蛋白质靶向降解的新型双功能分子
文献发布时间：2024-04-18 19:48:15
技术领域
本公开涉及一类适用于蛋白质靶向或选择性降解的新双功能分子。
背景技术
靶向蛋白降解(TPD)是一种治疗模式，它依赖于使用合成分子重新利用细胞降解机制而诱导特异性致病蛋白的降解。TPD方法比其他药物模式(例如，小分子抑制剂、抗体和蛋白质-基试剂、反义寡核苷酸和相关敲除方法)具有许多优点，包括：由于从细胞内催化蛋白质去除而增强了药理学；抑制特异性药物靶标的多种功能的能力，包括，例如，通过靶标敲除的支架功能；具有良好生物分布的全身计量给药的机会；由于催化效力和仅通过从头蛋白质再合成限制的长作用时间所致的强效体内功效；和利用小分子工艺的应用的简单化学合成和配制。
蛋白质水平的大部分生理翻译后调节以及受损、错叠或过量蛋白质的去除受到泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导。使用双功能化学分子作为治疗药物，可以将UPS重新用于降解特异性蛋白质，其通过诱导所需底物与UPS蛋白质的接近而发挥作用，以启动一系列事件，最终导致所需靶标通过所述蛋白酶体降解并从细胞中去除。
蛋白质水解靶向嵌合体(PROTACs)构成了一类双功能降解剂，其通过募集特异性泛素E3连接酶而诱导靶蛋白与UPS的接近。PROTAC由通过连接基连接的两个配体组成—一个配体与所需的靶蛋白啮合，而另一个配体募集泛素E3连接酶。
PROTAC中最常用的E3连接酶是von Hippel-Lindau(VHL)和Cereblon(CRBN)。募集VHL的PROTAC通常基于含羟基脯氨酸的配体，而募集CRBN的PROTACs通常以存在戊二酰亚胺部分如沙利度胺(thalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)和来那度胺(lenalidomide)或最类似物充当弹头为特征。包括mdm2和IAP家族在内的其他连接酶在PROTAC设计中也显示出效用。
然而，这些方法遭致一系列限制，限制了它们治疗广泛疾病的效用。例如，目前的PROTAC方法的局限性包括：无法有效降解某些靶标；由于有效降解所需的E3连接酶和其他蛋白质低表达和可变表达所致PROTAC在许多特异性细胞中的活性差；化学性质使得制备具有包括良好药物代谢和药代动力学特征的合适类药物性质的降解剂变得更加困难；和对肿瘤中所诱导的耐药性机制的高易感性。
由于这些限制，仍然需要鉴定出能够递送新型双功能降解剂分子的新型降解机制和弹头，这些分子在一系列靶点和细胞系统内表现出有效的降解作用和/或具有适合药物开发的改进特征。
在WO 2019/238886、WO 2019/238117和WO 2019/238816中描述了其他双功能降解剂分子。
发明内容
本公开基于一类新型双功能分子的鉴定，这些分子适用于蛋白质的靶向和/或选择性降解，例如，“靶蛋白”的靶向和/或选择性降解。具体而言，本公开提供的双功能分子利用新型弹头有利于所选靶蛋白的蛋白酶体降解。
本文所述的双功能分子包含以下的通用结构：
TBL–L–Z
其中TBL是靶蛋白结合配体，而L是连接基。部分“Z”(本文有时称为“弹头”)会调节、促进和/或有利于所述靶蛋白的蛋白酶体降解，并且在某些情况下，可以称为蛋白酶体降解的调节剂、促进剂和/或启动剂。例如，在使用中，双功能分子的TBL部分会与靶蛋白结合。然后，部分Z(通过连接基与TBL部分连接)，例如，通过使靶蛋白与蛋白酶体接近和/或通过以其他方式使靶蛋白在细胞内被标记为蛋白酶体降解，调节、增进和/或促进该靶蛋白的降解。
本公开中描述的双功能分子已被证明是对抗广泛靶标的有效降解剂。在不受理论约束的情况下，据假设，本文所述的双功能分子的Z部分不与上述经典PROTAC方法中通常依赖的特定E3连接酶(如CRBN和VHL)结合。因此，本文所述的双功能分子据信会通过替代机制调节、增进和/或促进蛋白酶体降解。因此，本类双功能分子可以用于对抗更广泛的疾病(包括对许多PROTAC降解剂具有耐药性的疾病)。
本文所述的双功能分子可以为降解剂提供一种或多种促进、增强和/或增进其体内用途(例如，一种或更多种类药物性质)的性质。具体而言，与许多经典PROTAC降解剂相比，包含弹头Z的双功能分子可以提高生物利用度水平(例如，口服生物利用度)。此外，或可替代地，包含弹头Z的双功能分子可以提供(与本领域目前已知的许多其他降解剂分子相比)改善的CNS(中枢神经系统)穿透水平。
此外，本公开是基于这样的发现，即一系列N-烷基化化合物能够为蛋白酶体降解，例如，在预想用于靶向和/或选择性蛋白质降解的双功能分子中，提供特别有效的调节剂、促进剂和/或启动剂。具体而言，据发现，这种N-烷基化系列化合物能够显著改善所述双功能分子的蛋白质降解剂活性。
根据本公开的第一方面，提供了一种双功能分子，其包含以下通式：
TBL–L–Z
其中TBL是靶蛋白结合配体；
L是连接基；而
Z包含根据式(I)的结构：
其中
R
A不存在或是CR
B选自芳基、杂芳基、取代芳基和取代杂芳基；
R
R
X选自H和吸电子基团；
R
或其中R
或其中当A是CR
R
R
其中
L表示连接基的连接点。
在环B上，基团R
如上面的式(I)所示，连接基通过环B连接至部分Z。连接基可以通过连接基上的原子与环B的可选取代芳基或杂芳基的环系统中包含的原子之间的共价键而连接至部分Z。该连接基可以在可选取代的芳环或杂芳环上的任何位置连接至环B(前提是其具有正确的化合价和/或化学上是合适的)。例如，连接基可以取代芳环或杂芳环上任何位置的氢原子。
在其他实例中，Z可以包含如以上式(I)所示的结构，其中：
A、B、X和R
R
R
R
在R
其中A、B、R
n为1、2或3；
W选自CR
R
其中当n为2或3时，每个W独立地选自CR
在R
其中B、R
m为3、4或5；
每个T独立地选自CR
R
在R
其中B、R
p为2、3或4；并且
每个U独立地选自CR
R
如本文所用，“C
本文中使用的“苄基”是指-CH
如本文所用，术语“芳基”是指具有6-14个碳原子的单或多环芳烃体系。合适的“芳基”基团的代表性实例包括，但不限于，苯基、联苯基、萘基、1-萘基、2-萘基和蒽基。如本文所用，“取代芳基”是指如本文所定义的在其芳环上包含一个或多个取代基的芳基。当芳基被取代时，只要满足价态，任何氢原子都可以被取代基取代。
如本文所用，“杂芳基”可以是具有一个或多个含有1个或多个O、N和/或S杂原子的芳环的单环或稠环体系。杂芳基的代表性实例可以包括，但不限于，吡咯基、呋喃基、硫苯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并噁唑基和苯并异噁唑等。如本文所用，“取代杂芳基”是指本文定义的在其杂芳环上包含一个或多个取代基的杂芳基。
如本文所用，“碳环”是含有3-10个碳原子，在某些情况下，3-8个碳原子的环。该环可以是脂族的。因此，如本文所用，提及“碳环基”和“取代碳环基”基团可以是指脂族碳环基和脂族取代碳环基。该环可以是饱和的或不饱和的，例如，在某些情况下，该环可以包含一个或多个双键或三键。碳环基的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、环辛炔基等。如本文所用，“取代碳环基”是指本文所定义的在其碳环上包含一个或多个取代基的碳环基。当碳环基被取代时，只要满足价态，任何氢原子都可以被取代基取代。
如本文所用，“杂环”可以包含至少1个选自O、N和S的杂原子。杂环可以是包含3-10个原子，在某些情况下，3-8个原子的环。该环可以是脂族的。因此，如本文所用，提及“杂环基”和“取代杂环基”基团可以是指脂族杂环基和脂族取代杂环基团。该环可以是饱和的或不饱和的，例如，在某些情况下，该环可以包含一个或多个双键或三键。杂环基团中存在的任何N杂原子可以是C
如本文所用，术语“可选取代的”是指该部分可以包含一个或多个取代基。
如本文所用，“取代基”可以包括，但不限于，羟基、巯基、羧基、氰基(CN)、硝基(NO
在一些实例中，并且除非上下文另外指出，否则“取代基”可以包括，但不限于，卤素、C
如本文所用，“卤素”基团可以是F、Cl、Br或I，通常是F。
如本文所用，“卤代烷基”可以是其上的一个或多个氢原子已被卤素原子取代的烷基。作为代表性实例，C
如本文所用，吸电子基团可以是指将电子密度从相邻原子吸引到自身的任何基团。通常而言，吸电子基团比氢取代基会更强烈地将电子密度从相邻原子吸引到自身。合适的吸电子基团的代表性实例包括，但不限于，-CN、卤素、-NO
关于由本文的各式定义的Z的各种结构，R
如上对于式(I)所述，A要么不存在，要么是CR
如上所述，R
合适的R
其中所述结构上的虚线指示每个各自的R
R
R
Q可以是C
作为进一步的实例，合适的R
其中所述结构上的虚线指示每个各自的R
如上所述，X可以选自H或吸电子基团。仅举例而言，吸电子基团可以选自有-CN、卤素、-CF
在某些实例中，Z包含根据式(II)的结构：
其中
R
R
R
X选自H或吸电子基团；
R
或其中R
或其中R
或其中R
其中
L表示连接基的连接位置。
如上面的式(II)所示，该连接基通过芳环连接至部分Z。具体而言，改连接基通过连接基上的原子和芳环体系的碳原子之间的共价键连接至部分Z。该连接基可以在任何位置连接至所述芳环上(前提是它具有正确的化合价和/或化学上是合适的)。例如，该连接基可以取代芳环上任何位置的氢原子。
根据式(II)的化合物的代表性实例包括，但不限于：
其中R
R
R
在一些情况下，R
在某些实例中，当R
其中A、R
n为1、2或3；并且
W选自CR
R
其中当n为2或3时，每个W独立地选自CR
在某些情况下，每个W都是CR
根据式(IIaa)的化合物的代表性实例包括，但不限于：
其中R
R
R
作为进一步的实例，当R
其中R
n为1、2或3；并且
W选自CR
R
其中当n为2或3时，每个W独立地选自CR
在一些情况下，每个W都是CH
当R
其中R
m为3、4或5；
每个T独立地选自CR
R
例如，在一些情况下，每个T都是CH
当R
其中R
p为2、3或4；并且
每个U独立地选自CR
R
例如，在一些情况下，每个T都是CH
Z的代表性实例如下所示：
其中上述结构中的R
Z的具体实例包括：
上述结构中的虚线表示所述连接基可以在芳环上的任何位置上连接至Z部分(前提是它具有正确的价态和/或在化学上是合适的)。例如，该连接基可以取代芳环上任何位置的氢原子。作为进一步的实例，在B是苯环的情况下，该连接基可以以对位取代模式与酰胺侧基连接，如下式IId所示。
可替代地，应该注意的是，虽然式(I)-(IId)表明该连接基通过环B(在某些情况下可以是芳环)连接至Z部分，但本公开也拓展到该连接基连接于Z部分中任何其他位置的实例(前提是其具有正确的价态和/或在化学上是合适的)。例如，该连接基可以取代Z部分中任何位置的氢原子。因此，在一些实例中，Z可以表示为如式(III)中所示：
其中R
通过式(III)上的方括号显示的虚线表示只要该连接基具有正确的价态，在化学上是合适的和/或只要该连接基在该可替代的位置的连接不会破坏Z部分在促进和/或增进蛋白酶体降解中的功能，则该连接基可以通过共价键连接至Z部分上的任何原子。
应当理解，本公开的双功能分子可以以不同的立体异构形式存在。本公开在其范围内包括所有立体异构体形式的用途，或双功能分子立体异构体的混合物的用途。例如，在双功能分子包含一个或多个手性中心的情况下，本公开涵盖该双官能分子每个各对映体以及对映体的混合物，包括这些对映体的外消旋混合物。作为进一步的实例，在该双官能分子包含两个或多个手性中心，本公开涵盖该双官能分子的每个各非对映异构体，以及各种非对映体的混合物。
在许多情况下，双键存在于Z中(即，其中
根据本公开的一各进一步的方面，还提供了包含以下通用结构的化合物：
L-Z
其中部分Z如式(I)-(III)中任意之一所定义；并且
L是如本文所定义的连接基。
此类化合物可以，例如，通过模块化方法，用于合成所述双功能分子，其中部分TBL、Z和L每个都作为单独的构建块提供。在一些实例中，L和Z可以连接至一起而提供如上所述的化合物L-Z(其随后可以进一步反应而连接至合适的TBL部分)。
根据一各进一步的方面，提供了一种包含根据式(IV)的Z部分的化合物：
其中A、B、X、R
如式(IV)中所示，G通过环B连接至部分Z。G通过与环B的可选取代芳基或杂芳基的环体系中所含原子的共价键而连接至部分Z。G可以在可选取代的芳族或杂芳族环上的任何位置连接至环B(前提是其具有正确的化合价和/或在化学上是合适的)。例如，G可以取代所述可选取代的芳族或杂芳族环上任何位置的氢原子。
式(IV)中的基团G构造设计成使得Z部分能够通过形成新的共价键而连接至另一化学结构(例如，连接基部分或连接基-靶蛋白结合配体部分)。在形成这种新的共价键之后，基团G可以构成本文定义的连接基的部分。
在一些实例中，G可以，例如，通过形成酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯、胺或醚连接键，或通过形成新的碳-碳键或新的碳-氮键，而包含能够促进Z与另一部分之间形成新共价键的官能团。
仅举例而言，G可以表示为如下所示：
X
其中R
X
R
G通过R
合适的G部分的代表性实例如下所示：
值得注意的是，本公开进一步拓展至式(I)-(III)中所示的Z的任何结构或Z的其他代表性实例，其中这些结构内的基团L已被上文关于式(IV)所定义的基团G取代。
如本文所述，TBL通过连接基L连接或偶联至部分Z。该连接基可以是化学连接基(例如，化学连接基部分)，并且例如，可以是共价连接基，这是指该连接基通过共价键偶联至Z和/或TBL。
该连接基起到将靶蛋白结合配体和Z部分彼此连接的作用，而同时还允许这两个部分与其相关靶标结合和/或执行其预期功能。具体而言，该连接基可以起到将靶蛋白结合配体与Z结合的作用，而同时还减轻Z部分破坏、干扰和/或抑制靶蛋白结合配体与靶蛋白结合的可能性。另外或可替代地，该连接基可以起到将Z连接至靶蛋白结合配体的作用，而同时还减轻靶蛋白结合配体破坏、干扰和/或抑制Z的细胞相互作用的可能性(例如，其在调节、增进和/或促进靶蛋白的蛋白酶体降解中的功能)。
换言之，通过允许双功能分子的每端能够用于与细胞环境的各种组件结合(或另一种类型的细胞相互作用)，该连接基可以起到促进靶向蛋白质降解的作用。例如，该连接基可以构造设计成允许靶蛋白结合配体与靶蛋白结合，而不受双功能分子的Z部分的干扰、破坏和/或抑制。另外或可替代地，该连接基可以构造设计成允许Z部分与细胞环境中的各种组件相互作用，而调节、增进和/或促进靶蛋白的蛋白酶体降解，却不受所述双功能分子的靶蛋白结合配体的干扰、破坏和/或抑制。
在许多情况下，可以耐受广泛的连接基。连接基的选择可以取决于要降解的受靶向蛋白(靶蛋白)和/或所述具体的靶蛋白结合配体。
该连接基可以经过选择而提供特定的长度和/或柔性，例如，而使靶蛋白结合配体和Z部分保持于特定的距离和/或几何结构内。正如本领域技术人员将会理解的是，该连接基的长度和/或柔性可以根据靶蛋白结合配体的结构和/或性质而变化。
仅举例而言，该连接基可以包含1-200、1-100、1-50、1-30或1-10各的任何数目的原子。
连接基的柔性程度可以取决于连接基中存在的可旋转键的数量。可旋转键被定义为结合至非末端重原子的非环单键。如本文所述，酰胺(C-N)键由于高旋转能垒而不被认为是可旋转的。在一些情况下，连接基可以包含一个或多个选自环、双键和酰胺的部分而降低该连接基的柔性。在其他情况下，连接基可以包含更大数量和/或比例的单键(例如，可以主要包含非环单键)，而增加连接基的柔性。还可以理解的是，连接基的长度可以影响柔性程度。例如，包含较少键的较短连接基也可以降低连接基的柔性。
连接基(L)的结构可以表示如下：
(L
其中每个L
q是大于或等于1的整数。
例如，q可以是1-30、1-20或1-5的任何整数。
例如，在q为1的情况下，连接基仅包含一个L
每个L
R
术语芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、碳环基和取代碳环基、杂环基和取代杂环基都如上文定义。
末端L
TBL和Z部分可以通过对连接基的化学合适且稳定的任何基团而共价连接于L。仅举例而言，连接基可以通过碳-碳键、酮基、氨基、酰胺、酯或醚连接键共价结合于TBL部分。类似地，连接基可以通过碳-碳键、碳-氮键、酮、氨基、酰胺、酯或醚连接键共价结合于Z部分。
在一些情况下，每个末端L
在一些实例中，至少一个L
在替代实例中，连接基可以是或包含烷基连接基，该烷基连接基包含-CH
在其他实例中，连接基可以是或包含聚烷二醇。仅举例而言，连接基可以是或包含含有乙二醇(C
在本文所述的任何实例中，连接基是或包含以下的一个或多个：
其中q1是1-20或1-10(例如，1-5)的任何整数。
或者，在本文所述的任何实施例中，连接基是或包含以下的一个或多个：
其中q2是1-20或1-10的任何整数(例如，3、4、6或10)。
因此，在某些情况下，以上显示的结构表示整个连接基。在其他实例中，双功能分子的连接基可以包含上文所示的多个结构。
在这些结构中，波浪线显示于分别与TBL和Z部分形成连接的键上。
在一些实例中，与TBL和/或Z部分形成连接的键附连至环结构上。在本文所述的许多结构上，这种键被显示为附连至环形结构上的特定位置。然而，本公开还包括在这些环结构的任何化学合适的位置上连接或偶联至TBL和Z部分。
本公开涵盖本文公开的任何连接基与本文描述的任何Z部分和TBL部分的组合的用途。
如本文所用，“靶蛋白”可以是本领域技术人员希望在细胞或哺乳动物例如人受试者中选择性降解的任何多肽或蛋白质。换言之，“靶蛋白”可以是由技术人员选择用于在细胞中提高蛋白水解的蛋白质或多肽。术语“选择的靶蛋白”可以是任何选择受靶向而进行蛋白质降解和/或提高蛋白水解的多肽或蛋白质。
根据本公开，当靶蛋白经受本文所述的双功能分子和/或与之接触时，例如，当靶蛋白在细胞中经受任何一个双功能分子和/或与其接触时，该靶蛋白的降解就可以发生。
靶蛋白的选择性降解和/或提高的蛋白水解将会降低蛋白质水平，而因此能够降低靶蛋白在细胞中的作用。本文所述的双功能分子提供的蛋白质水平的控制可以提供对疾病或病症的治疗，这通过凭借降低受试者细胞中的该蛋白质水平的靶蛋白进行调节。
当与本公开的双功能分子(以及使用这些分子的相关方法)接触时可以经受提高的蛋白水解和/或选择性降解的靶蛋白包括任何蛋白质和多肽。靶蛋白包括具有生物学功能或活性如结构、调节、激素、酶促、遗传、免疫、收缩、储存、运输和信号转导功能和活性的蛋白质和多肽。
举例而言，靶蛋白可以包括结构蛋白，受体，酶，细胞表面蛋白，与细胞整合功能(包括参与催化活性、表观遗传调控、芳香化酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成)相关的蛋白，具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节活性、信号转导活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质、脂质-碳水化合物)、受体活性、细胞活力、膜融合、细胞通讯、生物学过程调节、发育、细胞分化、受刺激反应的蛋白质，行为蛋白，细胞粘附蛋白，参与细胞死亡的蛋白，参与运输的蛋白质(包括蛋白质转运子活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运子活性、载体活性、渗透酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机制、伴侣调节子活性、核酸结合活性、转录调节活性、细胞外组织与生物发生活性和翻译调节活性)。
靶蛋白可以包括来自真核生物和原核生物的蛋白质，包括人类、其他动物，包括驯养动物、微生物、病毒、真菌和寄生虫，以及用于药物治疗的许多其他靶点。
在一些实例中，靶蛋白可以包括，但不限于：(i)激酶(如丝氨酸/苏氨酸激酶和受体酪氨酸激酶)；(ii)含溴区结构域的蛋白质(如BET家族蛋白质)；(iii)表观遗传学蛋白质(包括组蛋白或DNA甲基转移酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶和去甲基酶)；(iv)转录因子(包括STAT3和myc)；(v)GTP酶(包括KRAS、NRAS和HRAS)；(vi)磷酸酶；(vii)泛素E3连接酶；(viii)核受体(包括雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER))；(ix)易聚集蛋白(包括β-淀粉样蛋白、tau、Htt、α-核突触蛋白和聚Q-扩增蛋白)；和(x)凋亡和抗凋亡因子(包括BCl
靶蛋白也可以选自用于人类治疗药物的靶点。这些包括可以用于多种疾病例如多基因疾病中恢复功能的蛋白质，包括例如选自以下的靶蛋白：B7.1和B7、TNFR1、TNFR2、NADPH氧化酶、BclI/Bax和凋亡途径中的其他伴侣的靶蛋白、C5a受体、HMG-CoA还原酶、PDEV磷酸二酯酶型、PDE IV磷酸二酯酶4型、PDEI、PDEII、PDEIII、角鲨烯环化酶抑制剂、CXCR1、CXCR2、一氧化氮(NO)合成酶、环氧合酶1、环氧合氧酶2、5HT受体、多巴胺受体、G蛋白(即Gq)、组胺受体、5-脂氧合酶、类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶、胸苷酸合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶、GAPDH锥虫体、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶、趋化因子受体、JAK STAT、RXR及其类似物、HIV 1蛋白酶、HIV 1整合酶、流感、神经氨酸酶、乙型肝炎逆转录酶、钠通道、多药耐药性(MDR)、蛋白P-糖蛋白(和MRP)、丝氨酸/苏氨酸激酶、酪氨酸激酶、CD23、CD124、酪氨酸激酶p56 lck、CD4、CD5、IL-2受体、IL-1受体、TNF-αR、ICAM1、Cat+通道、VCAM、VLA-4整合素、选择素、CD40/CD40L、神经激肽和受体、肌苷单磷酸脱氢酶、p38MAP激酶、Ras/Raf/MEK/ERK途径、白细胞介素-1转化酶、半胱天冬酶、HCV、NS3蛋白酶、HCV NS3 RNA解旋酶、甘氨酸核糖核苷酸甲酰转移酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒-1(HSV-I)、蛋白酶、巨细胞病毒(CMV)蛋白酶、聚(ADP-核糖)聚合酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、血管内皮生长因子、催产素受体、微粒体转移蛋白抑制剂、胆汁酸转运抑制剂、5α还原酶抑制剂、血管紧张素11、甘氨酸受体、去甲肾上腺素再摄取受体、内皮素受体、神经肽Y和受体、雌激素受体、雄激素受体、腺苷受体、腺苷激酶和AMP脱氨酶、嘌呤能受体(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2X1-7)、法尼基转移酶、香叶基香叶基转移酶、NGF受体TrkA、β-淀粉样蛋白、酪氨酸激酶Flk-IIKDR、玻璃体凝集素受体、整合素受体、Her-21neu、端粒酶抑制、胞浆磷脂酶A2和EGF受体酪氨酸激酶。其他的蛋白质靶标包括，例如，蜕皮激素20-单加氧酶、GABA门控氯离子通道的离子通道、乙酰胆碱酯酶、电压敏感的钠通道蛋白、钙释放通道和氯离子通道。还有的进一步的靶蛋白包括乙酰辅酶A羧化酶、腺苷酸琥珀酸合成酶、原卟啉原氧化酶和烯醇丙酮酰莽草酸-磷酸合成酶。
靶蛋白也可以是卤代烷烃脱卤酶。例如，根据本公开的含氯代烷烃肽结合部分(C
如本文所用，“靶蛋白结合配体”是指与靶蛋白，例如，所选定的靶蛋白结合的配体或部分。例如，靶蛋白结合配体可以是选择性和/或特异性结合靶蛋白的任何部分。根据本公开的双功能分子可以包含靶蛋白结合配体，其以足够的结合亲和力结合所述靶蛋白，而使靶蛋白比未被双功能分子结合时更容易降解或蛋白水解。
靶蛋白结合配体可以包含或衍生自已知用作蛋白功能的调节剂、启动子和/或抑制剂的小分子(或其类似物或片段)(例如，已知与靶蛋白结合的任何小分子)。例如，靶蛋白结合配体可以包含或衍生自已知会抑制给定靶蛋白活性的小分子。
能够包含于本文所述的双功能分子的靶蛋白结合配体部分中的小分子的非限制性实例包括：(i)与激酶(包括丝氨酸/苏氨酸激酶，例如，RAF、受体酪氨酸激酶和其他类别)的结合剂，(ii)与含溴区结构域的蛋白质(包括BET家族等)结合的化合物，(iii)表观遗传学调节剂化合物(包括与组蛋白或DNA甲基转移酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶和去甲基酶的结合剂等，例如，组蛋白脱乙酰基化酶(HDAC))，(iv)与包括STAT3、myc等的转录因子的结合剂，(v)与GTP酶(包括KRAS、NRAS、HRAS等)的结合剂，(vi)与磷酸酶的结合剂，(vii)泛素E3连接酶的结合剂(例如MDM2)，(viii)免疫抑制和免疫调节化合物，(ix)核受体的调节剂(包括雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体(TR)等)，(x)与易聚集蛋白(包括β-淀粉样蛋白、tau、Htt、α-核突触蛋白、聚Q-扩增蛋白等)的结合剂，(xi)与凋亡和抗凋亡因子(包括BCl
能够包含于本文所述的双功能分子的靶蛋白结合配体部分中的小分子的其他非限制性实例包括：(i)Hsp90抑制剂，(ii)人赖氨酸甲基转移酶抑制剂，(iii)血管生成抑制剂，(iv)靶向芳香烃受体(AHR)的化合物，(v)靶向FKBP的化合物，(vi)靶向HIV蛋白酶的化合物，(vii)靶向HIV-整合酶的化合物。
在一些情况下，靶蛋白结合配体衍生自BET抑制剂(例如，BET抑制剂IBET276)。在这种实例中，靶蛋白结合配体可以包括以下结构：
其中L表示连接基的连接位置，并且上面结构内的虚线表示连接基可以通过芳环上的任何位置连接至靶蛋白结合配体(例如，在一些实施方式中，L可以存在于该芳环上的4-位之处)。然而，本公开还涵盖在该靶蛋白结合配体上的任何化学合适位置之处连接或偶联至所述连接基。
可替代地，靶蛋白结合配体可以衍生自BRD9抑制剂，例如，靶蛋白结合配体可以包含以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。
在其他实例中，靶蛋白结合配体衍生自激酶抑制剂。在这种实例中，靶蛋白结合配体可以包含以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。然而，同样，本公开还涵盖在该靶蛋白结合配体上的任何化学合适位置之处连接或偶联至连接基。
靶蛋白结合配体可以衍生自激酶抑制剂，如CDK9抑制剂，并且可以包含以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。
或者，靶蛋白结合配体可以衍生自激酶抑制剂，如突变EGFR抑制剂，并且可以具有以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。
在一些情况下，靶蛋白结合配体可以衍生自GTP酶抑制剂，如KRAS G12C抑制剂。例如，靶蛋白结合配体可以具有以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。
在其他情况下，靶蛋白结合配体可以源自聚合酶抑制剂，如PARP1抑制剂。例如，靶蛋白结合配体可以具有以下结构：
其中L表示连接基的连接位置。
以下描述了各种类别的靶蛋白结合配体每种的可能靶蛋白-结合配体部分的代表性实例。
激酶抑制剂的实例可以查阅Jones et al.Small-Molecule KinaseDownregulators(2017,Cell Chem.Biol.,25:30-35)。根据本公开的一些实施例可以使用的其他激酶抑制剂包括，但不限于：
1.厄洛替尼(Erlotinib)衍生物酪氨酸激酶抑制剂：
其中R是例如通过醚基团连接的连接基；
2.激酶抑制剂舒尼替尼(sunitinib)(衍生化的)：
(衍生化的，其中R是连接至，例如，吡咯部分的连接基)；
3.激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)(衍生化的)：
(衍生化的，其中R是连接至，例如，酰胺部分的连接基)；
4.激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)(衍生化的)：
(衍生化的，其中R是连接至，例如，嘧啶的连接基)；
5.激酶抑制剂拉帕替尼(lapatinib)(衍生化的)：
(衍生化的，其中连接基，例如，通过磺酰基甲基的末端甲基连接)；
6.激酶抑制剂U09-CX-5279(衍生化的)：
衍生化的，其中连接基，例如，通过胺(苯胺)、羧酸或胺α连接至环丙基或环丙基；
7.在Millan,et al.,Design and Synthesis of Inhaled P38 Inhibitors forthe Treatment of Chronic Obstructive Pulmonary Disease,(2011,].Med.Chem.54:7797)中确定出的激酶抑制剂，包括具有以下结构的激酶抑制剂Y1W和Y1X(衍生化的)：
YIX
(1-乙基-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基]硫基}苄基)脲
衍生化的，其中连接基，例如，通过异丙基连接；
Y1W
1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基]硫基}苄基)脲
衍生化的，其中连接基，例如，优选通过异丙基或叔丁基连接；
8.在Schenkel,et al.,Discovery of Potent and Highly SelectiveThienopyridine Janus Kinase 2Inhibitors(2011,J.Med.Chem.,54(24):8440-8450)中确定的激酶抑制剂，包括具有以下结构的化合物6TP和OTP(衍生化的)：
6TP
4-氨基-2-[4-(叔丁基氨基磺酰基)苯基]-N-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺
噻吩并吡啶19
衍生化的，其中连接基，例如，通过与酰胺部分结合的末端甲基连接；
OTP
4-氨基-N-甲基-2-[4-(吗啉-4-基)苯基]噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺噻吩并吡啶8
衍生化的，其中连接基，例如，通过与酰胺部分结合的末端甲基连接；
9.在Van Eis,et al.,"2,6-Naphthyridines as potent and selectiveinhibitors of the novel protein kinase C isozymes",(2011Dec.,Biorg.Med.Chem.Lett.,15,21(24):7367-72)中鉴定的激酶抑制剂，包括具有以下结构的激酶抑制剂07U：
07U
2-甲基-N-1-[3-(吡啶-4-基)-2,6-萘啶-1-基]丙烷-1,2-二胺
衍生化的，其中连接基，例如，通过仲胺或末端氨基连接；
10.在Lountos,et al.,"Structural Characterization of InhibitorComplexes with Checkpoint Kinase 2(Chk2),a Drug Target for Cancer Therapy",(2011,J.Struct.Biol.,176:292)中确定的激酶抑制剂，包括具有以下结构的激酶抑制剂YCF：
衍生化的，其中连接基，例如，通过末端羟基中的任一个连接；
11.在Lountos,et al.,"Structural Characterization of InhibitorComplexes with Checkpoint Kinase 2(Chk2),a Drug Target for Cancer Therapy",(2011,J.Struct.Biol.176292)中确定的激酶抑制剂，包括具有以下结构的激酶抑制剂XK9和NXP(衍生化的)：
XK9
N-{4-[(1E)-N-(N-羟基脒基)乙烷腙基]苯基}-7-硝基-1H-吲哚-2-甲酰胺；
NXP
N-{4-[(1E)-N-脒基乙烷腙基]苯基}-1H-吲哚-3-甲酰胺
衍生化的，其中连接基，例如，通过末端羟基(XK9)或腙基(NXP)连接；
12.激酶抑制剂阿法替尼(afatinib)(衍生化的)(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁酰胺)(衍生化的，其中连接基，例如，通过脂族胺基团连接)；
13.激酶抑制剂福沙替尼(fostamatinib)(衍生化的)([6-({5-氟-2-[(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基]嘧啶-4-基}氨基)-2,2-二甲基-3-氧代-2,3-二氢-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-4-基]甲基磷酸二钠六水合物)(衍生化的，其中连接基，例如，通过甲氧基连接)；
14.激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)(衍生化的)(N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)：
(衍生化的，其中连接基，例如，通过甲氧基或醚基连接)；
15.激酶抑制剂乐伐替尼(lenvatinib)(衍生化的)(4-[3-氯-4-(环丙基氨甲酰基氨基)苯氧基]-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺)(衍生化的，其中连接基，例如，通过环丙基连接)；
16.激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)(衍生化的)(N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺)(衍生化的，其中连接基，例如，通过甲氧基或羟基连接)；
17.激酶抑制剂维莫非尼(vemurafenib)(衍生化的)(丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟苯基}-酰胺)(衍生化的，其中连接基，例如，通过磺酰丙基连接)；
18.激酶抑制剂格列卫(Gleevec)(也称为伊马替尼)(衍生化的)：
(衍生化的，其中R是，例如，通过酰胺基或通过苯胺胺基连接的连接基)；
19.激酶抑制剂帕唑帕尼(pazopanib)(衍生化的)(VEGFR3抑制剂)：
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分的连接基或通过苯胺胺基团连接)；
20.激酶抑制剂AT-9283(衍生化的)极光激酶抑制剂
(其中R是连接至，例如，苯基部分的连接基)；
21.激酶抑制剂TAE684(衍生化的)ALK抑制剂
(其中R是连接至，例如，苯基部分的连接基)；
22.激酶抑制剂尼洛替尼(nilotanib)(衍生化的)Abl抑制剂：
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分的连接基或通过苯胺胺基团连接)；
23.激酶抑制剂NVP-BSK805(衍生化的)JAK2抑制剂
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分或二唑基团的连接基)；
24.激酶抑制剂克唑替尼(crizotinib)衍生Alk抑制剂
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分或二唑基团的连接基)；
25.激酶抑制剂JNJ FMS(衍生化的)抑制剂
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分的连接基)；
26.激酶抑制剂佛瑞替尼(foretinib)(衍生化的)Met抑制剂
(衍生化的，其中R是连接至，例如，苯基部分或喹啉部分上的羟基或醚基团的连接基)；
27.变构蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂PTPlB
(衍生化的)：
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处，如所示；28.酪氨酸磷酸酶SHP-2结构域的抑制剂(衍生化的)：
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处；
29.BRAF(BRAFV600E)/MEK的抑制剂(衍生化的)：
衍生的，其中连接基团连接于，例如，R处；30.酪氨酸激酶ABL的抑制剂(衍生化的)
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处；
31.激酶抑制剂OSI-027(衍生化的)mTORCl/2抑制剂
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处；
32.激酶抑制剂OSI-930(衍生化的)c-Kit/KDR抑制剂
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处；和33.激酶抑制剂OSI-906(衍生化的)IGFlR/IR抑制剂
衍生的，其中连接基连接于，例如，R处；
(衍生化的，其中“R”表示连接基在哌嗪部分上的连接位点)。
靶向含人BET溴区结构域的蛋白质的化合物包括，但不限于，如下所述的与靶标相关的化合物，其中“R”表示连接基连接的位点，例如：
JQl，Filippakopoulos et al.Selective inhibition of BETbromodomains.Nature(2010)：
2.I-BET，Nicodeme et al.Supression of Inflammation by a SyntheticHistone Mimic.Nature(2010)。Chung et al.Discovery and Characterization ofSmall Molecule Inhibitors of the BET Family Bromodomains.J.Med Chem.(2011)：
3.描述于Hewings et al.3,5-Dimethylisoxazoles Act as Acetyl-lysineBromodomain Ligands.(2011,J.Med.Chem.54:6761-6770)中的化合物。
4.I-BET151，Dawson et al.Inhibition of BET Recruitment to Chromatin asan Effective Treatment for MLL-fusion Leukemia.Nature(2011)：
(其中，在每种情况下，R表示连接基的连接位点。)
根据本公开有用的HSP90抑制剂包括，但不限于：
1.在Vallee,et al.,"Tricyclic Series of Heat Shock Protein 90(HSP90)Inhibitors Part I:Discovery of Tricyclic Imidazo[4,5-C]Pyridines as PotentInhibitors of the HSP90 Molecular Chaperone(2011,].Med.Chem.,54:7206)中确定的HSP90抑制剂，包括YKB(N-[4-(3H-咪唑并[4,5-C]吡啶-2-基)-9H-芴-9-基]-琥珀酰胺)：
衍生的，其中连接基，例如，通过末端酰胺基团连接；
2.HSP90抑制剂p54(改性的)(8-[(2,4-二甲基苯基)硫基]-3]戊-4-炔-1-基-3H-嘌呤-6-胺)：
其中连接基，例如，通过末端乙炔基团连接；
3.在Brough,et al.,"4,5-Diarylisoxazole HSP90 Chaperone Inhibitors:Potential Therapeutic Agents for the Treatment of Cancer",(2008,].Med.Chem.,51:196)中确定的HSP90抑制剂，包括化合物2GJ(5-[2,4-二羟基-5-(1-甲基乙基)苯基]-N-乙基-4-[4-(吗啉-4-基甲基)苯基]异噁唑-3-甲酰胺)，其结构为：
衍生的，其中连接基，例如，通过酰胺基连接(于胺上或于胺上的烷基上)；
4.在Wright,et al.,Structure-Activity Relationships in Purine-BasedInhibitor Binding to HSP90 Isoforms,(2004Jun.,Chem Biol.11(6):775-85)中确定的HSP90抑制剂(改性的)，包括具有以下结构的HSP90抑制物PU3：
其中连接基团，例如，通过丁基连接；和
5.HSP90抑制剂格尔达霉素(geldanamycin)((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-13-羟基-8,14,19-三甲氧基-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧代-2-氮杂双环[16.3.l](衍生化的)或其任何衍生物(例如，17-烷基氨基-17-去甲氧基格尔达霉素(“17-AAG”)或17-(2-二甲氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格尔达霉素(“17-DMAG”))(衍生化的，其中连接基，例如，通过酰胺基连接)。
本发明的HDM2/MDM2抑制剂包括，但不限于：
1.在Vassilev,et al.,In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2,(2004,Science,303844-848),and Schneekloth,etal.,Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule:Enroute to chemical proteomics,(2008,Biorg.Med.Chem.Lett.,18:5904-5908)中确定的HDM2/MDM2抑制剂，包括(或另外)化合物坚果蛋白(nutlin)-3，坚果蛋白-2和坚果蛋白-1(衍生化的)，以及其所有衍生物和类似物：
(衍生化的，其中连接基连接于，例如，甲氧基基团或作为羟基连接)；
(衍生化的，其中连接基连接于，例如，甲氧基基团或羟基处)；
(衍生化的，其中连接基，例如，通过甲氧基或作为羟基连接)；和
2.反式-4-碘-4'-硼酸基查尔酮
(衍生化的，其中连接基，例如，通过羟基连接)。
在本公开的一些实例中有用的HDAC抑制剂(衍生化的)包括，但不限于：
1.Finnin，M.S.et al.Structures of Histone Deacetylase Homologue Boundto the TSA and SAHA Inhibitors.(1999,Nature,40:188-193)。
(衍生化的，其中“R”表示例如连接基的连接位点；和
2.PCT W000222577的式(I)定义的化合物(其全部内容通过引用结合于本文中)(“脱乙酰基酶抑制剂”)(衍生化的，其中连接基，例如，通过羟基连接)；
在本公开的一些实例中有用的人赖氨酸甲基转移酶抑制剂包括，但不限于：
1.Chang et al.Structural Basis for G9a-Like protein LysineMethyltransferase Inhibition by BIX-1294(2009,Nat.Struct.Biol.,16(3):312)。
(衍生化的，其中“R”表示，例如，连接基的连接位点；
2.Liu,F.et al Discovery of a 2,4-Diamino-7-aminoalkoxyquinazoline asa Potent and Selective Inhibitor of Histone Methyltransferase G9a.(2009,J.Med.Chem.,52(24):7950)。
(衍生化的，其中“R”表示连接基的潜在连接位点)；
3.阿扎胞苷(衍生化的)(4-氨基-1-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮)(衍生化的，其中连接基，例如，通过羟基或氨基连接)；和
4.地西他滨(衍生化的)(4-氨基-1-(2-脱氧-b-D-赤藓-呋喃戊糖基)-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮)(衍生化的，其中连接基，例如，通过羟基或氨基连接)。
在本公开的某些方面有用的血管生成抑制剂包括，但不限于：
1.GA-1(衍生化)及其衍生物和类似物，其结构和与连接基的结合如Sakamoto,etal.,Development of Protacs to target cancer-promoting proteins forubiquitination and degradation,(2003Dec.,Mol.Cell Proteomics,2(12):1350-1358)中所述；
2.雌二醇(衍生化)，如Rodriguez-Gonzalez,et al.,Targeting steroidhormone receptors for ubiquitination and degradation in breast and prostatecancer,(2008,Oncogene 27:7201-7211)中所述；
3.雌二醇、睾酮(衍生化)和相关衍生物，包括，但不限于，DHT及其衍生物和类似物，其结构和与连接基的结合，如Sakamoto,et al.,Development of Protacs to targetcancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation,(2003Dec.,Mol.Cell Proteomics,2(12):1350-1358)中所述；和
4.卵假散囊菌素(Ovalicin)，烟曲霉素(fumagillin)(衍生化的)，及其衍生物和类似物，其结构和与连接基的结合如Sakamoto,et al.,Protacs:chimeric moleculesthat target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination anddegradation(2001Jul.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(15):8554-8559)和美国专利7208157中概述，该专利以其全部内容通过引用结合于本文中。
在本公开的一些实例中有用的免疫抑制化合物包括，但不限于：
1.AP21998(衍生化的)，其结构和与连接基的结合如Schneekloth,et al.,Chemical Genetic Control of Protein Levels:Selective in Vivo TargetedDegradation(2004,J.Am.Chem.Soc.,126:3748-3754)中概述；
2.糖皮质激素(Glucocortisolone)(例如，氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙和甲基强的松龙)(衍生化的，其中连接基，例如，结合于任何羟基)和二丙酸倍氯米松(衍生化的，其中连接基，例如，连接于丙酸)；
3.甲氨蝶呤(衍生化的，其中连接基能够，例如，结合于任一个所述末端羟基)；
4.环孢蛋白(Ciclosporin)(衍生化的，其中连接基能够，例如，结合于任何丁基基团之处)；
5.他克莫司(Tacrolimus)(FK-506)和雷帕霉素(rapamycin)(衍生化的，其中连接基基团能够，例如，结合于所述甲氧基之一处)；和
6.放线菌素(Actinomycins)(衍生化的，其中连接基能够，例如，结合于所述异丙基之一处)。
根据本公开一些实例靶向芳香烃受体(AHR)的化合物包括，但不限于：
1.芹菜素(Apigenin)(衍生化的，以结合于连接基的方式，如Lee,et al.,Targeted Degradation of the Aryl Hydrocarbon Receptor by the PROTAC Approach:A Useful Chemical Genetic Tool,ChemBioChem Volume 8,Issue 17,pages 2058-2062,November 23,2007中所述)；和
2.SRl和LGC006(衍生化而使之结合连接基，如Boitano,et al.,ArylHydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human HematopoieticStem Cells(2010Sep.,Science,329(5997):1345-1348中所述)。
PLX4302
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
1.雄激素受体的RU59063配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
2.雄激素受体的SARM配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
3.雄激素受体配体DHT(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
4.MDV3100配体(衍生化的)
5.ARN-509配体(衍生化的)
6.六氢苯并异噁唑
7.四甲基环丁烷
1.雌激素受体配体
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
1.甲状腺激素受体配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点，而MOMO表示甲氧基甲氧基基团)。
1.HIV蛋白酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。参见，2010,J.Med.Chem,,53:521-538。
2.HIV蛋白酶的抑制剂
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的潜在位点)。参见，2010，J.Med.Chem.，53:521-538。
1.HIV整合酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。参见，2010,J.Med.Chem.,53:521-538。
2.HIV整合酶的抑制剂(衍生化的)
3.HIV整合酶的抑制剂拉替拉韦(Isentress)(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。参见，2010,J.Med.Chem.,53:6466。
1.HCV蛋白酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。
1.APT1和APT2的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”表示连接基连接的位点)。参见2011,Angew.Chem.Int.Ed.,50:9838-9842。
降解可以通过测量靶蛋白在如本文所述的双功能分子存在下的量和/或将其与在不存在双功能分子时观察到的靶蛋白量进行比较而确定。例如，可以测定已经用本文所述的双功能分子接触和/或处理的细胞中的靶蛋白的量。该量可以与未用双功能分子接触和/或处理的细胞中的靶蛋白的量进行比较。如果在用双功能分子接触和/或处理的细胞中靶蛋白的量降低，则可以认为该双功能分子会增进和/或促进靶蛋白的降解和/或蛋白水解。
靶蛋白的量可以使用本领域已知的方法，例如，通过对已经用双功能分子接触和/或处理的细胞进行免疫印迹分析测试、Western蛋白质印迹分析和/或ELISA进行测定。
如果在向细胞给药双功能分子后观察到靶蛋白的量减少至少10％，例如，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则可以认为发生了选择性降解和/或蛋白水解增加。
例如，如果在向细胞给药双功能分子后4h或更长(例如，4h、8h、12h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h和72h)观察到靶蛋白的量减少至少10％，(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％减少)，则可以认为已经发生了选择性降解和/或蛋白水解增加。双功能分子可以以任何浓度，例如，0.01nM-10μM，如0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM和10μM的浓度进行给药。在一些情况下，以约100nM的浓度给药双功能分子之后(例如，约8h的培养期之后)，观察到靶蛋白的降解增加至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。
双功能分子的降解活性的一个度量是DC
双功能分子的降解活性的另一个度量是D
所描述的双功能分子的功效的另一个度量可以是它们对细胞活力和/或其IC
本文所述的双功能分子可以为降解剂提供改善的生物利用度水平，如改善的口服生物利用度水平。
如本文所用，生物利用度是所给药的活性剂(例如，本文所述的双功能分子)到达受试者体内体循环的部分或比例。如本文所用，口服生物利用度是到达受试者体内体循环的口服给药活性剂的部分或比例。
口服生物利用度通过将具体的活性剂静脉给药的曲线下面积(AUC)与该活性剂口服给药的AUC进行比较而计算。AUC值是显示血浆中活性剂浓度随时间变化的曲线的定积分。如本文所用，AUC
口服生物利用度(F)可一使用以下公式计算：
其中：
D
D
AUC
AUC
本文所述的双功能分子可以具有至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％或至少约7％的口服生物利用度。在一些情况下，本文所述的双功能分子的口服生物利用度可以为约7％。
CNS(中枢神经系统)渗透
本文所述的双功能分子可以提供能够穿过血脑屏障和/或显示CNS穿透的降解剂。
受试者的CNS穿透水平和/或活性剂能够穿过血脑屏障的程度可以通过将活性剂在血浆中的浓度与给药活性剂后该活性剂在脑中的浓度进行比较而确定。CNS穿透的程度可以表示为脑中活性剂的浓度与血浆中活性剂浓度的比率(Cb:Cp)。
本文所述的双官能分子具有至少约0.01:1、至少约0.05:1、至少约0.1:1、至少约0.2:1、至少约0.3:1、至少约0.4:1、至少约0.5:1或至少约0.6:1的Cb:Cp比。
药物组合物
本公开提供了包含本文所述的双功能分子的药物组合物。在这种组合物中，可以合适地配制双功能分子，而使其能够通过允许足够部分的分子进入细胞而诱导靶蛋白降解的方式引入所述细胞的环境中。
因此，提供了一种包含本文所述的双功能分子以及药用载体的药物组合物。
药用载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，磷酸盐缓冲溶液和/或盐水。药用载体可以是水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、林格(Ringer)氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏或固定油。防腐剂和其他添加剂也可以存在，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
除了上述载体成分之外，上述药物组合物可替代地或另外包括合适的一种或多种其他的载体成分，如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等，以及为了使制剂与预期受体的血液等渗而包含的物质。
药物组合物可以存在于对受试者给药药物化合物的任何典型制剂中。典型制剂的代表性实例包括，但不限于，胶囊、颗粒剂、片剂、粉末、锭剂、栓剂、子宫托、鼻喷雾剂、凝胶、乳膏、软膏、无菌水性制剂、无菌溶液、气溶胶、植入物等。
药物组合物被配制成与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括非肠道给药，例如，静脉内、皮内、皮下、口服、透皮、局部、透粘膜、阴道和直肠给药。
药物组合物可以包括适合于口服、非肠道(包括皮下、皮内、肌肉内和静脉内)、局部(包括真皮、颊部和舌下)、直肠、鼻腔和肺部给药(例如，通过吸入)的那些。在合适的情况下，该组合物可以很方便地以离散的剂量单位存在，并可以通过药学领域中公知的任何方法制备。这些方法通常包括使活性化合物与液体载体或充分精细化的固体载体或两者混合至一起，并随后如果需要将产物成形为所需的制剂的步骤。
载体是固体的适合于口服给药的药物组合物，最优选以单位剂量制剂的形式存在，如丸剂、胶囊或片剂，每制剂都含有预定量的活性化合物。片剂可以通过压缩或模塑，可选地使用一种或多种辅助成分制成。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式，如可选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的粉末或颗粒的活性化合物而制备。模塑片剂可以通过用惰性液体稀释剂模塑活性化合物而制备。片剂可以可选地进行包衣，并且如果未包衣，则可以可选地进行刻痕。胶囊可以通过将活性化合物单独或与一种或多种辅助成分的掺混物填充到胶囊壳中，并随后以通常的方式将其密封而制备。扁囊剂类似于胶囊，其中活性化合物与任何辅助成分一起密封于米纸囊中。双功能分子也可以配制成可分散颗粒，其可以例如在给药前悬浮于水中，或撒于食物上。颗粒可以包装于，例如，小袋中。载体是液体的适合口服给药的组合物，可以以水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或水包油液体乳液的形式存在。用于口服给药的组合物包括控释剂型，例如，片剂，其中活性化合物配制于合适的控释基质中，或用合适的控释膜进行包衣。
适用于非肠道给药的药物组合物包括活性化合物在水性或油性载体中的无菌溶液或悬浮液。可注射制剂可以适用于推注或连续输注。这种制剂很方便地存在于单位剂量或多剂量容器中，在引入制剂后将其密封直到需要使用。或者，双功能分子可以是粉末形式，其在使用前由合适的载体，如无菌、无热原水进行重构。
药物组合物也可以配制成长效贮库制剂，其可以通过肌内注射或植入，例如，皮下或肌内，进行给药。贮库制剂可以包括，例如，合适的聚合材料或疏水材料，或离子交换树脂。
适用于局部制剂的药物组合物可以，例如，作为凝胶、乳膏或软膏提供。
本文所述的双功能分子可以作为药学和/或生理学可接受的盐、溶剂化物或衍生物存在于药物组合物中。
本公开的双官能分子的药学和/或生理学上可接受的盐的代表性实例可以包括，但不限于，与有机羧酸如乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、丙酮酸、草酸、富马酸、草酰乙酸、羟乙磺酸(isethionic)、乳糖酸(lactobionic)和琥珀酸；有机磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸；和无机酸如盐酸、硫酸、磷酸和氨磺酸形成的酸加成盐。
本发明化合物的药物和/或生理功能衍生物是可以在体内转化为母体化合物的衍生物。这种药物和/或生理功能衍生物也可以称为“前药”或“生物前体”。本公开的化合物的药物和/或生理功能衍生物可以包括体内可水解的酯或酰胺，特别是酯。
制备、纯化和/或处理本文所述的双功能分子的相应药学和/或生理学上可接受的溶剂化物可能是方便的或合乎所需的，其可以用于任何一种所述用途/方法。术语溶剂化物在本文中用于是指溶质如化合物或化合物的盐与所述溶剂的络合物。如果溶剂是水，则所述溶剂化物可以称为水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等，这取决于每分子底物存在的水分子数。
如本文所述，部分Z可以构成预定用于靶向蛋白质降解方法中的双功能分子的部分，其中部分Z用于调节、增进和/或促进靶蛋白的蛋白酶体降解。
因此，根据本公开的另一方面，提供了部分Z或包含部分Z的化合物(例如，如式(I)-(III)中任一项所定义)在靶向蛋白质降解方法(例如，靶向蛋白质的体外或体内降解方法)中的用途。例如，部分Z可以作为靶向蛋白质降解的启动剂或促进剂而找到特别应用。
本文还提供了部分Z或包含部分Z的化合物(例如，如式(I)-(III)中任一项所定义)在制备适合靶向蛋白质降解的双功能分子中的用途。
本公开的双功能分子可以调节、增进和/或促进靶蛋白的蛋白酶体降解。因此，本文提供了一种选择性降解和/或提高细胞中靶蛋白的蛋白水解的方法，该方法包括用本文所述的双功能分子接触和/或处理细胞。该方法可以在体内或体外进行。
具体而言，提供了一种在有此需要的受试者中选择性降解和/或提高靶蛋白的蛋白水解的方法，该方法包括向受试者给药治疗有效量的本公开的双功能分子。
因此，本公开的双功能分子可以在医学和/或疗法中找到应用。具体而言，本公开的双功能分子可以用于治疗和/或预防任何通过靶蛋白调节的疾病或病症。例如，本公开的双功能分子可以用于治疗任何由靶蛋白通过降低细胞，例如，受试者细胞中该蛋白的水平进行调节的疾病。
还提供了本文所述的双功能分子在制备用于治疗和/或预防任何通过靶蛋白调节的疾病或病症的药物中的用途。此外，提供了部分Z(例如，如式(I)-(III)中任一项所定义)在制备用于治疗和/或预防任何通过靶蛋白调节的疾病或病症的药物中的用途。
通过本公开的分子可以治疗和/或预防的疾病和/或病症包括任何与蛋白质活性水平异常相关和/或由蛋白质活性水平的异常引起的疾病。
这种疾病和病症包括其病理学与蛋白质水平异常(例如升高)和/或蛋白质过表达至少部分相关的那些疾病和病症。例如，双功能分子可以用于治疗和/或预防患有疾病的受试者中观察到蛋白质水平升高的疾病。在其他实例中，所述疾病和/或病症可以是其病理学与不正常的蛋白质表达(例如，在错误的时间和/或在错误的细胞中的表达)、蛋白质过量表达或突变蛋白表达至少部分相关的那些疾病。在一个实例中，当突变蛋白干扰细胞、组织或器官的正常生物活性时，就会引起突变蛋白疾病。
因此，本文提供了一种治疗和/或预防与异常蛋白质活性水平相关和/或由异常蛋白活性水平引起的疾病或病症的方法，该方法包括给药治疗有效量的如本文所述的双功能化合物。
使用该双功能化合物可以治疗和/或预防的疾病和/或病症的典型实例包括(但不限于)癌症、哮喘、多发性硬化症、纤毛病、腭裂、糖尿病、心脏病、高血压、炎症性肠病、精神发育迟滞、情绪障碍、肥胖、屈光不正、不孕、安格尔曼(Angelman)综合征、卡纳万(Canavan)病、乳糜泻(Coeliac)病、腓骨肌萎缩(Charcot-Marie-Tooth)病、囊性纤维化、假肥大肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、嗜铬细胞血症(Haemochromatosis)、血友病(Haemophilia)、克氏综合征(Klinefelter's syndrome)、神经纤维瘤病、苯丙酮尿症、多囊肾病、(PKD1)或4(PKD2)普瑞德-威利(Prader-Willi)综合征、镰状细胞病(Sickle-celldisease)、泰伊-萨克斯二氏(Tay-Sachs)病和特纳(Turner)综合征。
进一步的实例包括：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(卢-贾里格(Lou Gehrig)病)、神经性厌食症、焦虑症、动脉粥样硬化、注意力缺陷多动障碍、自闭症、双相情感障碍、慢性疲劳综合征、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、冠心病、痴呆症、抑郁症、1型糖尿病，2型糖尿病、癫痫、格林-巴利(Guillain-Barre)综合征、肠易激综合征、狼疮、代谢综合征、多发性硬化症、心肌梗死、肥胖、强迫症、恐慌症、帕金森病、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、精神分裂症、中风、血栓闭塞性脉管炎、抽动秽语综合征(Tourette syndrome)和血管炎。
还有的进一步的实例包括：铜蓝蛋白血症(aceruloplasminemia)、II型软骨发育不全(Achondrogenesis type II)、软骨发育不完全(achondroplasia)、头端畸形(Acrocephaly)、2型戈谢病(Gaucher disease type 2)、急性间歇性血卟啉病(acuteintermittent porphyria)、卡纳万病、腺瘤性息肉病(Adenomatous Polyposis Coli)、ALA脱水酶缺乏、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏、肾上腺生殖系统综合征、肾上腺白细胞病、ALA-D血卟啉病、嗜酸性粒细胞色素沉着症、ALA脱水酶缺乏、尿黑酸病(Alkaptonuria)、亚历山大病、尿黑酸黄褐病(Alkaptonuric ochronosis)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、α-1蛋白酶抑制剂、肺气肿、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔斯特雷姆(Alstrom)综合征、亚历山大病、釉质形成缺陷症(amelogenesis imperfecta)、ALA脱水酶缺乏症、安德森-法布里(Anderson-Fabry)病、雄激素不敏感综合征、贫血、弥漫性血管角化瘤、视网膜血管瘤(范·希佩尔-林道(vonHippel-Lindau)病)、阿佩尔(Apert)综合征、蛛网膜综合征(Arachnodactyly)(马凡(Marfan)综合征)、斯蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、多发性先天性关节松弛症(Arthrochalasis multiplex congenital)(Ehlers-Danlos综合征#关节松弛症型)、共济失调-毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)、雷特综合征、原发性肺动脉高压、桑德霍夫病、II型神经纤维瘤病、Beare Stevenson旋转表皮综合征(Beare-Stevenson cutisgyrata syndrome)、地中海热、家族性、本杰明综合征、β-地中海贫血、双侧听神经纤维瘤病(II型神经纤维瘤症)，因子V莱顿血栓形成倾向症、Bloch-Sulzberger综合征(色素失禁(incontinentia pigmenti))、Bloom综合征、X-连锁铁母细胞性贫血、Bonnevie-Ullrich综合征(Turner综合征)、Bourneville病(结节性硬化症)、朊病毒病、Birt-Hogg-Dube综合征、脆性骨病(成骨不全)、Broad-Thumb-Hallux综合征(Rubinstein-Taybi综合征)、青铜色糖尿病/肝硬化(血色素沉着症)、延髓肌萎缩(肯尼迪病)、Burger-Grutz综合征(脂蛋白脂酶缺乏症)、CGD慢性肉芽肿性疾病、短指发育不良(Campomelic dysplasia)、生物素酶缺乏症(biotinidase deficiency)、心肌病(Noonan综合征)、猫哭病(Cri du chat)、CAVD(先天性输精管缺失)、Caylor心面部综合征(CBAVD)，CEP(先天性红细胞生成性卟啉病(congenitalerythropoietic porphyria))、囊性纤维化、先天性甲状腺功能减退、软骨营养不良综合征(软骨发育不全)、大骨骺发育不良、Lesch-Nyhan综合征、半乳糖血症、Ehlers-Danlos综合征、Thanatophoric发育不良、Coffin-Lowry综合征、Cockayne综合征、(家族性腺瘤性息肉病)、先天性红细胞生成性卟啉病、先天性心脏病、甲血红蛋白血症/先天性甲血红蛋白血症、软骨发育不全、X-连锁铁母细胞性贫血、结缔组织病、锥管异常面部综合征、库利氏贫血(β-地中海贫血)、铜储存病(Copper storage disease)(Wilson病)、铜转运病(Menkes病)、遗传性粪卟啉病(hereditary coproporphyria)、Cowden综合征、颅面关节异常(Crouzon综合征)，克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)(朊病毒病)、Cockayne综合征、Cowden综合征、Curschmann-Batten-Steinert综合征(强直性肌营养不良(myotonic dystrophy))、Beare-Stevenson表皮旋转综合征、原发性高草酸尿症、脊椎骨骺发育不良(Strudwick型)、肌营养不良、Duchenne和Becker型肌营养不良(DBMD)、Usher综合征、退行性神经疾病(包括德格罗奇综合征和德杰林-索塔斯综合征)、发育障碍、远端脊髓性肌萎缩、V型、雄激素不敏感综合征、弥漫性球状体硬化症(克拉布(Krabbe)病)、迪乔治综合征(Di George'ssyndrome)、二氢睾酮受体缺乏症、雄激素不敏感性综合征、唐氏综合征、侏儒症、红细胞生成性原卟啉病、类红细胞5-氨基乙酰丙酸合成酶缺乏症、红细胞生成性卟啉病、红细胞产生性原卟啉病、红血球生成性尿卟啉病、弗里德里希共济失调(Friedreich's ataxia)、家族性发作性多发性骨病、迟发性皮肤卟啉病、家族性压力敏感神经病变、原发性肺动脉高压(PPH)、胰腺纤维囊性疾病、脆性X综合征、半乳糖血症、遗传性脑疾病、巨细胞肝炎(新生儿血色素沉着病)、Gronblad-Strandberg综合征(弹性假黄瘤)、Gunther病(先天性红细胞生成性卟啉病)、血色素沉着症、Hallgren综合征、镰状细胞贫血、血友病、肝红细胞生成型卟啉病(HEP)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau病)、亨廷顿舞蹈症、Hutchinson-Gilford早衰综合征(早衰症)、雄激素过多、软骨发育不良、低铬性贫血、免疫系统疾病(包括X-连锁严重联合免疫缺陷)、Insley-Astley综合征、Jackson-Weiss综合征、Joubert综合征、Lesch-Nyhan综合征、Jackson-Weis综合征、肾脏疾病(包括高草酸尿、克氏综合征(Klinefelter's syndrome)、Kniest发育不良、腔隙性痴呆、Langer-Saldino软骨发育不全、共济失调毛细血管扩张症、Lynch综合征、赖氨酰羟化酶缺乏症、Machado-Joseph病、代谢障碍(包括Kniest发育异常)、马凡综合征、运动障碍、Mowat-Wilson综合征、囊性纤维化、Muenke综合征、多发性神经纤维瘤病，Nance-Insley综合征、Nance-Sweeney软骨发育不良、Niemann-Pick病、Noack综合征(Pfeiffer综合征)、Osler-Weber-Rendu病、Peutz-Jeghers综合征、多囊肾病、多发性骨骺纤维发育不良(McCune-Albright综合征)、Peutz-Jeghers综合征、Prader-Labhart-Willi综合征、血色素沉着症、原发性高尿酸血症综合征(莱希-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome))、原发性肺动脉高压、原发性老年退行性痴呆、朊病毒病、早衰症(Hutchinson-Gilford-Progeria综合征)、进行性舞蹈病、慢性遗传性(亨廷顿)(亨廷顿舞蹈症)、进行性肌萎缩、脊髓性肌萎缩、丙酸血症、原卟啉病、近端强直性肌营养不良、肺动脉高压、PXE(弹性假黄色瘤(pseudoxanthoma elasticum))、Rb(视网膜母细胞瘤)、Recklinghausen病(I型神经纤维瘤病)、复发性多发性脊柱炎、视网膜疾病、视网膜母细胞癌、雷特综合征、RFALS 3型、Ricker综合征、Riley-Day综合征、Roussy-Levy综合征、严重软骨发育不全伴发育迟缓和黑棘皮病(S ADD AN)、Li-Fraumeni综合征、肉瘤、乳腺、白血病和肾上腺(SBLA)综合征、结节性硬化症(结节性硬化)、SDAT、SED先天性(先天性脊椎骨骺发育不良)、SED Strudwick(先天性脊柱骨骺发育异常，Strudwick-型)、SEDc(先天性脊椎骨骺发育不良)、SEMD、Strudwick型(脊椎骨骺发育不良，Strudwick-型)、Shprintzen综合征、皮肤色素沉着障碍、Smith-LemLi-Opitz综合征、南非遗传性卟啉病(杂色卟啉病)、婴儿发病上行遗传性痉挛性瘫痪、言语和交流障碍、鞘脂增多症、Tay-Sachs病、脊髓小脑共济失调、Stickler综合征、中风、雄激素不敏感综合征、四氢生物蝶呤缺乏症、β-地中海贫血、甲状腺疾病Tomatic神经病(易患压疮的遗传性神经病)、Treacher-Collins综合征、Triplo X综合征(triple X综合征)、21三体综合征(唐氏综合症)、X三体综合征、VHL综合征(von Hippel-Lindau病)、视力障碍和失明(Alstrom综合征)、Vrolik病、Waardenburg综合征、Warburg-Sjo-Fledelius综合征、Weissenbacher-Zweymüller综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、沃尔夫周期性疾病、Weissenbachir-Zweymüler综合征和着色性干皮病(Xerodermapigmentosum)。
使用所述双功能分子可以治疗和/或预防的癌症的典型实例包括，但不限于，鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝细胞癌和肾细胞癌、膀胱癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食道癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病；良性和恶性淋巴瘤，特别是伯基特淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；良性和恶性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；多发性骨髓瘤，肉瘤，包括尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、周围神经上皮瘤、滑膜肉瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤，神经节神经瘤、神经节胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体细胞瘤、脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤；肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤；癌瘤、霍奇金病、威尔姆斯瘤和畸胎癌。进一步的实例包括，T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、T系淋巴细胞淋巴瘤(T-LL)、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病、前-B ALL、前-B淋巴瘤、巨B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞ALL、费城染色体阳性ALL和费城染色体阳性CML。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”用于描述动物，如哺乳动物(例如，人或驯养动物)，向其提供根据本公开的组合物的治疗，包括预防性治疗。为了治疗特定动物如人类患者的那些所特异性感染、病症或疾病状态，术语“患者”是指所述特定的动物，包括驯养动物如狗或猫，或农场动物如马、牛、羊等。一般而言，在本发明中，术语“患者”是指人类患者，除非该术语的使用上下文中另有说明或暗示。
本公开还涵盖确定本文所述的双功能分子，例如，能够有效调节、增进和/或促进靶蛋白的蛋白水解的双功能分子中使用的合适靶蛋白结合配体和连接基的方法。该方法可以有助于确定特定靶蛋白结合伴侣的合适连接基而使降解水平进一步优化。
该方法可以包括：
a.提供双功能分子，所述双功能分子包含：
(i)第一配体，所述第一配体包含根据Z(如式(I)-(III)中任一个定义)的结构；
(ii)与靶蛋白结合的第二配体(靶蛋白结合配体)；和
(iii)共价连接第一和第二配体的连接基；
b.使细胞与所述双功能分子接触；和
c.检测所述靶蛋白在所述细胞中的降解。
该方法可以还包括以下步骤：
d.在不存在所述双功能分子的情况下检测所述靶蛋白在所述细胞中的降解；和
e.将与双功能分子接触的细胞中靶蛋白的降解水平与不存在该双功能分子时靶蛋白的降解水平进行比较；
其中所述靶蛋白在与所述双功能分子接触的细胞中的降解水平增加表明所述双官能分子增进和/或促进了所述靶蛋白质的降解。
在这样的方法中，检测靶蛋白降解的步骤可以包括检测细胞中靶蛋白水平的变化。例如，靶蛋白水平的降低指示靶蛋白的降解。与双功能分子接触的细胞中靶蛋白水平降低的增加(与在不存在双功能分子的情况下细胞中观察到的靶蛋白水平降低相比)表明双功能分子增进和/或促进了靶蛋白的降解。
该方法可以还包括提供多个连接基，每个连接基用于将第一和第二配体共价连接至一起而形成多个双功能分子。由多个双功能分子中的每一个提供的降解水平可以进行检测和比较。那些显示出更高的靶蛋白降解水平的双功能分子表明与所选择的靶蛋白结合伴侣一起使用的优选和/或最佳连接基。
该方法可以在体内或体外进行。
本公开还提供了双功能分子的库，所述库包含许多双功能分子，所述多个双官能分子包含共价连接至所选的靶蛋白结合伴侣的多个Z部分。
因此，靶蛋白结合伴侣可以预选择，而所述Z部分可以不预先确定。该库可以用于确定双功能分子的候选Z部分在调节、增进和/或促进靶蛋白的选择性蛋白降解中的活性。
本公开还包括双功能分子的库，所述库包含许多双功能分子，所述多个双官能分子包含许多靶蛋白结合配体和所选定的Z部分。因此，可以预先选择双功能分子的Z部分，而所述靶蛋白可以不预先确定。该库可以用于确定所推定的靶蛋白结合配体的活性及其作为靶蛋白的结合剂而促进靶蛋白降解的价值。
根据本公开的一个进一步的方面，提供了一种制备如本文所述的双功能分子的方法。
制备双功能分子的方法可以包括以下步骤：
(a)提供包含根据Z(如式(I)-(IV)中任一个所定义)的结构的第一配体或部分；
(b)提供结合靶蛋白的第二配体或部分(例如，本文定义的靶蛋白结合配体)；和
(c)使用本文定义的连接基连接(例如，共价连接)所述第一和第二配体或部分。
在其他实例中，制备双功能分子的方法可以包括以下步骤：
(a)提供靶蛋白结合配体(如本文中定义)；
(b)将连接基(如本文定义)连接(例如，共价连接)至靶蛋白结合配体而提供靶蛋白结合配体-连接基缀合物(TBL-L)；
(c)进一步使所述缀合物的连接基部分反应而在其上添加和/或形成根据Z(如式(I)-(III)中任一个所定义)的结构，以提供具有通式TBL-L-Z的双官能分子。
具体实施方式
现在将参照以下附图详细描述本发明，这些附图显示：
图1显示了许多适用于靶向蛋白质降解的双功能分子的IC
图2显示了为每个所测试的细胞系绘制的对I-BET726测定的GI
合成路径概述——图解方案1
i)R
i)CbzCl，NEt
i)t-BuMe
i)醛或酮，NaBH
i)HBr；ii)Boc
i)MeNH
i)NH
i)2-三甲基甲硅烷基乙基(2S)-2-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸酯，NaOt-Bu，THF；ii)TBAF，THF；iii)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(4-氧代丁基)氨基甲酸酯，NaHB(OAc)
N-
苯乙胺(I)(1.0当量)在CH
Bischler-Napieralski环化反应——通用方案2
用POCl
用硼氢化钠(2.0当量)在0℃下处理二氢异喹啉(I)(1.0当量)在MeOH(0.1M)(或EtOH(0.1M)和乙酸(0.5当量)中的溶液，并搅拌2小时。LC-MS显示完全转化。通过加入HCl(1M)使反应猝灭，然后用NaOH将pH调节至～8，并用DCM萃取。用水和盐水洗涤所合并的有机层，用MgSO
脱甲基化—通用方案4
将苯酚甲基醚(I)(1.0当量)在48％ HBr水溶液(10当量)中的悬浮液加热至100℃长达6小时。在减压下蒸掉挥发物，并干燥残留物，直到获得固体。由EtOAc进行研磨而得到相应的苯酚(II)。
将胺(1.0当量)在THF或DCM中的溶液(0.1M)用二碳酸二叔丁酯(1.1当量)和碳酸氢钠或三乙胺(5.0当量)的饱和水溶液进行处理，并将反应混合物在rt下搅拌3小时。用水稀释所述反应混合物并用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤所合并的有机层，用MgSO
用K
用溶于水中的氢氧化锂一水合物(3.0当量)处理酯(1.0当量)在THF中的溶液(0.2M)，并将混合物搅拌4小时。通过添加5％ KHSO
Boc保护的胺(1.0当量)在CH
用Et
用醛(2.5当量)和哌啶(0.5当量)处理氰基乙酰胺(1.0当量)在THF或EtOH中的溶液(0.1M)，并将混合物加热回流72小时(如果在THF中)或在室温下加热回流16小时(如果在EtOH中)。挥发物在减压下蒸发。通过快速色谱法或反相制备HPLC纯化而得到相应的氰基丙烯酰胺。
胺(1.0当量)在THF中的溶液(0.1M)用氯甲酸苄酯(1.1当量)和碳酸氢钠饱和水溶液(5.0当量)处理，而反应混合物在室温下搅拌3小时。用水稀释反应混合物并用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤所合并的有机层，用MgSO
用Pd/C(10％，0.05当量)处理Cbz-氨基甲酸酯(1.0当量)在EtOAc中的溶液(0.1M)，并将悬浮液在气球压力氢气气氛下搅拌2小时。通过在硅藻土上过滤除去固体，并在减压下浓缩所述滤液而获得相应的胺。
用丙烯酸(II)(1.0当量)HATU(1.1当量)和DIPEA(2.5当量)的DMF溶液(0.1M)处理胺(I)(1.0当量)在DMF中的溶液(0.1M)，并在rt下搅拌反应混合物15分钟。用水猝灭反应并用EtOAc萃取。合并的有机层用LiCl(5％)、水和盐水洗涤，用MgSO
用哌啶(0.1当量)处理醛(1.0当量)和丙二酸(6.0当量)在吡啶中的溶液(1.5M)，并将反应混合物加热至100℃长达14小时。蒸发掉挥发物，并用HCl(1.0M)处理残留物。通过过滤收集沉淀物而获得相应的丙烯酸。
用Cs
将醛(II)(1.5当量)和3,3,3-三氟丙酸(I)(1.0当量)在THF(0.2M)中的溶液冷却至0℃，并用TiCl
用醛(II)(2.5当量)和哌啶(0.5当量)处理N,N-二甲基丙二酸叔丁酯(I)(1.0当量)在THF中的溶液(0.2M)，并将混合物加热至66℃长达72小时。在减压下蒸发挥发物。通过快速色谱法纯化得到相应的酰胺基丙烯酰胺叔丁酯。然后用50％TFA在DCM中的溶液处理酯，并使其反应直到通过HPLC观察到叔丁基酯完全脱保护。在减压下除去挥发物而获得丙酸酰胺(III)。
砜Knoevenagel缩合—通用方案18
用醛(II)(2.5当量)和哌啶(0.5当量)处理甲基磺酰基乙酸叔丁酯(I)(1.0当量)在THF中的溶液(0.2M)，并将混合物加热至66℃长达72小时。在减压下蒸发掉挥发物。通过快速色谱法纯化而得到相应的磺丙烯酸酯。然后用50％ TFA在DCM中的溶液处理该酯，并使其反应直到通过HPLC观察到叔丁基酯完全脱保护。在减压下除去挥发物，并将酸从乙酸乙酯中结晶而获得磺丙烯酸酯(III)。
将醇(1.0当量)在CH
用乙醇钛(IV)(2.0当量)，接着用2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.3当量)处理醛或酮(1.0当量)在THF中的溶液，并将混合物加热至66℃长达16小时。通过加入NH
将亚磺酰亚胺(1.0当量)在THF中的溶液(0.1M)冷却至0℃，并用NaBH
将亚磺酰亚胺(1.0当量)在CH
将亚磺酰胺(1.0当量)在THF中的溶液冷却至0℃，并用LiHMDS(2.0当量)处理，将混合物搅拌15分钟。用有机卤化物处理所得溶液，并回温至室温。通过加水猝灭反应，并用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤所合并的有机层，用MgSO
将甲硅烷基醚(1.0当量)在CH
向亚磺酰胺(1.0当量)在乙醚中的溶液(0.2M)加入HCl(4M，在二噁烷中，3.0当量)。通过TLC监测反应。一旦观察不到起始物质，就过滤掉悬浮液，用乙醚洗涤，而所分离的胺盐酸盐无需进一步纯化进行使用。
用酮或醛(2.0当量)和氰基硼氢化钠(或三乙酰氧基硼氢化钠，或聚合物结合的氰基硼氢化物)(4.0当量)处理胺(1.0当量)在MeOH(或THF或DCM)中的溶液(0.1M)，并将混合物搅拌12小时。通过加入水使反应猝灭，并用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤所合并的有机层，用MgSO
芳基卤化物(1.0当量)、硼酸或酯(1.5当量)、K
用Pd/C(10％，0.05当量)处理烯烃(1.0当量)在MeOH中的溶液，并将悬浮液在氢气气氛下搅拌2小时。通过在硅藻土上过滤除去固体，并在减压下浓缩滤液而获得相应的氢化产物。
将酯(1.0当量)在CH
在室温下向胺(1当量)、DIPEA(3.0当量)和碘化钾(0.3当量)在DMF中的搅拌溶液中加入烷基-Br(1当量)。反应混合物室温下搅拌5小时，随后用水稀释并用EtOAc萃取。干燥(Na
向羧酸(1.0当量)搅拌的DMF溶液中加入DIPEA(2.5当量)和HATU(1.5当量)。反应混合物搅拌5分钟，然后加入相关的胺(1.5当量)，并将反应混合物室温下搅拌12h。反应用冰冷之水猝灭并用EtOAc萃取。所合并的有机层在真空中浓缩，得到粗产物。如前所述，通过快速色谱/反相制备HPLC纯化粗产物，而得到所需化合物。
在0℃下，向搅拌的Weinreb酰胺(1.0当量)在THF中的溶液滴加DIBALH(3.0当量)。反应物在RT下搅拌4小时，然后用HCl(1.5N)和水猝灭，随后通过硅藻土过滤。滤液用EtOAc萃取，干燥(Na
将N-Boc，CO
酮(1.0当量)在甲醇(0.15M)中的溶液室温下用乙酸铵(10.0当量)处理，然后用氰基硼氢化钠(1.50当量)处理并搅拌12小时。用水猝灭反应，并用DCM萃取混合物。所合并的有机提取物用盐水洗涤，用MgSO
在0℃下，向搅拌的N-酰基苯乙胺(1.00当量)在DCM中溶液(0.3M)滴加草酰氯(12.0当量)。所得反应混合物回温至室温并搅拌2小时。然后反应混合物冷却至-78℃，并逐份加入氯化铁(III)(6.00当量)。混合物缓慢回温至室温并搅拌16小时。用HCl(1.0M)猝灭反应并用DCM萃取。所合并的提取物在减压下浓缩。残留物重新溶解于H
制备实施例
实施例1：N-(3-甲氧基苯乙基)乙酰胺
按照通用方案1制备。获得1.46g，收率79.4％。
实施例2：N-(3-甲氧基苯乙基)丁酰胺
按照通用方案1制备。获得870mg，收率65.2％。
实施例3：6-甲氧基-1-甲基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案2制备。获得446mg，收率76.6％。
实施例4：6-甲氧基-1-丙基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案2制备。获得553mg，收率69.2％。
实施例5：6-甲氧基-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。获得417mg，收率92.8％
实施例6：6-甲氧基-1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。获得452mg，收率80.9％。
实施例7：1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-醇氢溴酸盐
按照通用方案4制备。获得492mg，收率85.7％。
实施例8：1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-醇氢溴酸盐
按照通用方案4制备。得到485mg，收率80.9％。
实施例9：6-羟基-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5制备。得到485mg，收率80.9％。
实施例10：6-羟基-1-丙基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯
按照通用方案5制备。获得216mg，收率80.7％。
实施例11：6-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案6。得到229mg，收率79.9％。
实施例12：6-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)-1-丙基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案6。获得244mg，收率87.2％。
实施例13：6-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸苄酯
按照通用方案6。获得330mg，收率84.0％。
实施例14：2-((2-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案7制备。得到51.3mg，收率97.0％。
实施例15：2-((2-(叔丁氧基羰基)-1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案7制备。获得48.8mg，收率86％。
实施例16：6-羟基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸苄酯
按照通用方案11制备。获得558mg，收率74％。
实施例17：2-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙酸叔丁酯
按照通用方案12制备。获得233mg，收率92.5％。
实施例18：(E)-2-((2-(2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案13制备。得到2.2mg，收率95.7％。m/z＝370.0(m+H)
实施例19：(E)-3-(噻唑-2-基)丙烯酸
按照通用方案14制备。获得350mg，收率25.5％。
实施例20：(Z)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-氟丙烯酸
按照通用方案15制备。获得190mg，收率77％。m/z＝246.0(M+H)
实施例20a：(Z)-2-氟-3-(噻唑-2-基)丙烯酸
按照通用方案15制备。获得88mg，收率56％。m/z＝174.0(M+H)
实施例21：(Z)-3-(6-溴吡啶-2-基)-2-(三氟甲基)丙烯酸
按照通用方案16制备。获得64.8mg，收率27.5％。
实施例22：(E)-2-(二甲基氨基甲酰基)-3-(噻唑-2-基)丙烯酸
按照通用方案17制备。获得14.8mg，收率24.5％。m/z＝227.2(M+H)
实施例23：(Z)-2-(甲基磺酰基)-3-(噻唑-2-基)丙烯酸
按照通用方案18制备。获得88mg，收率42％。
实施例24:6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3,4-二氢萘-1(2H)-酮
按照通用方案19制备。获得1.35g，收率79.2％。m/z＝277.2(M+H)
其他实施例：
实施例26：(E)-N-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3,4-二氢萘-1(2H)-亚基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
按照通用方案20制备。获得1.12g，收率60.4％。
其他实施例：
实施例27：N-(6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,2,3,4-四氢萘-1-基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
按照通用方案21制备。获得1.02g，收率90.6％。
m/z＝382.3(M+H)
其他实施例：
实施例28：N-(1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)庚基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
按照通用方案22制备。获得663mg，收率86.7％。
实施例29：N-苄基-N-(1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)丁基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
按照通用方案23制备。获得594mg，收率80.2％。
其他实施例：
实施例30：N-乙基-N-(1-(4-羟基苯基)丁基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
按照通用方案24制备。获得213mg，收率79.5％。
其他实施例：
实施例31：1-(4-溴苯基)-N-甲基丁-1-胺
按照通用方案25制备。获得112mg，定量收率。m/z＝211.0，对应于1-(4-溴苯基)丁-1-基鎓阳离子。
实施例32
在室温和氮气气氛下，向搅拌的1-(4-溴苯基)丁-1-酮(50g，220mmol)在甲胺(2M，在THF中，330mL，660mmol)中的溶液中加入乙醇钛(60.5mL，286mmol)。反应混合物的颜色从无色变为混浊。反应混合物在室温下搅拌16小时。然后，当在0℃下分批加入NaBH
实施例33：2-(4-(1-(异丙基氨基)丁基)苯氧基)乙酸乙酯
按照通用方案26制备。获得115mg，收率75.2％。
实施例34：2-(4-(1-(2-氰基-N-甲基乙酰胺基)丁基)苯氧基)乙酸
按照通用方案9制备。获得230mg，收率81.1％。m/z＝609.7(2M+H)
其他实施例：
实施例36：(E)-2-(4-(1-(2-氰基-N-异丙基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙酸
按照通用方案10制备。获得34.4mg，收率81.0％。m/z＝428.4(M+H)
其他实施例：
实施例37：(E)-3-(4-(1-(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙烯酸乙酯
按照通用方案27制备。获得115mg，收率75.2％。
实施例38：2-(4-(4-(1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)-1H-吡唑-1-基)乙酸乙酯
按照通用方案27制备。获得56mg，收率76％。
实施例39：4′-(1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)-[1,1'-联苯基]-4-甲酸甲酯
按照通用方案27制备。获得66mg，收率87％。
实施例40：3-(4-(1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙酸乙酯
按照通用方案28制备。获得4.81g，收率73.2％。
实施例41：3-(4-(1-(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙酸
在0℃下向搅拌的3-(4-(1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙酸乙酯(17g，46.8mmol)在THF(200mL)和EtOH(100mL)中的溶液逐滴加入氢氧化钠(6.55g，164mmol)(溶于水(25mL)中)。反应混合物在40℃下搅拌5小时。通过UPLC监测反应状态。反应混合物在减压下浓缩，残留物用冷水稀释。水性部分用正己烷洗涤。然后分离各层，而水性部分用硫酸氢钾水溶液酸化。用DCM萃取水性部分，并在减压下将有机层浓缩为3-(4-(1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙酸的无色油(15g，40.2mmol，收率86％)。所获得的粗产物无需进一步纯化就进行下一步骤。
实施例42：3-(4-(1-(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丁基)苯基)丙酸乙酯
按照通用方案8制备。获得4.5g，收率100.0％。
实施例43：3-(4-(1-(2-氰基-N-甲基乙酰胺基)丁基)苯基)丙酸
按照通用方案9制备。获得3.4g，收率60.9％。
实施例44：(E)-3-(4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯基)丙酸
按照通用方案10制备。获得4.2g，收率89％。
实施例45：4-(吡咯烷-2-基)苯酚氢溴酸盐
按照通用方案4由市售的2-(4-甲氧基苯基)吡咯烷制备。获得184mg，收率66.8％。m/z＝164.3(M+H)
实施例46：4-(哌啶-2-基)苯酚氢溴酸盐
按照通用方案4由市售的2-(4-甲氧基苯基)哌啶制备。获得38.4mg，收率28.5％。m/z＝178.3(M+H)
实施例47：2-(4-羟基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照通用方案5由4-(吡咯烷-2-基)苯酚氢溴酸盐制备。获得142mg，收率71.5％。
实施例48：2-(4-羟基苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
按照通用方案5由4-(哌啶-2-基)苯酚氢溴酸盐制备。获得34.6mg，83.9％。
m/z＝222.2((M-t-Bu)+H)
实施例49：2-(4-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
按照通用方案6制备。获得155mg，收率82.3％。
实施例50：2-(4-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
按照通用方案6制备。获得34.7mg，收率76.8％。
m/z＝308.3((M-t-Bu)+H)
实施例51：2-(4-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基)苯氧基)乙酸
按照通用方案7制备。获得71.3mg，收率95％。m/z＝266.2((M-t-Bu)+H)
实施例52：2-(4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-2-基)苯氧基)乙酸
按照通用方案7制备。获得31.0mg，收率96.5％。m/z＝280.2((M-t-Bu)+H)
实施例53：6-羟基-3,4-二氢喹啉-1(2H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5由市售的1,2,3,4-四氢喹啉-6-醇制备。获得662mg，收率79.2％。
实施例54：6-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)-3,4-二氢喹啉-1(2H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案6制备。获得782mg，收率81.3％。
实施例55：2-((1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案33制备。获得489mg，收率95.0％。m/z＝208.2(M+H)
实施例56：2-((1-(2-氰基乙酰基)-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案9制备。获得174mg，收率68.2％。m/z＝275.2(M+H)
实施例57：(E)-2-((1-(2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰基)-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)氧基)乙酸
按照通用方案9制备。获得73mg，收率47.1％
实施例58：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)苯甲酰胺-盐酸盐
向(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)氨基甲酸叔丁酯(38.5mg，1.1当量，101μmol)在DMF(1mL)中的溶液加入在DMF(1mL)中的iBET726(40.0mg，1.0当量，92.0μmol)、HATU(35.0mg，1.0当量，92.0μmol)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(35.7mg，48.1μL，3.0当量，276μmol)。混合物在室温下搅拌15分钟。粗品在EtOAc中稀释并用水和盐水洗涤。通过快速色谱法(DCM/MeOH(0-15％))纯化而得到74mg所需产物的黄色油(定量收率)。
将该油溶于DCM(1mL)中，并用HCl(1.49g，1.00mL，4M，40当量，4.00mmol)处理，并将所得非均相混合物在室温下搅拌1h。反应混合物直接进行蒸发并在高真空下干燥，而获得所需产物的HCl盐无色固体(70mg，98％)，M/z＝697.7(M+H)
实施例A1：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-((E)-2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺
用在DMF(0.3mL)中的2-(4-(1-(2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙酸(2.76mg，1.0当量，7.17μmol)、HATU(5.45mg，2.0当量，14.3μmol)和在DMF(0.3mL)中的DIPEA(2.78mg，3.75μL，3.0当量，21.5μmol)处理制备化合物58(5.00mg，1.0当量，7.17μmol)在DMF中的溶液。混合物在室温下搅拌15分钟。用MeOH将粗混合物稀释至1mL，并使用制备HPLC(使用含有0.1％甲酸的水中的5％-95％乙腈梯度，10分钟内)直接纯化，而获得浅黄色蜡状产物A1(5.0mg，4.7μmol，65％)；m/z＝1064.4(M+H)
实施例A2：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-((E)-2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺
在试管中，将制备化合物58(8.0mg，1.1当量，11μmol)溶于100μL DMF中。加入15μLDIPEA并混合所述试管。将(E)-2-(4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯氧基)乙酸(4.0mg，1.0当量，10μmol)溶于DMF(0.3mL)中。加入15μL DIPEA，然后加入HATU(4.6mg，1.2当量，12μmol)。将其进行混合，并加入到装有胺溶液的试管中。振荡所述管并保持约1小时。LCMS显示起始材料的消耗和所需产物的生成。加入0.5mL MeOH，并在制备HPLC HPLC上纯化所述产物(使用含0.1％甲酸的水中的20％-95％乙腈梯度，10分钟内)，而获得纯化产品，2.7mg(26％收率)，m/z＝1079.0(M+H)
其他实施例：
实施例A4：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙酰胺基)丁基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺
将制备化合物A2(13.7mg，1.0当量，12.7μmol)在THF(1mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氢化钠(13.5mg，5.0当量，63.5μmol)处理，并在50℃下搅拌过夜。通过加入NH
实施例59：2-(4-(1-(4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯基)-1，21-二氧基-5，8，11，14，17-五氧杂-2，20-二氮杂二十二烷-22-基)氧基苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)苯甲酰胺HCl(20.5mg，280μL，0.1M，1.0当量，28.0μmol)在DMF(1mL)中的溶液依次用2-(4-(1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)苯氧基)乙酸(9.00mg，280μL，0.1M.，1.0当量，28.0μmol)、2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基异脲六氟磷酸盐(V)(10.6mg，1.0当量，28.0μmol)和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(10.9mg，14.6μL，3.0当量，84.0μmol)的溶液进行处理。混合物在室温下搅拌15分钟。LC-MS显示完全转化为具有预期质量的新产物。用CH
其他实施例：
实施例61：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-(2-氰基乙酰基)吡咯烷-2-基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺
向2-(4-((1-(4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)苯基)-1,21-二氧代-5,8,11,14,14,17-五氧杂-2,20-二氮杂二十二烷-22-基)氧基)苯基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(27mg，1.0当量，27μmol)在DCM(2mL)中的溶液加入HCl(4M，在二噁烷中，340μL，50当量，1.38mmol)。混合物在室温下搅拌1小时，然后蒸发至干。粗品溶于二噁烷(2mL)中，并用3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-3-氧代丙腈(4.9mg，1.1当量，30μmol)和三乙胺(11.4μL，3.0当量，82μmol)在90℃下搅拌2小时。观察到完全转化为新产物。在减压下蒸发掉挥发物，并通过快速色谱法(CH
其他实施例：
实施例A7：4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-((E)-2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰基)吡咯烷-2-基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧杂-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺
将4-((2S,4R)-1-乙酰基-4-((4-氯苯基)氨基)-2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-6-基)-N-(1-(4-(1-(2-氰基乙酰基)吡咯烷-2-基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18-五氧代-3-氮杂二十烷-20-基)苯甲酰胺(16.3mg，1.0当量，16.8μmol)在二噁烷(2mL)中的溶液用噻唑-2-甲醛(3.7μL，2.5当量，42.1μmol)和哌啶(1.66μL，1.0当量，16.8μmol)处理，并将该混合物加热至66℃长达72h。挥发物在减压下蒸除。通过反相HPLC纯化(在10min内使用在含0.1％甲酸的水中的5％-95％乙腈梯度)而得到所需产物(8mg，收率45％)。m/z＝1063.7(m+H)
其他实施例：
实施例66：4-((5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基-)噻唑-2-基)氨基甲酰基)-[1,4'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯
将SNS-032(60mg，1.0当量，0.16mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(47mg，1.5当量，0.24mmol)悬浮于DCM(1.5mL)中。加入四乙醇钛(72mg，66μL，2.0当量，0.32mmol)，并使所有悬浮固体进入溶液中。反应在室温下搅拌过夜。加入氰基硼氢化钠(20mg，2.0当量，0.32mmol)，并且该反应在室温下搅拌2小时。通过加入饱和NaHCO
其他实施例：
实施例A38：(E)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(2-((2-(2-氰基-3-(噻唑-2-基]丙烯酰基)-1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙酰基)哌啶-4-甲酰胺
用36b(1.0当量)、HATU(1.1当量)和DIPEA(2.5当量)在DMF中的溶液(0.1M)处理SNS032(1.0当量)在DMF中的溶液(0.1M)，反应混合物在室温下搅拌15min。用水猝灭反应并用EtOAc萃取。所合并的有机层用LiCl(5％)、水和盐水洗涤，用MgSO
该反应方案是关于THIQ类似物的示例，但也适用于N-烷基化类似物的合成。
其他实施例：
实施例A18：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1′-(2-(4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙酰胺基)丁基)苯氧基)乙酰基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺
将制备化合物A12(14mg，1.0当量，17μmol)溶于THF(0.2M)中。加入三乙酰氧基硼氢化钠(11mg，3.0当量，50μmol)，并且将反应在室温下搅拌5。再加入一部分三乙酰氧基硼氢化钠(11mg，3.0当量，50μmol)，并在室温下搅拌反应16小时。用水稀释反应并用CH
其他实施例：
实施例A30：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1′-(3-(4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基]丙酰胺基)丁基)苯基)丙酰基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺
由制备化合物A28按化合物A18所述进行制备，收率74％，m/z＝845.4(m+H)
实施例72：6-(2-氧代乙氧基)-1-丙基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案29制备。获得97.6mg，收率65.0％。m/z＝334.2(m+H)
其他实施例：
实施例77：6-(2-(4-((5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)乙氧基)-1-丙基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
将SNS032(55.9mg，1.0当量，147μmol)和72(49.0mg，1.0等量，147μmol)悬浮于THF(1.5mL)中并冷却至0℃。加入三乙酰氧基硼氢化钠(62.3mg，2.0当量，294μmol)，并使所有悬浮固体进入溶液中。反应物回温至室温并搅拌过夜。通过加入NaHCO
该反应方案已关于THIQ类似物(如第2.4节中概述的那些)进行了举例说明，但也适用于N-烷基化类似物的合成(如第2.3节中所示的那些)。
其他实施例：
实施例81：(1-(4-(2-(4-(5-(((叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基甲酰基)-[1,4'-联哌啶]-1'-基)-2-氧代乙氧基)苯基)丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案31偶联化合物66(49.0mg，1.0当量，91μmol)和化合物41(46.0mg，1.5当量，140μmol)。通过快速色谱法纯化产物，得到81。获得71.0mg，收率95％。m/z＝781.4(m+H)
实施例A32：(E)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1'-(3-(4-(1-(N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯基)丙酰基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺
将化合物81(25.0mg，1.0当量，32μmol)溶于CH
实施例86：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(2-((2-氰基乙酰基)-1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙基)哌啶-4-甲酰胺
将化合物77(76.7mg，1.0当量，110μmol)在CH
该反应方案已关于THIQ类似物(如第2.4节中概述的那些)进行了举例说明，但也适用于N-烷基化类似物的合成(如第2.3节中所示的那些)。
其他实施例：
实施例A35：(E)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(2-((2-(2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰基)-1-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氧基)乙基)哌啶-4-甲酰胺
用噻唑-2-甲醛(28mg，5.0当量，263μmol)和哌啶(105μL，2.0当量，105μmol)处理化合物86(35mg，1.0当量，52.6μmol)在THF中的溶液(0.1M)，并将混合物加热至66℃长达72小时。在减压下蒸发掉挥发物。通过快速色谱法纯化而得到A35(20.9mg，收率52.2％)。m/z＝760.3(m+H)
同样，尽管这些通用反应方案已经关于THIQ类似物进行了举例说明(如第2.6节中概述的那些)，但它也适用于N-烷基化类似物的合成(如2.5中所示的那些)。
其他实施例：
实施例A46：N-[5-[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基硫基]噻唑-2-基]-1-[2-[4-[4-[1-[[(E)-2-氰基-3-(1-甲基咪唑-2-基)丙-2-烯酰基]-甲基-氨基]丁基]苯基]吡唑-1-基]乙酰基]哌啶-4-甲酰胺
将实施例93(12mg，1.0当量，17μmol)在EtOH中的溶液(0.01M)用1-甲基-2-咪唑甲醛(3.7mg，2.0当量，34μmol)和哌啶(10μL，2.0当量，34μmol)处理，并将混合物在室温下搅拌18小时。在减压下蒸发掉挥发物。通过制备HPLC纯化(在10min内使用在含有0.1％甲酸的水中的5％-95％乙腈梯度)得到相应的产物(5.4mg，13.8％收率)。m/z＝810.3(m+H)
实施例94：5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-胺
在螺旋盖小瓶中，将SNS032(120mg，1当量，315μmol)溶于HCl(2.63mL，6mol)中，并在90℃下加热3小时。LCMS指示所需产物的生成(保留时间＝1.74分钟，M+H＝270)。将其用饱和NaHCO
实施例95：4-(((5-(5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
将化合物94(52mg，1当量，0.19mmol)和4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯(62mg，1.5当量，0.29mmol)悬浮于THF(2.5mL)中并冷却至0℃。加入三乙酰氧基硼氢化钠(82mg，2当量，0.39mmol)和乙醇钛(IV)(0.14g，0.12mL，65wt％，2当量，0.39mol)，并将反应保持搅拌4小时。再加入一部分三乙酰氧基硼氢化钠(82mg，2当量，0.39mmol)，搅拌1小时。LCMS指示所需产物的完全生成(保留时间＝3.25min，M+H＝467)。通过加入饱和NaHCO
实施例96：5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)-N-(哌啶-4-基甲基)噻唑-2-胺(盐酸盐)
将化合物95(90mg，1当量，0.19mmol)溶于DCM(2.5mL)中，加入在二噁烷中的HCl(0.35g，2.4mL，4mol，50当量，9.6mmol)，并将反应在室温下搅拌1小时。LCMS指示起始材料的消耗和所需产物的形成(保留时间＝0.31min，M+H＝367)。真空还原反应并真空并干燥过夜，得到黄色固体状的所需产物(85mg，0.19mmol，100％)。m/z＝367.2[m+H
实施例97：(1-(4-(3-(4-(((5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-基)丙基)苯基)丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
将化合物96(85mg，1当量，0.19mmol)和化合物76(0.11g，1.8当量，0.35mmol)溶于THF(3mL)中。加入三乙酰氧基硼氢化钠(82mg，2当量，0.39mmol)，将反应物搅拌4小时。LCMS指示所需产物的形成(保留时间＝3.08分钟，M+H＝670)。用水稀释反应物，并用DCM萃取三次。将所合并的有机萃取物在真空中还原并干载于二氧化硅上。通过快速色谱法(12g柱，0-20％在DCM中的MeOH)纯化反应，而获得黄色油状的所需产物(33mg，49μmol，25％)。m/z＝670.3[m+H
实施例98：5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)-N-((1-(3-(4-(1-(甲基氨基)丁基)苯基)丙基)哌啶-4-基)甲基]噻唑-2-胺(盐酸盐)
将化合物97(33mg，1当量，49μmol)溶于CH
实施例A39：3-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-(1-(4-(3-(4-(((5-(((5-叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-基)丙基)苯基)丁基)-2-氰基-N-甲基丙烯酰胺
将化合物98(32mg，1当量，50μmol)悬浮于1,4-二噁烷(3mL)中。加入3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-3-氧代丙腈(9.7mg，1.2当量，60μmol)和DIPEA(19mg，26μL，3当量，0.15mmol)，并将反应在90℃下加热4小时。LCMS指示酰化产物的形成(保留时间＝2.50分钟，M+H＝637)。真空还原反应并通过快速色谱法(4g柱，0-20％在DCM中的MeOH)纯化，得到A39(30mg，47μmol，95％)。将其溶解于THF(2.5mL)中，并转移到螺旋盖小瓶中。加入苯并[d]噻唑-2-甲醛(20mg，2.5当量，0.12mmol)和哌啶(2.1mg，2.5μL，0.5当量，25μmol)，盖上小瓶并在70℃下加热过夜。LCMS指示所需产物的形成(保留时间＝2.95分钟，M+H＝782—两峰以1:1的比率存在(E/Z异构体))。再加入苯并[d]噻唑-2-甲醛(20mg，2.5当量，0.12mmol)和哌啶(2.1mg，2.5μL，0.5当量，25μmol)，并将反应在70℃下加热过夜。LCMS指示起始材料完全消耗。将反应混合物在真空中还原并溶解于2mL MeOH中。通过制备HPLC纯化产物(由20％-95％在H
实施例99：N-(1-(3-溴苯基)丙-2-基)乙酰胺
按照通用方案34制备。获得809mg，收率49.9％，m/z＝256.2(m+H)
实施例100：6-溴-1,3-二甲基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案35制备。获得526mg，收率69.9％，m/z＝238.1(m+H)
实施例101：6-溴-1,3-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。获得460mg，收率86.7％，m/z＝240.1(m+H)
实施例102：6-溴-1,3-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5制备。获得486mg，收率74.6％，m/z＝284.2((m-tBu)+H)
实施例103：(E)-6-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)-1,3-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案27制备。获得313mg，收率60.9％，m/z＝304.3((m-tBu)+H)
实施例104：6-(3-乙氧基-3-氧代丙基)-1,3-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案28制备。获得311mg，收率98.5％，m/z＝362.4((M)+H)
实施例105：3-(2-(叔丁氧羰基)-1,3-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙酸
按照通用方案7制备。获得120mg，收率86.7％，m/z＝362.4((M)+H)
实施例106：3-(1,3-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙酸
按照通用方案8制备。获得70.1mg，收率72.1％，m/z＝234.2((M)+H)
实施例107：3-(2-(2-氰基乙酰基)-1,3-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙酸
按照通用方案9制备。获得70.1mg，收率72.1％，m/z＝301.3((M)+H)
实施例108：(E)-3-(2-(2-氰基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰基)-1,3-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙酸
按照通用方案10制备。获得35.7mg，收率43.2％，m/z＝396.3((M)+H)
实施例109：N-(2-溴苯乙基)乙酰胺
按照通用方案1制备。获得60g，收率99％，m/z＝242.1[m+H]
实施例110：5-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案35制备。获得25g，45％收率，m/z＝224.1[M+H]
实施例111：5-溴-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。获得14g，收率93％，m/z＝226.1[M+H]
实施例112：5-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5制备。获得15g，收率72％，m/z＝226.1[M-100+H]
实施例113：N-(3-溴苯乙基)乙酰胺
按照通用方案1制备。获得60g，收率95％，
实施例114：6-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案35制备。获得37g，收率64％，m/z＝224.0[M+H]
实施例115：6-溴-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。获得25g，收率75％，m/z＝226.1[M+H]
实施例116：6-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5制备。获得12g，收率92％，m/z＝226.1[M-100+H]
实施例117：N-(4-溴苯乙基)乙酰胺
按照通用方案1制备。获得60g，收率96％，m/z＝242.1[M+H]
实施例118：7-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉
按照通用方案35制备。获得45g，收率81％，m/z＝224.1[M+H]
实施例119：7-溴-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案3制备。
实施例120：7-溴-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案5制备。获得42g，收率92％，m/z＝226.1[M-100+H]
实施例121：6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)丙-1-炔-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
向搅拌的化合物116(5g，1.0当量，15.33mmol)和叔丁基二甲基(丙-2-炔-1-基氧基)硅烷(3.92g，1.5当量，22.99mmol)在DMF(50mL)中的溶液加入碘化铜(I)(0.876g，0.3当量，4.60mmol)、TEA(6.65mL，3.0当量，46.0mmol)，并用氮气将反应混合物脱气15分钟。将Pd(PPh
实施例122：6-(3-乙氧基-3-氧代丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
将化合物116(2.0g，1.0当量，6.13mmol)在THF(30毫升)中的溶液用氮气脱气10分钟，加入Pd(tBu
实施例123：3-(2-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙酸
按照通用方案7制备。获得2.3g，m/z＝220.1[M+H-100]
实施例124：6-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案31制备。获得的粗物料为2.4g，收率77％，m/z＝263.2[M+H-100]
实施例125：1-甲基-6-(3-氧代丙基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案32制备。获得0.53g的粗物料，收率64％，m/z＝204.2[M+H-100]
实施例126：(E)-7-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
室温下，向化合物120(7g，1.0当量，21.5mmol)在DMF(50mL)中的脱气溶液加入丙烯酸乙酯(4.57mL，2.0当量，42.9mmol)和三-邻-甲苯基膦(1.31g，0.2当量，4.29mmol)和K
LCMS m/z＝246.3[M+H-100]
实施例127：7-(3-乙氧基-3-氧丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
在0℃下，向搅拌的化合物126(5.7g，1.0当量，16.5mmol)在EtOH(50mL)中的溶液中加入NiCl
LCMS m/z：248.3(M+H-100)
实施例128：3-(2-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)丙酸
按照通用方案7制备。获得3.5g，m/z＝318.2[M-H]
实施例129：7-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案31制备。快速色谱法(0-50％在正己烷中的EtOAc)获得3.4g，收率86％，m/z＝263.2[M+H-100]
实施例130：1-甲基-7-(3-氧代丙基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸酯
按照通用方案32制备。获得0.78g的粗材料，收率99％，m/z 204.2[m+H-100]
实施例131：(E)-5-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
向化合物112(5.0g，1.0当量，15.33mmol)在DMF(50mL)中的经氮气脱气的搅拌溶液加入丙烯酸乙酯(3.07g，2.0当量，30.7mmol)和三邻-甲苯基膦(0.933g，0.2当量，3.07mmol)和K
实施例132：5-(3-乙氧基-3-氧代丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
在0℃下，向搅拌的131(2g，1.0当量，5.79mmol)在EtOH(25mL)中的溶液加入NiCl
LCMS m/z 248.3(M+H-100)
实施例133：3-(2-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-5-基)丙酸
按照通用方案7制备。获得1.0g，收率68％，m/z＝318.2[M-H]
实施例134：5-(3-(甲氧基(甲基)氨基)-3-氧代丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案31制备。快速色谱法(0-10％在DCM中的MeOH)获得1.0g，收率88％，m/z 263.2[M+H-100]
实施例135：1-甲基-5-(3-氧代丙基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案32制备。获得粗材料0.34g，收率94％，m/z 204.2[M+H-100]
实施例136：5-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备。获得370mg，收率76％，LCMS m/z＝631[M+H-100]。
实施例137：5-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案8制备。获得310mg，收率86％，LCMS m/z＝531.3[M+H]
实施例138：3-(5-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3-氧代丙腈
按照通用方案9制备。获得330mg，收率65％，LCMS m/z＝598.2[M+H]
实施例A53：(Z/E)-2-(5-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-3-(噻唑-2-基)丙烯腈
按照通用方案10制备。获得40mg，收率13.8％，LCMS m/z＝691.2[M+H]
实施例139：6-(3-(4-((5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备。获得0.80g，收率32％，LCMS m/z＝668[M+H]
实施例140：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案8制备。获得0.70g，收率95％，LCMS m/z＝568[M+H]
实施例141：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(2-(2-氰基乙酰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案9制备。获得0.70g，收率90％，LCMS m/z＝635.6[M+H]
实施例A54：(E/Z)-N-(5-(((5-(N-丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(2-(2-氰基-4-甲基-4-吗啉戊-2-烯酰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案10制备。获得118mg，收率27.5％，LCMS m/z＝775[M+H]
实施例A55：(E/Z)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(2-(2-氰基-4,4-二甲基-5-吗啉戊-2-烯酰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案10制备。获得18mg，收率4.7％，LCMS m/z＝788[M+H]
实施例142：6-(3-羟基丙-1-炔-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
向化合物121(2.2g，1.0当量，5.29mmol)在THF(10mL)中的混合物加入TBAF(26.5mL，5.0当量，26.5mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。用水稀释反应混合物，并用EtOAc萃取。干燥(Na
实施例143：6-(3-溴丙基-1-炔-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
在室温和氮气下，向搅拌的化合物142(0.2g，1当量，0.664mmol)在DCM(10mL)中的溶液加入三苯基膦(0.226g，1.3当量，0.863mmol)和CBr
实施例144：6-(3-(4-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)丙-1-炔-1-基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案30制备。获得190mg，收率59.7％，m/z＝664.8[M+H]
实施例145：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙-2-炔-1-基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案8制备。获得150mg，收率98％，m/z＝564.8[M+H]
实施例146：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(2-(2-氰基乙酰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙-2-炔-1-基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案9制备。获得155mg，收率84％，m/z＝631.4[M+H]
实施例A56：(E)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1-(3-(2-(2-氰基-3-(4,5,6,7-四氢苯并[d]噻唑-2-基]丙烯酰基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)丙-2-炔-1-基)哌啶-4-甲酰胺
按照通用方案10在EtOH中制备。通过反相制备HPLC获得6mg，收率9％，LCMS m/z＝780.4[M+H]
实施例147：((4-溴苯基)(环丙基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
在室温下向(4-溴苯基)(环丙基)甲酮(15.0g，1当量，66.6mmol)和甲胺(2M，在THF中)(100mL，3当量，200mmol)的搅拌溶液加入异丙醇钛(IV)(26.3mL，1.3当量，87mmol)。在0℃下加入NaBH
LCMS：实测质量；[M+H]
实施例148：(环丙基(4-乙烯基苯基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
向化合物147(16.0g，1当量，47mmol)、乙烯基三氟硼酸钾(18.9克，3.0当量，141mmol)和Cs
实施例149：(环丙基(4-甲酰基苯基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃下，向化合物148(11.0g，1.0当量，38.3mmol)在1,4-二噁烷(300mL)和水(30mL)中的溶液加入高碘酸钠(16.4g，2.0当量，77mmol)和N-甲基吗啉(1.94g，0.5当量，19.14mmol)，然后缓慢加入四氧化锇(30.0mL，0.1当量，3.83mmol)。反应混合物在室温下搅拌16小时，然后真空浓缩。将粗残留物用水:EtOAc(1:1)稀释，过滤并用EtOAc萃取。干燥(Na
实施例150：(环丙基(4-((4-羟基哌啶-1-基)甲基)苯基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备。获得3.0g，收率55％，m/z＝375.4[M+H]
实施例151：(环丙基(4-((4-氧代哌啶-1-基)甲基)苯基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯
在-78℃下，向搅拌的草酰氯(0.11mL，1.2当量，1.28mmol)在DCM(10mL)中的溶液加入DMSO(0.19mL，2.1当量，2.67mmol)，并搅拌反应10分钟。向该混合物中加入在DCM(10mL)中的化合物150(0.40g，1.0当量，1.07mmol)，并且反应混合物在-78℃下搅拌30min。反应混合物用Et
LCMS m/z＝[M+H]
实施例152：((4-((4-(((5-(((5-叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-[1,4'-联哌啶]-1'-基)甲基]苯基)(环丙基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备。获得180mg，收率91％，m/z＝723.6[M+H]
实施例153：5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)-N-((1'-(4-(环丙基(甲基氨基)甲基)苄基)-[1,4'-联哌啶]-4-基)甲基]噻唑-2-胺
按照通用方案8制备。获得130mg，收率89％，m/z＝623.6[M+H]
实施例154：N-((4-((4-(((5-(((5-叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-[1,4'-联哌啶]-1'-基)甲基]苯基)(环丙基)甲基)-2-氰基-N-甲基乙酰胺
按照通用方案9制备。获得120mg，收率79％，m/z＝690.4[M+H]
实施例A57：(E/Z)-N-((4-((4-(((5-(((5-叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基)甲基)-[1,4'-联哌啶]-1'-基)甲基]苯基)(环丙基)甲基)-2-氰基-N-甲基-3-苯基丙烯酰胺
按照通用方案10在THF中制备。通过反相制备HPLC获得，11mg，收率16％，LCMS m/z＝778.5[M+H]
实施例155：((4-((4-((5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)氨基甲酰基)-[1,4'-联哌啶]-1'-基)甲基)苯基)(环丙基)甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备。获得180mg，收率91％，m/z＝737.6[M+H]
实施例156：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1'-(4-(环丙基(甲基氨基)甲基)苄基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺盐酸盐
按照通用方案8制备。获得140mg，收率79％，m/z＝637.6[M+H]
实施例157：N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1'-(4-((2-氰基-N-甲基乙酰胺基)(环丙基)甲基)苄基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺
按照通用方案9制备。获得120mg，收率62％，m/z＝704.2[M+H]
实施例A58：(E/Z)-N-(5-(((5-(叔丁基)噁唑-2-基)甲基)硫基)噻唑-2-基)-1'-(4-((2-氰基-N-甲基-3-苯基丙烯酰胺基)(环丙基)甲基)苄基)-[1,4'-联哌啶]-4-甲酰胺
按照通用方案10在EtOH中制备。通过反相制备HPLC获得9.6mg，收率14％，LCMS m/z＝792.5[M+H]；
实施例158：7-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备(使用WO2014139328中制备的胺，该专利的全部内容通过引用结合于本文中)。获得500mg，收率63.5％，m/z＝631.3[M+H-100]
实施例159：7-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉
按照通用方案8制备。获得500mg，收率81％，m/z＝531.3[M+H]
实施例160：3-(7-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-3-氧代丙腈
按照通用方案10制备。获得370mg，收率52％，m/z＝598.2[M+H]
实施例A59：(E/Z)-2-(7-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-羰基)-3-(噻唑-2-基)丙烯腈
按照通用方案10在EtOH中制备。通过反相制备HPLC获得47mg，收率11％，LCMS m/z＝693.2[M+H]
实施例161：(1-(4-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)苯基)丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案26制备(使用WO2014139328中制备的胺，该专利的全部内容通过引用结合于本文中)。获得1.4g，收率53.4％，m/z＝647.4[M+H]
实施例162：1-(4-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)苯基)-N-甲基丁-1-胺
按照通用方案8制备。获得0.91g，收率98％，m/z＝547.4[M+H]
实施例163：2-氰基-N-(1-(4-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)苯基)丁基)-N-甲基乙酰胺
按照通用方案10制备。获得850mg，收率35.5％，m/z＝614.4[M+H]
实施例A60：(E/Z)-2-氰基-N-(1-(4-(3-(4-(5-氟-4-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基)哌啶-1-基)丙基)苯基)丁基)-N-甲基-3-(噻吩-2-基)丙烯酰胺
按照通用方案10在EtOH中制备。通过反相制备型HPLC获得，45mg，收率13％，LCMSm/z＝708.2[M+H]
实施例164：[5-[4-[2-氟-5-[(4-氧代-3H-酞嗪-1-基)甲基]苯甲酰基]哌嗪-1-基]-5-氧代-戊基]氯化铵
将4-(4-氟-3-(哌嗪-1-羰基)苄基)酞嗪-1(2H)-酮盐酸盐(1.00当量，61mg，0.153mmol)和5-(Boc-氨基)戊酸(1.00当量，33mg，0.153mmol)悬浮于DMF(0.6mL)中。加入HATU(1.00当量，58mg，0.153mmol)，然后加入N,N-二异丙基乙胺(5.00当量，0.13mL，0.765mmol)。使反应混合物反应1小时，用ACN/H
其他实施例：
实施例A61：(E)-2-氰基-N-(1-(4-(3-((5-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)丁基)-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺
向化合物164(0.05M，在DMF中，0.50mL，0.0252mmol)加入在DMF(0.5mL)中的化合物44(1.00当量，10mg，0.0252mmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.00当量，0.022mL，0.126mmol)，然后加入HATU(1.00当量，9.6mg，0.025mmol)。反应物在室温下搅拌2小时，然后用MeOH稀释，并通过制备HPLC使用ACN在含有0.1％甲酸的水中的5％-95％梯度进行纯化，而获得所需产物(m/z＝845.35，(M+H
其他实施例：
实施例167：(S)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((S)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)-5,6,7-8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向2-三甲基甲硅烷基(2S)-2-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸酯(1.69g，2当量，6.88mmol)在THF(10mL)中的溶液加入叔丁醇钠(661mg，2当量，6.88mmol)，接着逐份加入(2S)-4-[7-(8-氯-1-萘基)-2-甲基亚磺酰基-6,8-二氢-5H-吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基]-2-(氰基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2g，1当量，3.44mmol，如WO2019/99524中所述制备，该专利全部内容通过引用结合于本文中)。反应混合物在室温下搅拌16小时，然后用水猝灭并用EtOAc萃取。所合并的有机相用盐水洗涤，用MgSO
m/z＝762.8(M+H)
实施例168：(S)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((S)-吡咯烷-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-氰基甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向化合物167(2.11g，1当量，2.77mmol)在THF(10mL)中的溶液加入TBAF(1M，在THF中)(3.6mL，1.3当量，3.60mmol)，并在室温下搅拌反应16小时。加入额外的TBAF(6.0mL，2.2当量，6.0mmol)并在室温下搅拌反应4小时。反应物在DCM中稀释并用饱和NH
为了分析目的，粗品样品通过制备HPLC使用乙腈在水中(含有0.1％甲酸)的5％-95％梯度进行纯化。
NMR：
m/z＝618.7(M+H)
实施例169：2-(三甲基甲硅烷基)乙基(4-羟基丁基)氨基甲酸酯
向4-氨基-1-丁醇(1.0mL，1当量，11.2mmol)和三乙胺(2.0mL，1.3当量，14.6mmol)在DCM(40mL)中的溶液中逐份加入(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-三甲基甲硅烷基丙酸酯(3.0g，1.1当量，12.3mmol)。反应用饱和NH
实施例170：2-(三甲基甲硅烷基)乙基(4-氧代丁基)氨基甲酸酯
在-78℃下向二甲基亚砜(0.11mL，2.5当量，1.5mmol)在DCM(2.5mL)的溶液滴加入草酰氯(0.6mL，2当量，1.2mmol)。混合物搅拌20分钟，并在-78℃下滴加化合物169(140mg，1当量，0.6mmol)在DCM(3.0mL)中的溶液。混合物再搅拌45分钟。滴加DIPEA(0.82mL，8当量，4.8mmol)，并将混合物在0℃下加热并再搅拌2小时。用水(10mL)猝灭混合物，并用DCM萃取水相。在减压下除去溶剂，而以定量收率获得产物。
NMR：
m/z＝254.2(M+Na)
实施例171：(S)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((S)-1-(4-(((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)羰基)氨基)丁基)吡咯烷-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)-2-(氰基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下向化合物170(40mg，1当量，0.065mol)在DCM(0.5mL)中的溶液加入2-三甲基甲硅烷基乙基N-(4-氧代丁基)氨基甲酸酯(30mg，2.00当量，0.129mmol)的溶液。混合物搅拌20分钟，并加入三乙酰氧基硼氢化钠(34mg，2.5当量，0.162mmol)，并将混合物在室温下再搅拌2小时。
用水猝灭反应并溶解于DCM中。有机相用水洗涤，干燥有机相并在减压下蒸发。粗产物通过HPLC纯化(使用10min内乙腈在含0.1％甲酸的水中的5％-95％梯度)，而获得淡黄色固体的纯产物(42mg，0.050mmol，收率78％)。
NMR：
m/z＝833.9(M+H)
实施例172：(2S)-4-(7-(8-氯萘-1-基)-2-(((2S)-1-(4-(3-(4-(1-((E)-2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯基)丙酰胺基)丁基)吡咯烷-2-基)甲氧基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基]-2-(氰基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向化合物171(50mg，1当量，0.06mmol)在DMF(1mL)中的溶液加入TBAF(1M，在THF中)(0.12mL，2当量，0.12mmol)，并在室温下搅拌反应2小时。HPLC分析显示完全脱保护。反应在DCM中稀释，并用饱和NaHCO
m/z＝1069.2(M+H)
实施例173：(E)-N-(1-(4-(3-(4-((S)-2-(((7-(8-氯萘-1-基)-4-((S)-3-(氰基甲基)哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)丁基)氨基)-3-氧代丙基)苯基)丁基)-2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺(盐酸盐)
向172(55mg，1当量，0.05mmol)在DCM(0.2mL)中的溶液加入HCl(4M，在二噁烷中)(0.2mL，15.5当量，0.8mmol)。反应在室温下搅拌1小时，然后在真空中除去挥发物，而得到棕褐色固体的所需产物173(25mg，0.02mmol，收率46.6％)。
m/z＝969.1(M+H)
实施例A64：(E)-N-[1-[4-[3-[4-[(2S)-2-[[7-(8-氯-1-萘基)-4-[(3S)-3-(氰基甲基)-4-丙-2-烯酰基-哌嗪-1-基]-6,8-二氢-5H-吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-基]氧甲基]吡咯烷-1-基]丁基氨基]-3-氧代-丙基]苯基]丁基]-2-氰基-N-甲基-3-噻唑-2-基-丙-2-烯酰胺
向化合物173(12mg，1当量，0.01mmol)和三乙胺(8.3μL，5当量，0.06mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液加入丙-2-烯酰氯(2.7μL，3当量，0.04mmol)。反应混合物在室温下搅拌30min，然后真空浓缩。通过制备HPLC纯化(使用10min内乙腈在含有0.1％甲酸的水中的5％-95％梯度)而得到白色固体的纯化产物A64(1.7mg，0.002mmol，收率13.3％)
m/z＝1023.2(M+H)
实施例174：(1-(4-(3-(4-(2,6-二甲氧基-4-(2-甲基-1-氧代-1,2-二氢-2,7-萘啶-4-基)苄基)哌嗪-1-基)丙基)苯基)丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
使用根据J.Med.Chem.2019，62，2，699-726合成的胺根据通用方案26制备。获得72mg，收率66％，LCMS m/z＝698.9[M+H]
实施例175：4-(3,5-二甲氧基-4-((4-(3-(4-(1-(甲基氨基)丁基)苯基)丙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-2-甲基-2,7-萘啶-1(2H)-酮
按照通用方案8制备。无需进一步纯化进行使用。LCMS m/z＝598.7[M+H]
实施例176：2-氰基-N-(1-(4-(3-(4-(2,6-二甲氧基-4-(2-甲基-1-氧代-1,2-二氢-2,7-萘啶-4-基)苄基)哌嗪-1-基)丙基)苯基)丁基)-N-甲基乙酰胺
按照通用方案9制备。获得12mg，收率17％(在2个步骤内)。LCMS m/z＝665.8(M+H)
实施例A65：(E)-2-氰基-N-(1-(4-(3-(4-(2,6-二甲氧基-4-(2-甲基-1-氧代-1,2-二氢-2,7-萘啶-4-基)苄基)哌嗪-1-基)丙基)苯基)丁基)-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺
按照通用方案10制备。获得7mg，收率50％。LCMS m/z＝760.9[M+H]
实施例A66：(E)-2-氰基-N-(1-(4-(3-(4-(2,6-二甲氧基-4-(2-甲基-1-氧代-1,2-二氢-2,7-萘啶-4-基)苄基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)苯基)丁基)-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺
使用根据J.Med.Chem.2019，62，2，699-726合成的胺根据通用方案31制备。获得12mg，收率45％，LCMS m/z 774.8[M+H]
实施例177：1-异丙基-6-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酸酯
向搅拌的6-氯-1-异丙基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯(根据WO2014210354制备，该专利全部内容通过引用结合于本文中)(3g，1.0当量，11.83mmol)和2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-胺(根据WO20140210354制备，该专利全部内容通过引用结合于本文中)(2.96g，1.2当量，14.19mmol)在1,4-二噁烷(30mL)中的溶液加入Cs
LCMS m/z＝426.0[M+H]
实施例178：1-异丙基-6-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酸
按照通用方案7在THF、MeOH和H
实施例179：(3-(4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸酯
按照通用方案5在丙酮中制备。通过反相制备HPLC获得，800mg，收率24％，LCMS m/z＝301.2[M+H]
实施例180：(3-(4-(3-(1-异丙基-6-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酰胺基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯
按照通用方案31制备。获得120mg，收率62.6％，LCMS m/z＝694.7[M+H]
实施例181：N-(3-(4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1-异丙基-6-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酰胺盐酸盐
按照通用方案8制备。获得100mg，收率85％，LCMS m/z＝594.7[M+H]
实施例A67：(E)-N-(3-(4-(3-(-4-(1-(2-氰基-N-甲基-3-(噻唑-2-基)丙烯酰胺基)丁基)苯基)丙酰胺基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1-异丙基-6-((2-(4-甲氧基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)氨基)-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-甲酰胺
按照通用方案31制备。通过制备HPLC纯化。获得45mg，收率28.1％，LCMS m/z＝973.7[M+H]
B部分—生物学数据
根据以下通用方案分析测定双功能化合物而研究其降解靶蛋白的能力。
1.1分析测试1—HEK293中HiBit-BRD4的降解
将含BRD4的HiBit插入物的HEK293以每孔井8×10
1.2分析测试2—MV4；11中的CDK9降解
将MV4；11(0.8×10
1.3分析测试3—使用CellTiter-Glo分析测试的MV4；11细胞活力
使用CellTiter-Glo分析测试法(Promega)测量代表性化合物的抗增殖作用。MV4；11细胞以在IMDM培养基中的2倍浓度和25μL体积接种于无菌白色透明底384-孔井细胞培养微孔板(Greiner Bio-one)中。将受试化合物在IMDM培养基中连续稀释(从1μM的11-pt剂量响应)至2倍浓度，然后加入细胞中，而使最终体积达到50μL。最终DMSO浓度为0.05％。培养48小时后，向每个孔井中加入25μL CellTiter-Glo试剂。培养15分钟后，在CLARIOStarPlus上读取发光信号。使用Prism 8(Graphpad)处理数据并生成剂量-反应曲线。
1.4分析测试4—使用HiBit-CDK9的终点降解
将HiBit-CDK9 HEK293细胞在含有4％ FBS的OptiMEM培养基中稀释至2.2×10
1.5分析测试5—通过免疫印迹法的BRD9降解
将HEK293细胞(0.4×10
1.6分析测试6—通过免疫印迹法的KRas-G12C降解
将MIA-PaCa-2细胞接种于6-孔或12-孔孔板中过夜之后用所需浓度的受试化合物(DMSO终浓度0.1％)处理24小时。培养24小时后，用PBS洗涤细胞，并用补充有1mM MgCl
1.7分析测试7—通过毛细管电泳的PARP1降解
将HCC1937细胞(50万个细胞/孔)接种于24-孔孔板中过夜之后用所需浓度的测试化合物(DMSO终浓度0.2％)处理24小时。培养24小时后，用PBS洗涤细胞，并用含有1×cOmplete Mini-无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Sigma)裂解细胞。通过离心(10000rpm，10分钟，4℃)澄清裂解物，并使用BCA分析测试法定量上清液的总蛋白质含量。使用标准WES(Simple Western)方案(ProteinSimple)进行毛细管-基免疫分析。以1.5μg/孔总蛋白质将裂解物载于WES孔板上。使用以下抗体和抗体浓度：抗-PARP(CST#9532，1:250稀释液)、抗-微管蛋白(CST#2125，1:250稀释液)、次级抗-兔(CST#7074S，1:500稀释液)。数据由WES Compass软件生成为化学发光计数，并呈现为电泳图，化学发光峰面积值用于所有计算。将目标蛋白的量标准化于负载对照，并报告为平均0.1％ DMSO载体强度的％。使用Prism(Graphpad，版本8)绘制并分析降解数据。
1.8分析测试8—通过免疫印迹法的突变EGFR降解
NCI-H1975(1.5×10
实施例1
根据分析测试3中概述的方案评价化合物A1、A2、A8和A9对MV4；11细胞的细胞活力的影响。IC
表1显示了化合物A1、A2、A8和A9的IC
令人惊讶的是，据观察，对(如A2、A8和A9中所存在的)弹头上的酰胺基的改性会对双功能分子的抗增殖活性(细胞效力)方面提供显著的改善，这如它们显著较低的IC
这些化合物增强的细胞效力已被证明与显著改善的BET降解，特别是较低的DC
实施例2-A2在癌症细胞小组中的疗效
OncoLead GmbH&Co.KG提供了癌症细胞小组筛查服务。在48小时的延迟期后，用六种不同浓度(10
值>0表示其中A2的BET降解由于催化活性而显示出比抑制剂I-BET726更大的功效的细胞系，而值<0表示其中BET降解剂A2不如I-BET726的BET抑制有效的细胞系。在无法测定特定GI
结果如图2所示，并表明A2对多种肿瘤细胞系表现出广泛的疗效。
先前对CRBN PROTAC(dBET6)和VHL PROTAC(MZ1)进行了类似的研究(例如，参见Ottis et al，ACS Chem.Biol.2019，14，2215-2223，在相同的分析测试条件下)。这些结果的比较如下表2所示。
表2显示了CRBN(dBET6)、VHL(MZ1)和A2的GI
数据表明，与CRBN PROTAC降解剂(dBET6)和VHL PROTAC降解剂(MZ1)相比，A2在整个测试的肿瘤细胞系中显示出更宽范围的功效。
然后研究进一步的N-烷基化弹头，以确定它们在两个测试系统中促进选择性蛋白质降解的能力(一个测试系统的靶蛋白是BRD4，另一个测试体系的靶蛋白是激酶CDK9)。
实施例3a-BRD4降解
以下化合物的靶蛋白BRD4的降解根据分析测试1中概述的方案进行测定。
表3显示了根据分析测试1中概述的方案分析的双功能分子。
据发现，化合物A2-A5和A7-A9的DC
实施例4
以下化合物的靶蛋白CDK9降解根据分析测试2中概述的方案进行测定。
表4显示了根据分析测试2中概述的方案分析的双功能分子，具体而言测定用100nM双功能分子处理8小时后的残余CDK9丰度。
在所有情况下，用100nM的双功能分子处理8小时后，发现残余CDK9丰度小于70％。因此，所有上述双功能分子都被认为是有效的降解剂。
实施例5
以下化合物的靶蛋白CDK9降解根据分析测试4中概述的方案进行测定。
据发现，表5中化合物的DC
实施例6
使用以下方案评价化合物在啮齿类动物口服给药后验证体内全身药物暴露的能力：
通过经口灌胃(口服，10mL/kg，5％ DMSO+95％(15％ HP-β-CD，在水中)载体，口服给药腿)或尾静脉注射(静脉注射，5mL/kg，5％ DMSO+90％(15％ HP-β-CD，在水中)载体，静脉给药腿)，以所指示的剂量水平向C57BL/6小鼠(6-8周，18-20g，雌性，N＝6，购自JHLaboratory Animal Co.，自由取食物和水)给药测试化合物。在指定的时间点手动约束动物，高达24小时，通过面部静脉将约110μL的血样收集于K2EDTA管中。将血液样品置于冰上并以2000g离心5分钟，而在15分钟内获得血浆样品，在样品制备和HPLC洗脱后，在LC-MS/MS-19(Triple Quad 5500)上以正离子ESI模式对血浆样品进行分析：
流动相：
流动相A：H
流动相B：MeOH-0.025％ FA-1mM NH
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm 1.7μm
流速：0.60mL/min
柱温度：60℃
实施例A37显示了静脉注射1mg/kg剂量后的AUC
实施例7
使用以下方案评价各化合物在啮齿类动物全身给药后验证在大脑中的体内药物暴露的能力：
通过尾静脉注射(静脉注射，5mL/kg，5％DMSO+95％(15％ HP-β-CD，在水中)载体)以所指示的剂量水平向C57BL/6小鼠(6-8周，18-20g，雌性，N＝6，购自JH LaboratoryAnimal Co.，自由取食物和水)给药测试化合物。
血液采集：在指定的时间点手动约束动物，高达24小时，通过面部静脉将约110μL的血液样品采集于K2EDTA管中。将血样置于冰上，以2000g离心5分钟(4℃)，而在15分钟内获得血浆样品。
大脑采集：在CO
流动相：
流动相A：H
流动相B：MeOH-0.025％ FA–1mM NH
色谱柱：水BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)
流速：0.60mL/min
柱温度：60℃
实施例A39显示了静脉注射5mg/kg剂量后的血浆AUC
这种高水平的脑暴露与许多其他类型的双功能降解剂如通常不允许CNS(中枢神经系统)渗透的CRBN和VHL PROTAC形成鲜明对比。
实施例8
以下化合物的靶蛋白PARP1降解根据分析测试7中概述的方案进行测定：A61、A62、A63。
在所有情况下，据发现，用100nM双功能分子处理24小时后的残余PARP1丰度小于50％。因此，所有上述双功能分子都被认为是有效的降解剂。
实施例9
化合物A64的靶蛋白突变体KRas(G12C)降解根据分析测试8中概述的方案进行测定。
用1000nM的双功能分子处理24小时后，据发现，残余KRas(G12C)丰度小于50％。因此，该双功能分子被认为是一种有效的降解剂。
实施例10
化合物A65、A66的靶蛋白BRD9降解根据分析测试5中概述的方案进行测定。
用100nM的双功能分子处理24小时后，据发现，残留BRD9丰度小于50％。因此，以上双功能分子被认为是有效的降解剂。
实施例11
化合物A67的靶蛋白突变体EGFR(L858R)降解根据分析测试8中概述的方案进行测定。
用1000nM的双功能分子处理24小时后，据发现残余EGFR(L858R)丰度小于50％。因此，该双功能分子被认为是一种有效的降解剂。
- 靶向循环蛋白质的选择性降解的双功能小分子
- 一种靶向降解EGFR突变体的双功能分子及其制备方法与应用