一种重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开一种重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染引起的包括多种家畜和多种哺乳动物共患的一种急性传染病，对养殖业造成了巨大经济损失。猪是该病毒的天然宿主和贮存者，在养殖过程中，伪狂犬病毒感染可引起怀孕母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪神经紊乱、快速死亡和育肥猪呼吸道疾病、生长缓慢等。2011年，变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，给该病的防控增加了新的难题。预防猪伪狂犬病最行之有效的办法是接种疫苗。针对当前猪伪狂犬变异株的流行现状，有必要对PRV变异毒株进行改造，研制免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗，有效的预防和控制猪伪狂犬病。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，通过构建免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗株，来实现对猪伪狂犬病的有效预防和控制。

本发明提供了一种重组伪狂犬病毒，所述重组伪狂犬病毒不含UL48蛋白的编码基因。

上述重组伪狂犬病毒中，所述UL48蛋白为如下A1）或A2）的蛋白质：

A1）其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

A2）与A1）具有98%以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。

所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。所述98％以上的同一性可为至少98%、99%或100%的同一性。

本发明提供了一种构建重组伪狂犬病毒的方法，包括降低目的伪狂犬病毒中UL48蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中所述UL48蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中所述UL48蛋白的编码基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。

上述方法中，所得重组伪狂犬病毒诱导的宿主I型IFN表达量高于所述目的伪狂犬病毒，且复制能力与所述目的伪狂犬病毒没有显著差异。

上述方法中，所述降低目的伪狂犬病毒中UL48蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中所述UL48蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中所述UL48蛋白的编码基因的表达量，是通过敲除所述目的伪狂犬病毒中的所述UL48蛋白的编码基因实现的。

上述方法中，UL48蛋白的编码基因的序列是序列表中SEQ ID No.1。

上述方法中，所述敲除所述目的伪狂犬病毒中的所述UL48蛋白的编码基因是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现的。

所述CRISPR/Cas9基因编辑系统以所述UL48基因中符合5’-N

所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括sgRNA表达载体，所述sgRNA的靶点是SEQ IDNo.5和/或SEQ ID No.6。

上述方法中，所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒HeNZZ株。

由上述的方法构建的重组伪狂犬病毒也属于本发明的保护范围。

本发明还提供所述的重组伪狂犬病毒在制备预防和/或治疗伪狂犬病毒感染所致疾病的药物中的应用。

本发明还提供所述的重组伪狂犬病毒在制备伪狂犬病毒疫苗中的应用或在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制中的应用。

所述调控伪狂犬病毒免疫抑制可为提高伪狂犬病毒感染后宿主I型IFN基因的表达量。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，所述物质为降低伪狂犬病毒中所述UL48蛋白活性、降低伪狂犬病毒中所述UL48蛋白含量或/和降低伪狂犬病毒中所述UL48蛋白的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述物质为以下B1）-B5）中的任一种：

B1）核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的两个单链DNA；

B2）编码所述sgRNA的核酸分子；

B3）含有B2）所述核酸分子的表达盒；

B4）含有B2）所述核酸分子的重组载体、或含有B3）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B2）所述核酸分子的重组微生物、或含有B3）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物。

所述重组载体的重组微生物为重组伪狂犬病毒。

所述重组伪狂犬病毒可为上述方法构建的重组伪狂犬病毒。

本发明所述重组伪狂犬病毒理解为不仅包含第一代到第二代重组病毒，也包括其子代。

本发明首次发现，间质蛋白UL48是伪狂犬变异株导致宿主免疫抑制的关键蛋白，能够显著抑制宿主IFN的表达，从而抑制宿主天然免疫和促进病毒的免疫逃逸。因此，构建伪狂犬变异株UL48基因缺失株是开发新型伪狂犬病毒基因缺失疫苗的一种有效手段。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬变异株基因缺失型弱毒株，该方法构建的伪狂犬变异株基因缺失弱毒株在UL48基因部位发生特异性缺失突变。所得伪狂犬变异株基因缺失弱毒株感染宿主细胞后诱导的I型IFN基因表达显著提高，并且病毒复制显著减弱。因此，UL48基因缺失突变能显著降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，本发明可用于预防和/或治疗伪狂犬病毒感染所致疾病。

附图说明

图1为实施例1中转化pX459-gRNA1和pX459-gRNA2后菌落的PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准（DL2000 DNA marker），1为pX459-gRNA1单菌落，2为pX459-gRNA2单菌落，NC为阴性对照（去离子水）。

图2为实施例1中UL48基因缺失突变单克隆病毒噬斑PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准（DL2000 DNA marker），1为噬斑单克隆1号病毒DNA，P.C为阳性对照（野生型伪狂犬病毒HeNZZ株DNA），NC为阴性对照（去离子水）。

图3为实施例1中UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒的DNA序列测序结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒HeNZZ株的UL48基因编码序列（CDS）（序列表中SEQ ID No.1），PRV-△UL48为UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒的UL48基因相应区域的核苷酸序列（序列表中SEQ ID No.3）。

图4为实施例1中UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒的氨基酸序列测序结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒HeNZZ株UL48基因编码序列（CDS）编码的氨基酸序列（SEQ IDNo.2），PRV-△UL48为UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒UL48基因相应区域的编码的氨基酸序列（SEQ ID No.4）。

图5为实施例2中UL48基因缺失对IFN表达的影响结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒HeNZZ株，PRV-△UL48为UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒HeNZZ株；所示数据表示为平均值±标准差（Mean ± SD），**表示P≤0.01 ，***表示P≤0.001 （Student’s

图6为实施例2中UL48基因缺失对伪狂犬病毒复制影响的结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒HeNZZ株，PRV-△UL48为UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒HeNZZ株；所示数据表示为平均值±标准差（Mean ± SD），*表示P≤0.05，**表示P≤0.01 （Student’s

图7为实施例1中Lip2000转染HEK-293T细胞的反应体系（12孔板）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

1 分子生物学试剂

Bbs

Lipofectamine 2000（11668019）为ThermoFisher公司产品。

2 载体与细胞株、病毒株

pX459M载体（Addgene #62988）为Addgene载体库产品。

JM109大肠杆菌（9052）为大连宝生物公司产品。

猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）（ATCC®CRL-2843），HEK-293T细胞（ATCC®ACS-4500），BHK-21细胞（ATCC®CCL-10），PK-15（ATCC®CCL-33）均为ATCC产品。

下述实施例中的伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）为GenBank: OQ744680.1（18-JUN-2023）中的Suid alphaherpesvirus 1 isolate PRV-HeNZZ，由河南农业大学国家动物免疫学国际联合中心惠赠。

3 溶液和培养基

下述实施例中所用的溶液和培养基的配制方法如下：

含氨苄抗性的LB培养基的配制方法为（以200 mL为例）：固体LB培养基（200 mL）:酵母提取物1 g，胰蛋白2 g，氯化钠2 g，3 g琼脂粉，溶解于200 mL去离子水中，120℃高压灭菌20 min，在培养基将至50℃时，在超净台中加入200 μL氨苄抗生素（100 mg/mL），混匀后倒入培养皿中，凝固后4℃保存。

含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基的配制方法为（以500 mL为例）：将50 mL的FBS和5 mL 青链霉素双抗（5000 U/mL）加入到450 mL DMEM培养基中，充分混匀。

Opti-MEM培养基(31985088)、FBS（A3160901）、青链霉素（5000U/mL）(15070063)和DMEM培养基（11995065）均为Gibco产品。

实施例1、构建UL48基因缺失的伪狂犬病毒株（即UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒）

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对伪狂犬病毒HeNZZ株的UL48基因进行特异性缺失。具体操作如下：

1、UL48基因敲除载体的构建与鉴定

1.1 伪狂犬病毒HeNZZ株UL48蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2：

MRDEECVVAFDEALLGGAAPGRPPVVAVPRAASPDALYQRLISDLAFDEGPALLSAMERWNEDLFSCLPGNEDLYARMVMLSASADEVAAQVQAPTADASVDLGVPGAEPMPRVPAVEEELPAYVAAVERFFVSTLRAREERYARLLDAYCRAVLRYLHAQARRDEGRLRQLVRGRYYRDVARLARLLFLHLYVATARELSWRLHADQVVAQDVFMSLRYEWDQTRQLTCLFHPVLFNHGVVLLAGAPVPAAQLRAVNRRRRELGLPLVRAGLIEEDGADLVEEPPFSAALPRAAGYLSHQVRIKMEAYSREYRDHTYCRPPSPVASYGSTAEALLPPPSPSAVLPCDPTPPPRVSAAPLITTVTLAEAEEDGALTTAAPAAAVATATVASPGPATPAYHLIPRDALNRMFEM

伪狂犬病毒HeNZZ株UL48基因的基因序列参考Genbank中HeNZZ（Suidherpesvirus 1 isolate HeNZZ/2017）的基因序列（GenBank: OQ744680.1）。

为敲除伪狂犬病毒UL48基因，选取了位于UL48基因序列中两段符合5’-N

本实施例中靶序列1的序列为5’-CGTTCGACGAGGCCCTGCTGGGG-3’（SEQ ID No.5），针对靶序列1的gRNA命名为gRNA1，gRNA1的序列为：5’-CGTTCGACGAGGCCCTGCTG-3’（SEQ IDNo.7）。靶序列2的序列为：5’-CATGTCCCTGCGCTACGAGTCGG-3’（SEQ ID No.6），针对靶序列2的gRNA命名为gRNA2，gRNA2的序列为：5’- CATGTCCCTGCGCTACGAGT -3’（SEQ ID No.8）。

1.2 引物的磷酸化与退火

针对上述UL48基因的gRNA基因，设计DNA引物F和R（针对gRNA1的引物具体称为F1和R1，针对gRNA2的引物具体称为F2和R2），并合成。

F1：5’-

R1：5’-

F2：5’-

R2：5’-

合成的F和R通过退火获得双链互补序列，引物退火反应体系：前向引物F（100 μM）1 μL、反向引物R（100 μM）1 μL、10×T

1.3 重组载体的构建

1）pX459M-gRNA1的构建和鉴定

将纯化的pX459M载体以

2）pX459M-gRNA2的构建和鉴定

将纯化的pX459M载体以

2、UL48基因缺失突变伪狂犬病毒的构建

将重组载体pX459-gRNA1和pX459-gRNA2共转染HEK-293T细胞，转染体系如图7所示。

操作方法：首先将图7中A1和A2试剂混合均匀得到A组液体，再将B1和B2试剂混匀得到B组液体，然后将A组液体和B组液体均匀混合在一起，室温静置20分钟。将反应产物均匀加入含10%FBS的DMEM培养基培养的HEK-293T细胞上，于37℃、5% CO

3、UL48基因缺失突变伪狂犬病毒的筛选

将收取的病毒液用BHK-21细胞进行噬斑纯化，挑取单克隆病毒。

具体操作方法为：将BHK-21细胞铺于细胞板（六孔板），细胞汇聚成单层方可进行实验。将收取的病毒液用纯DMEM进行倍比稀释（通常使用10

以提取的噬斑单克隆1号病毒DNA为模板，以野生型伪狂犬病毒HeNZZ株DNA为阳性对照，以去离子水为阴性对照。以UL48全长引物（由UL48 F和UL48 R组成）进行PCR扩增，引物序列如下：

UL48 F: 5’-ATGCGCGACGAGGAGTGCGTGGTCG-3’（SEQ ID No.14）；

UL48 R: 5’-TCACATCTCAAACATGCGGTTGA GC-3’（SEQ ID No.15）。

PCR反应体系：模板DNA 2 μL；上、下游引物各1 μL；2×GC buffer 25 μL，2.5 mMdNTP 4 μL；rTaq 0.25 μL；加超纯水至总体积50 μL。

PCR反应条件：98℃ 预变性3 min；98℃ 变性10 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。

产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为623 bp，切胶回收，将回收产物进行DNA测序，确定UL48基因的敲除效果。

电泳结果见图2，名称为PRV-△UL48的重组伪狂犬病毒的核苷酸序列测序结果及氨基酸序列结果见图3和图4，显示PRV-△UL48的UL48基因相应区域的核苷酸序列（SEQ IDNo.3）与野生型伪狂犬病毒HeNZZ株的UL48基因编码序列（CDS）（SEQ ID No.1）相比缺少了619 bp，导致其编码的氨基酸序列从SEQ ID No.2变为了SEQ ID No.4，表明PRV-△UL48为UL48基因被敲除的单克隆伪狂犬变异株株，该毒株为UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒。

SEQ ID No.1

ATGCGCGACGAGGAGTGCGTGGTCGCGTTCGACGAGGCCCTGCTGGGGGGCGCGGCCCCGGGCCGGCCGCCCGTGGTGGCCGTCCCGCGGGCGGCCAGCCCGGACGCGCTGTACCAGCGCCTCATCAGCGACCTGGCCTTCGACGAGGGCCCGGCGCTGCTGAGCGCCATGGAGCGCTGGAACGAGGACCTGTTCTCGTGCCTGCCCGGCAACGAGGACCTGTACGCGCGCATGGTCATGCTCTCGGCCTCCGCGGACGAGGTGGCGGCCCAGGTCCAGGCGCCGACGGCGGACGCGAGCGTCGACCTCGGGGTGCCCGGGGCGGAGCCCATGCCGCGGGTCCCGGCCGTGGAGGAGGAGCTGCCCGCGTACGTGGCGGCCGTGGAGCGCTTCTTCGTGTCCACGCTGCGGGCGCGCGAGGAGCGGTACGCGCGCCTGCTGGACGCCTACTGCCGCGCGGTGCTGCGCTACCTGCACGCGCAGGCGCGCCGCGACGAGGGCCGGCTCCGGCAGCTGGTGCGCGGGCGCTACTACCGCGACGTCGCGCGCCTGGCGCGCCTGCTCTTTCTGCACCTGTACGTGGCCACGGCGCGCGAGCTCTCGTGGCGCCTGCACGCGGACCAGGTGGTGGCCCAGGACGTGTTCATGTCCCTGCGCTACGAGTGGGACCAGACGCGGCAGCTGACGTGCCTCTTCCACCCGGTGCTGTTCAACCACGGCGTGGTGCTGCTGGCGGGCGCGCCGGTGCCGGCCGCGCAGCTGCGCGCCGTCAACCGCCGCCGGCGCGAGCTGGGCCTGCCGCTCGTGCGCGCCGGCCTCATCGAGGAGGACGGCGCCGACCTGGTCGAGGAGCCGCCGTTCTCCGCCGCGCTGCCGCGCGCCGCCGGCTACCTCTCGCACCAGGTGCGGATCAAGATGGAGGCCTACTCGCGCGAGTACCGCGACCACACGTACTGCCGCCCGCCCTCGCCCGTGGCCAGCTACGGCAGCACCGCGGAGGCCCTGCTGCCGCCCCCGTCGCCCTCGGCCGTGCTGCCCTGCGACCCGACGCCGCCGCCGCGCGTCTCGGCCGCCCCGCTCATCACCACGGTGACGCTGGCCGAGGCCGAGGAGGACGGCGCGCTGACGACGGCGGCGCCCGCGGCCGCGGTCGCGACCGCGACGGTCGCCTCGCCCGGGCCCGCCACCCCCGCCTACCACCTCATCCCCCGCGACGCGCTCAACCGCATGTTTGAGATGTGA

SEQ ID No.3

ATGCGCGACGAGGAGTGCGTGGTCGCGTTCGACGAGGCCCTGAGTGGGACCAGACGCGGCAGCTGACGTGCCTCTTCCACCCGGTGCTGTTCAACCACGGCGTGGTGCTGCTGGCGGGCGCGCCGGTGCCGGCCGCGCAGCTGCGCGCCGTCAACCGCCGCCGGCGCGAGCTGGGCCTGCCGCTCGTGCGCGCCGGCCTCATCGAGGAGGACGGCGCCGACCTGGTCGAGGAGCCGCCGTTCTCCGCCGCGCTGCCGCGCGCCGCCGGCTACCTCTCGCACCAGGTGCGGATCAAGATGGAGGCCTACTCGCGCGAGTACCGCGACCACACGTACTGCCGCCCGCCCTCGCCCGTGGCCAGCTACGGCAGCACCGCGGAGGCCCTGCTGCCGCCCCCGTCGCCCTCGGCCGTGCTGCCCTGCGACCCGACGCCGCCGCCGCGCGTCTCGGCCGCCCCGCTCATCACCACGGTGACGCTGGCCGAGGCCGAGGAGGACGGCGCGCTGACGACGGCGGCGCCCGCGGCCGCGGTCGCGACCGCGACGGTCGCCTCGCCCGGGCCCGCCACCCCCGCCTACCACCTCATCCCCCGCGACGCGCTCAACCGCATGTTTGAGATGTGA

SEQ ID No.4

MRDEECVVAFDEALSGTRRGS.RASSTRCCSTTAWCCWRARRCRPRSCAPSTAAGASWACRSCAPASSRRTAPTWSRSRRSPPRCRAPPATSRTRCGSRWRPTRASTATTRTAARPRPWPATAAPRRPCCRPRRPRPCCPATRRRRRASRPPRSSPR.RWPRPRRTAR.RRRRPRPRSRPRRSPRPGPPPPPTTSSPATRSTACLRC

实施例2、UL48基因缺失对宿主天然免疫反应和对伪狂犬病毒复制的影响

1、UL48基因缺失对IFN的影响

猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）以2.5×10

pIFN-F：5’-TGCATCCTCCAAATCGCTCT-3’（SEQ ID No.16）；

pIFN-R：5’-ATTGAGGAGTCCCAGGCAAC-3’（SEQ ID No.17）。

内参GAPDH基因的上下游引物序列分别为：

pGAPDH-F: 5’-TACACTGAGGACCAGGTTGTG-3’（SEQ ID No.18）；

pGAPDH-R: 5’-TTGACGAAGTGGTCGTTGAG-3’（SEQ ID No.19）。

荧光定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物各0.2 μL、模板2 μL、超纯水补足体系至10 μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃20 s，72℃ 30 s，40个循环。结果见图5，以伪狂犬病毒HeNZZ株（野生型，图中标为PRV-WT）感染0 h的I型IFN基因表达水平为1，与野生型伪狂犬病毒HeNZZ株（图中标为PRV-WT）相比，UL48基因缺失突变的重组伪狂犬病毒（图中标为PRV-△UL48）能显著诱导I型IFN基因的表达。

2、UL48基因缺失突变对伪狂犬病毒复制的影响

以提取的伪狂犬病毒DNA为模板，以gD基因引物（由gD F和gD R组成）进行PCR扩增，引物序列如下：

gD F：5’-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’（SEQ ID No.20）；

gD R：5’-GTCCACGCCCCGCCTGAAGCT-3’（SEQ ID No.21）。

PCR反应体系：模板DNA 2 μL；上、下游引物各1 μL；2×PrimeSTAR GC buffer 25μL，2.5 mM dNTP 4 μL；PrimeSTAR 0.25 μL；加超纯水至总体积50 μL。

PCR反应条件：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。

产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为217 bp，切胶回收，测定产物DNA浓度，根据DNA浓度和核酸拷贝数计算公式得出核酸拷贝数，dsDNA：(6.02 x 10

猪肾细胞（PK-15）以1.5×10

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。