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一种检测乙肝病毒分型（B/C型）的一体化微流控芯片试剂盒

文献发布时间：2024-04-18 20:01:55

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)分为八种基因型，A到H型，其中一些已进一步分为多个亚基因型。目前世界的基因型分布如下，A型和D型主要分布在欧洲，A型、D型和E型分布在非洲，D型主要分布在中亚和中东地区，印度主要是A型、C型和D型，东亚主要是B型和C型，A型、D型、F型和H型分布在南美洲。目前越来越多的证据表明HBV基因型对预后和治疗反应都有影响。尤其是相比于B型，C型患者对于治疗的敏感度和预后都更差。所以，准确对B型和C型进行分型鉴定对于治疗方法和预后评估都非常重要。

目前主要的分型方法是基于测序，RFLP，普通PCR或实时荧光定量PCR。传统检测方法或者准确性较差，或者无法进行高通量分子检测。所以我们设计了基于TaqMan的实时荧光定量PCR技术，该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点，在现代分子检测应用广泛。

本申请人基于以上问题，经过数年研发，于在先申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备CarryOn P1000Q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”，可在60分钟内完成相关病原体的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本申请即在该技术的基础上进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即检测乙型肝炎病毒分型的一体化微流控芯片试剂盒。

现有的检测试剂盒及方法操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的检测乙型肝炎病毒分型的试剂盒及其使用方法。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物可检测乙型肝炎病毒分型，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物(B型和C型)和检测内参的引物探针组合物

具体地，所述的检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物为HBV-B和HBV-C引物探针组合物，+号后的碱基代表锁核酸修饰；

具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。

进一步具体地，

所述的HBV-B引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAG-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-ATARCCAGGACAARTTGGAGG-3'；

P：SEQ ID NO:3：5'-TGACTGGAGATT+TGGGACTGCGAAT-3'；

所述的HBV-C引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAG-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-ATARCCAGGACAARTTGGAGG-3'；

P：SEQ ID NO:4：5'-AGCACCC+ACGTGTCCTGGCCAA-3'；

所述的IPC引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:5：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R：SEQ ID NO:6：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P：SEQ ID NO:7：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

具体地，所述的检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物用于检测乙型肝炎病毒的S基因。

具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为CY3、CY5、CY5.5、FAM、HEX、VIC、JOE或ROX中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

进一步具体地，所述的检测乙型肝炎病毒B型的探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端淬灭基团为BHQ1；所述的检测乙型肝炎病毒C型的探针5’端荧光报告基团为HEX，3’端淬灭基团为BHQ1；所述的检测内参IPC的探针5’端荧光报告基团为CY5，3’端淬灭基团为BHQ3。

另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测乙型肝炎病毒分型产品中的应用。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

又一方面，本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒分型的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X-100，所述的洗脱液包括Tris-HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％TritonX-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:8。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品是DNA质粒。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

又一方面，本发明还提供了一种检测乙型肝炎病毒分型的一体化微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％TritonX-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:8。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品是DNA质粒。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品还包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、Tris-HCl(pH 8.0)、NaCl和Tween20。

进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

具体地，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于CarryOn P1000Q快速核酸检测设备。

又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测乙型肝炎病毒分型中的应用。

又一方面，本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒分型的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中乙型肝炎病毒分型进行检测。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)利用上述纯化试剂提取样本的DNA并进行纯化；

(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本DNA；

(3)对扩增结果进行分析。

进一步具体地，上述步骤采用CarryOn P1000Q快速核酸检测设备，在一体化微流控芯片上进行。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

(1)采用本发明提供的引物探针组合物可检测乙型肝炎病毒分型(B型和C型)，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

(2)利用一体化芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进—结果出”的POCT检测方案，取样后直接加入设备，集成核酸的提取、纯化、扩增和检测，60分钟内出结果。

附图说明

图1为试剂盒灵敏度检测结果图。

图2为试剂盒重复性检测结果图。

图3为特异性检测结果曲线图，其中，A为单独检测乙肝B型检测结果，B为单独检测乙肝C型检测结果，C为单独检测乙肝D型检测结果，D为丙型肝炎病毒特异性检测结果。

图4为一体化微流控芯片正反面实物图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

1.试剂及仪器

(1)本申请所用的试剂信息详见下表1。

表1试剂及厂家

(2)本申请所用的仪器信息详见下表2。

表2仪器

本申请所用的整体设备即PCR反应装置详见专利202110057507.0，用于核酸检测的芯片装置详见202110055537.8。

实施例1.一种检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物

所述的引物探针组合物包括检测乙型肝炎病毒分型(B型和C型)的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

所述的检测乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物为HBV-B和HBV-C引物探针组合物，+号后的碱基代表锁核酸修饰；

所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物；

所述的HBV-B引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAG-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-ATARCCAGGACAARTTGGAGG-3'；

P：SEQ ID NO:3：5'-TGACTGGAGATT+TGGGACTGCGAAT-3'；

所述的HBV-C引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:1：5'-GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAG-3'；

R：SEQ ID NO:2：5'-ATARCCAGGACAARTTGGAGG-3'；

P：SEQ ID NO:4：5'-AGCACCC+ACGTGTCCTGGCCAA-3'；

所述的IPC引物探针组合物为：

F：SEQ ID NO:5：5'-AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA-3'；

R：SEQ ID NO:6：5'-TCGACGAGACTCTGCTGTTAA-3'；

P：SEQ ID NO:7：5'-CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA-3'。

本申请所述的乙型肝炎病毒分型的引物探针组合物用于检测乙型肝炎病毒的S基因。

实施例2一种检测乙型肝炎病毒分型的一体化微流控芯片试剂盒

(1)包括实施例1所述的引物探针组合物，HBV-B/C通用引物浓度均为0.4μM，HBV-B探针浓度为0.15μM，HBV-C探针浓度均为0.1μM，IPC引物和探针浓度均为0.15μM。

(2)还包括纯化试剂、风干qPCR反应试剂和冻干IPC过程质控品。

1)所述的纯化试剂包括裂解液400μL和洗脱液850μL，磁珠15μL，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH 4.7)和2％Triton X-100，所述的洗脱液包括10mM Tris-HCl(pH 8.5)，将纯化试剂加入芯片中的加样层，所述的磁珠干化方法见专利202110222434.6。

2)所述风干qPCR反应试剂体系如下表3所示。

表3风干qPCR反应试剂体系

将上述表3试剂加入一体化微流控芯片的反应仓中，将芯片放入鼓风干燥箱，按照Air-Dryable qPCR Mix说明书进行风干操作。

3)所述冻干IPC过程质控品包括IPC质粒的制备和冻干试剂体系。

按照专利CN202110669475.X实施例1所述的假病毒的制备方法，构建并得到IPC基因(SEQ ID NO:8)的假病毒。

所述冻干IPC试剂体系如下表4所示。

表4冻干IPC试剂体系

将上述表4试剂每5μL滴到液氮中制成冻干球，放入西林瓶中按照表5的冷冻干燥机冻干程序进行冻干。

表5冻干程序

将冻干球放入已风干反应试剂的芯片上，组装成一体化检测试剂盒。

实施例3乙型肝炎病毒分型检测试剂盒的使用方法

采用CarryOn P1000Q进行本申请所述的乙型肝炎病毒分型的检测，具体检测步骤如下表6所示。

表6

实时定量PCR反应程序为：55℃10min；95℃1min；(95℃10s，60℃20s)，45cycles。

实验例1灵敏度检测

使用广州邦德盛乙型肝炎病毒B型和C型(BDS-IQC-140)血清质控品进行灵敏度测试，B型浓度为2.77×10

表7

由上表7可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的灵敏度，试剂盒目前乙肝病毒B型检测灵敏度为110IU/mL,乙肝病毒C型的检测灵敏度为90IU/mL。

实验例2准确性检测

使用上述邦德盛乙肝病毒分型血清质控品进行重复性实验，B型的投入量约为50IU，C型的投入量约为72IU，按照上述实施例1-3的体系和步骤对提取的核酸样品进行检测，重复检测四次，检测结果如下表8所示。

表8

由表8可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的重复性，且50–100IU的血清样本也可以稳定检出，设备结果扩增曲线图见图2。

实验例3特异性检测

乙型肝炎病毒D型脱氧核糖核酸液体质控品(BDS-IQC-140)和丙型肝炎病毒核糖核酸液体血清标准物质(BDS-BW-013)均购自广州邦德盛生物科技有限公司。直接取200μL样本加入到CarryOn P1000Q快速核酸检测设备样品仓内，启动设备进行检测。同时对乙型肝炎B型和C型样本进行单独检测，按照上述实施例1-3的体系和步骤对提取的核酸样品进行检测，检测结果如下表9所示。

表9

单独检测B型时，C型显示阴性，单独检测C型时，B型显示阴性，检测乙型肝炎D型和丙型肝炎样本时，检测结果均为阴性，其检测结果图如图3所示，由上表9可知，本申请所述的引物组合物及其试剂盒具有较好的特异性。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京中科生仪科技有限公司

<120> 一种检测乙肝病毒分型（B/C型）的一体化微流控芯片试剂盒

<130> 20220617

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA