3CTC分别约为空白对照组的99.5％、176.3％、178.1％，差异均具有显著性(p<0.05)。

二、检测护肤液的抗皱功效

将实施例制备的护肤液配制若干浓度，分别加入地衣红糖性蛋白和硼酸盐缓冲溶液，在37℃水浴中恒温震荡10min，再加入弹性蛋白酶溶液，在495nm处测定吸光值，计算弹性蛋白酶的抑制率，结果如表4和图4所示。

表4

由检测结果可知，本发明制备得到的护肤液能显著抑制弹性蛋白酶，浓度越大抑制效果越好。

综上所述，本次检测试验条件下，浓度为0.56mg/mL、0.28mg/mL的银耳多糖样品均可提高HaCaT细胞水通道蛋白(AQP3)表达，实验表明银耳提取物可提高水通道蛋白的表达，增加从真皮层到表皮层的水分运输，显著提高细胞的水合能力，增加细胞角质层含水量；能抗氧化抗衰老，具有清除超氧自由基和羟基自由基的能力；能改善肤感，具有良好的亲肤性和较高的粘度，使用后肤感爽滑；

本发明制备得到的护肤液添加了银耳多糖这一保湿抗衰功效成分，并复配保湿剂、植物复合油、含有植物提取物以及皮肤调理剂等多种功效成分，能显著抑制弹性蛋白酶活性，在使用浓度为80％时，其抑制率达到80％以上，达到抗衰抗皱、紧致皮肤的作用。