一种副干酪乳杆菌-巴氏醋杆菌两段式发酵产乙偶姻的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用副干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌两段式发酵产乙偶姻的工艺方法。

背景技术

乙偶姻化学名为3-羟基-2-丁酮，广泛存在于香蕉、荔枝、椰子、蜂蜜等各种天然食品中，因其具有令人愉悦的酸奶香气，常被作为食品香料用于食品生产过程中。乙偶姻还是功能性保健物质川芎嗪的前体，在制药行业、烟草行业、农业、化妆品行业等被广泛应用。

乙偶姻用途广泛，市场需求量大。其生产方法主要包括化学合成法和生物法。目前可大规模商业化生产乙偶姻的方法主要是由化石原料通过化学反应进行合成。这些方法技术存在工艺复杂、产品得率较低、成本较高、原料来源受限及环境污染严重等缺点，且化学合成的产品质量安全存在争议，限制了其在食品等行业的应用。所以生物法越来越受到人们的关注。

生物法又可分为酶催化法和微生物发酵法。酶催化法是通过酶催化2,3-丁二醇或2,3-丁二酮产生乙偶姻，这种方式具有底物选择性较高、反应条件温和及生产速率较快等优势。但其前体和酶的成本都很高，酶的稳定性又比较差，无法实现规模化生产。微生物发酵法是指微生物通过自身代谢途径，将原料转化为乙偶姻。发酵法的优势在于生产效率较高、反应条件温和、对环境友好、原料来源广泛且可以获得天然的乙偶姻。但目前常用的乙偶姻发酵原料常为不可食用原料，菌种也不是食品行业益生菌种，这就导致发酵产物不能直接用在食品行业，增加了产物处理的成本，限制了产物的应用范围。

综上所述，开发出一种利用可食用原料，通过微生物发酵生产可直接用于食品行业的乙偶姻是一个亟待解决的问题。

发明内容

针对上述目前现状，本发明的目的在于提供一种利用比较廉价的、天然的药食同源物质作为发酵原料，通过有益的、可食用的菌种进行发酵，生产绿色的可用于食品添加的乙偶姻，提供一种利用副干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌通过两段式发酵产乙偶姻的方法。

一种副干酪乳杆菌-巴氏醋杆菌两段式发酵产乙偶姻的方法，包括以下步骤：

(1)制备大麦汁：将大麦芽采用对辊式粉碎机粉碎，将木瓜果肉与水按照质量比3:2的比例进行匀浆处理，将粉碎后的大麦芽、匀浆后的木瓜汁和水按照质量比5:1:10的比例混合，进行控温糖化，控温过程为45℃保持15～20min，55℃保持30～35min，65℃保持30～35min，最后75℃保持15～20min；然后用200目的纱布过滤2～3次，收集滤液，将滤液煮沸15min后再次过滤，获得糖化后的大麦汁。

根据本发明的一些实施方式，步骤(1)中木瓜汁的制备方式是将熟木瓜去皮去籽后，按照果肉与水的质量比3:2的比例混合，利用榨汁机对木瓜进行匀浆处理。

(2)副干酪乳杆菌发酵产生乳酸：将步骤(1)获得的大麦汁加水或不加水稀释，获得浓度为40％～100％的大麦汁，分别装入盐水瓶中，每瓶装液150mL并添加5～30g粉末状碳酸钙，然后将盐水瓶用插有注射器针头的橡胶塞封口，121℃灭菌20min，待冷却后按2％～5％的接种量接种副干酪乳杆菌种子液，37℃静置发酵4～20天，获得乳酸发酵液。

根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中所用的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC AB 2023084。

(3)巴氏醋杆菌发酵产乙偶姻：将步骤(2)获得的乳酸发酵液加水稀释，使乳酸浓度为55～60g·L

根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中所用的巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)为CICC 10386。

根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中需要将大麦汁发酵液的乳酸浓度稀释到最适乳酸浓度55～60g·L

根据本发明实施方式的乙偶姻的制备方法，至少具有如下有益效果：该方法以大麦芽和木瓜为主要原料，通过副干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌进行两段式发酵产乙偶姻，所用原料中的大麦芽与木瓜均为药食同源物质，可以食用的同时兼具保健功能；所用菌株均为有益菌，其发酵产生的乳酸及乳酸与碳酸钙反应生成的乳酸钙均为可食用的对人体有益的成分。综上所述，利用该方法生产的乙偶姻原料成本较低、绿色天然，可直接用于食品工业中，提高了乙偶姻的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例中所用的盐水瓶。

图2为本发明实施例中巴氏醋杆菌CICC 10386利用稀释后的副干酪乳杆菌CCTCCAB 2023084乳酸发酵液，在乳酸浓度为55g·L

具体实施方式

实施例1：制备大麦汁

1.1粉碎大麦芽

大麦芽要现用现粉碎。称取适量大麦芽，均匀淋洒上适量的水，使大麦芽外壳略微湿润，然后用对辊式粉碎机粉碎。

1.2制备木瓜汁

将熟木瓜进行去皮去籽处理，称取果肉重量。利用榨汁机对木瓜进行匀浆，匀浆过程中按照果肉与水的质量比为3:2的比例加入水，调节果浆粘稠度。收集果浆，当日用完。

1.3糖化大麦芽

将粉碎后的大麦芽、木瓜汁与自来水按照质量比5:1:10的比例混合，利用水浴锅控制温度，期间不停搅拌使受热均匀，对大麦芽进行糖化。

糖化控温过程如下：45℃保持15～20min，使大麦芽中的淀粉酶等溶解到料液中；55℃保持30～35min，使大麦芽自身的蛋白酶及木瓜蛋白酶起作用，将大麦芽中的蛋白质水解为多肽及氨基酸；65℃保持30～35min，β-淀粉酶水解淀粉，形成大量麦芽糖、葡萄糖等还原糖，为发酵提供易于利用的碳源；75℃保持15～20min，主要是α-淀粉酶起作用，进一步水解淀粉形成低分子量的糊精。利用碘液检测麦汁中是否含有未水解淀粉，若碘液变蓝，则延长糖化时间直至无淀粉存在，停止糖化。将糖化液放凉备用。

1.4处理大麦汁

使用200目滤布对1.3中的糖化液进行过滤除去麦糟，将麦汁煮沸15min，析出未被水解的蛋白质等热凝固物；再次过滤，获得大麦汁，测定其还原糖浓度。-20℃冰箱储存备用。

实施例2：筛选乳酸菌

2.1菌株的分离

取不同来源的适量酸菜样品，分别接入灭菌后的液体MRS培养基中，在恒温培养箱中37℃静置培养24h，使酸菜中的乳酸菌得到富集。使用倍比稀释法，将富集后的菌液从10

所述液体MRS培养基配置方法为：称量蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，吐温80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，酵母浸粉4.0g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2.0g，葡萄糖20.0g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5.0g，加入1000mL去离子水，pH调至6.2±0.2，溶解分装，121℃灭菌20min。

所述MRS固体平板制备方法为：配置1000mL液体MRS培养基并加入20g琼脂，121℃灭菌20min，待温度降至60℃左右时，在超净台里倒入平板中，放凉使其凝固。

2.2盐水瓶发酵复筛

将盐水瓶中装入100mL糖化后的大麦汁，将盐水瓶盖上橡胶塞，并插上塞有棉花的注射器针头(附图1)。121℃灭菌20min。将步骤2.1中筛选的菌株分别挑取单菌落，接入到试管中，37℃静置培养12h后，按照2％的接种量转接到含有50mL MRS液体培养基的250mL培养瓶中，37℃静置培养12h，使用紫外分光光度计测定其在600nm处的吸光值。按照相同的生物量接入到盐水瓶中，测定其初始重量。37℃静置培养40h，测定发酵终点重量及乳酸生成量。测定各菌株乳酸产量，结果显示R2菌株产乳酸能力较强。经过16S rRNA进化树分析和相关实验结果，确定R2菌株为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)，并将其保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC AB 2023084，并以此副干酪乳杆菌CCTCCAB 2023084作为后续发酵菌株。

实施例3：利用副干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌进行两段式发酵产乙偶姻

3.1副干酪乳杆菌发酵产生乳酸

(1)大麦汁浓度选择

以1.4中糖化后的大麦汁为原料，加入或不加去离子水，将其稀释至麦汁浓度为40％、60％、80％、100％，设置三个平行，每瓶150ml，分别加入5g碳酸钙，并按照2％接种量接入副干酪乳杆菌CCTCC AB 2023084种子液，37℃静止培养，不定期摇晃，称重记录重量变化，测定发酵终点时乳酸浓度。结果显示，麦汁浓度为100％时，乳酸生成最快且生成量最高，故选择大麦汁浓度为100％进行后续发酵。

(2)碳酸钙加量选择

150mL 100％大麦汁中分别加入5g、10g、15g、20g、25g和30g的碳酸钙，设置三个平行，分别按2％接种量接入副干酪乳杆菌CCTCC AB 2023084种子液，37℃静置培养，不定期摇晃，并每12h记录重量，待重量不再减轻时停止发酵，测定乳酸产量。结果显示，添加25g及以上的碳酸钙时乳酸生成量最高，但是在添加15g及以上的碳酸钙时，乳酸与碳酸钙反应生成乳酸钙过多，导致乳酸钙析出凝结成固体，由于后期需要利用该乳酸发酵液进行巴氏醋杆菌的好氧发酵，故选择10g碳酸钙加入量作为后续实验条件，此时乳酸浓度为132g·L

3.2巴氏醋杆菌发酵产乙偶姻

选取3.1乳酸发酵液，将其稀释到巴氏醋杆菌CICC 10386的适宜乳酸浓度，此时乳酸浓度为55g·L

实施例4：乳酸和乙偶姻浓度测定方法

4.1样品中乳酸含量的测定

采用甲酯化的方法先将乳酸衍生为乳酸甲酯，再利用气相色谱仪测定。

(1)标注曲线的制作：准确配置0.85、1.70、4.25、6.80和8.50g·L

(2)样品中乳酸浓度的检测：将发酵液离心去除菌体后稀释至标准曲线浓度范围内，参考上述方法进行衍生、萃取后用气相色谱检测样品中乳酸的含量。

4.2样品中乙偶姻含量的测定

利用气相色谱法测定样品中乙偶姻的含量。

(1)标准曲线的制作：准确配置0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0和10.0g·L

(2)样品中乙偶姻浓度的检测：将发酵液离心去除菌体后稀释至标准曲线浓度范围内，参考上述方法进行萃取后用气相色谱检测样品中乙偶姻的含量。