一种慢病毒质粒载体及稳定表达tRNA2_LeuTAA的细胞系的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒质粒载体及稳定表达tRNA2_LeuTAA的细胞系的制备方法与应用。

背景技术

目前的医学或者生物学研究中，研究人员已经实现通过人工设计和改造，合成大量自然界不存在或未发现的生物元件、生物装置及生物系统，为探索细胞内基因调控机制提供了有效的工具。

tRNA是一种典型的非编码RNA，长度约为60-90个核苷酸。成熟tRNA具有典型的三叶草型二级机构，由接收臂、D环、反密码环、可变臂和TΨC环构成。在细胞内tRNA通过反密码子依次识别mRNA密码子，将氨基酸递呈至延伸中的肽链。以往研究中仅认为tRNA是普遍表达的管家分子，但随着研究深入，发现tRNA具有组织、细胞特异的表达模式。tRNA异常表达可能导致疾病的发生发展，包括神经类疾病和肿瘤。在肿瘤中，tRNA可通过密码子偏好性调控RNA稳定型和翻译而调控肿瘤细胞的生物学行为；或与细胞色素C结合调控凋亡过程；或激活蛋白翻译等。但是tRNA是否具有其它调控机制尚需探索。

tRNA2_LeuTAA来源于线粒体基因，长度为78nt，文献报道及生物信息学分析发现其5’具有生成tsRNA潜能。tRNA2_LeuTAA在前列腺组织中表达明显上调，但其在前列腺癌中的具体生物学功能及作用机制尚未有报道。本发明着手构建稳定过表达tRNA2_LeuTAA的前列腺癌细胞株，为探索tRNA2.Leu在前列腺癌细胞中高表达的生物学作用以及在前列腺发生发展中的作用机制奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种慢病毒质粒载体及稳定表达tRNA2_LeuTAA的细胞系的制备方法与应用。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种慢病毒质粒载体，所述慢病毒质粒载体用于编码tRNA2_LeuTAA，所慢病毒质粒载体由骨架载体PLVX-Puro和插入克隆位点xhoⅠ和BamHⅠ之间的序列组成，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种慢病毒转移载体，所述慢病毒转移载体的元件包括CMV增强子、CMV启动子、酶切位点、PKG启动子和Puro抗性位点。

本发明还提供一种慢病毒，所述慢病毒携载上述的慢病毒转移载体，所述慢病毒由慢病毒包装质粒及上述的慢病毒转移载体转染细胞后分离后获得。

进一步地，所述慢病毒包装质粒由psPAX2和addgene编号为12259的pMD2.G组成。

本发明还提供一种表达tRNA2_LeuTAA的细胞系，由上述的慢病毒转染所述细胞后得到表达tRNA2_LeuTAA的细胞系。

进一步地，所述细胞是真核细胞。

进一步地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

进一步地，所述哺乳动物细胞为PC-3细胞。

本发明还提供一种制备上述细胞系的方法，包括以下步骤：

1)以PC-3细胞gDNA为模板，PCR扩增含酶切位点xhoⅠ和BamHⅠ的tRNA2_LeuTAA全长及侧翼序列；将tRNA2_LeuTAA全长及侧翼序列克隆至T载体，并行DNA测序；酶切拼接克隆至载体PLVX-Puro，并行DNA测序；

2)将序列正确的PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA及包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞48h及72h后，收集并过滤上清，得到PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA慢病毒；

3)将病毒液感染的PC-3细胞培养并Puro抗性筛选3代后PCR鉴定阳性即为所获得的表达tRNA2_LeuTAA的细胞，保种。

本发明还提供上述的细胞系在探索tRNA2_LeuTAA对前列腺癌细胞的生物学行为影响及分子机制研究中的应用。

以下为本发明涉及的序列：

SEQ ID No.1(PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA)：

actactaagtttgtagtacatatttaacaaatacaatttctttaaaaactactaagtttgtagtacatatttaacaaatacaatttctttaaaatgaaaataattcagaggaatcacaggtttagagtaaatgaaaccacaggtaattggcagtggtaatagggtatggggtgggaagtttgggatgattttggttagcttgagttatccagttgatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttgatctcccgatccgtcgacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctctagctagaggtcgacggtaaacgctagcaatgtcaaggcctctcactctctgatattcatttctttgcaagttataaatactgaataataagatgacatgaactactactgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactacttgaagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagcagtgggttccctagttagccagagagctcccaggctcagatctggAAGGGTTCGTTTGTTCAATGATTAAAGTCCTACCTGATCTGAGGTCAGACTGGAGTAATCCAGTTTGGTTTCTATCTATTTAACATTTCTCCTAGTACAAAAGGACAAAATAGGGCCCACTTCATAAAGCACCCTCGCCTCATAAATGATGCTATCTCAATCTAACAAACCATCACACACCCTACCCAGGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGAGCCTGGTAATTGCATAAAACTTAAAATTTTATAATCAGAGGTTCAACTCCTCTTCTTAACAATATGGCTATAATTAACCTTCTCCTACTTATTATCCCCACTCTTATTGCTATAGCATTCCTTACACTCATCGAATGAAAAATCTTAGGCTATACACAACTATGCAAAGGACCCAAAATTGTAGGTCCCTATGGGCTGCTTCAGCCATggatctgagggctcgccactccccagtcccgcccaggccacgcctccctggaaagtccccagcggaaagtcccttgtagcaagctcgatatcagcagttcttgaagtactccggatgcagctctcgggccacgtgatgaaatgctaggcggctgtcaaacctccactctaacacttctctctccgggtcatccatcccatgcaggctcacagggtgtaacaagctggtgttctctcctttattggcctcttctaccttatctggctcaactggtactagcttgtagcaccatccaaaggtcagtggatatctgacccctggccctggtgtgtagttctgctaatcagggaagtagccttgtgtgtggtagatccacagatcaaggatatcttgtcttcgttgggagtgaattagcccttccagtcccctcttttcttttaaaaagtggctaagatctacagctgccttgtaagtcattggtcttaaaggtacctgaggtgtgactggaaaacccacctcctcctcctcttgtgcttctagccaggcacaatcagcattggtagctgctgtattgctacttgtgattgctccatgtttttctaggtctcgactgcagaattaattccaggcggggaggcggcccaaagggagatccgactcgtctgagggcgaaggcgaagacgcggaagaggccgcagagccggcagcaggccgcgggaaggaaggtccgctggattgagggccgaagggacgtagcagaaggacgtcccgcgcagaatccaggtggcaacacaggcgagcagccatggaaaggacgtcagcttccccgacaacaccacggaattgtcagtgcccaacagccgagcccctgtccagcagcgggcaaggcaggcggcgatgagttccgccgtggcaatagggagggggaaagcgaaagtcccggaaaggagctgacaggtggtggcaatgccccaaccagtgggggttgcgtcagcaaacacagtgcacaccacgccacgttgcctgacaacgggccacaactcctcataaagagacagcaaccaggatttatacaaggaggagaaaatgaaagccatacgggaagcaatagcatgatacaaaggcattaaagcagcgtatccacatagcgtaaaaggagcaacatagttaagaataccagtcaatctttcacaaattttgtaatccagaggttgattgttccagacgcgtctaggcaccgggcttgcgggtcatgcaccaggtgcgcggtccttcgggcacctcgacgtcggcggtgacggtgaagccgagccgctcgtagaaggggaggttgcggggcgcggaggtctccaggaaggcgggcaccccggcgcgctcggccgcctccactccggggagcacgacggcgctgcccagacccttgccctggtggtcgggcgagacgccgacggtggccaggaaccacgcgggctccttgggccggtgcggcgccaggaggccttccatctgttgctgcgcggccagccgggaaccgctcaactcggccatgcgcgggccgatctcggcgaacaccgcccccgcttcgacgctctccggcgtggtccagaccgccaccgcggcgccgtcgtccgcgacccacaccttgccgatgtcgagcccgacgcgcgtgaggaagagttcttgcagctcggtgacccgctcgatgtggcggtccgggtcgacggtgtggcgcgtggcggggtagtcggcgaacgcggcggcgag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与现有技术相比，本方案的有益效果：

本发明通过构建慢病毒转移载体、包装慢病毒、通过慢病毒感染，puro抗性筛选建立稳定高表达tRNA2_LeuTAA的前列腺癌细胞系，并通过PCR验证tRNA2_LeuTAA过表达效率，能够为探索tRNA2.Leu在前列腺癌细胞中高表达的生物学作用以及在前列腺发生发展中的作用机制奠定基础。

附图说明

图1是本发明实施例中的质粒图谱；

图2是本发明实施例中tRNALeuTAA在PC-3稳转株PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA中高表达。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

本发明术语解释如下：

1)“PLVX-Puro载体”是一种基于HIV-1的慢病毒表达载体，经过重组的HIV-1载体不易引起宿主免疫反应。从载体中提取的慢病毒颗粒可以在几乎任何类型的细胞中表达感兴趣的基因，包括初级的干细胞。基因的表达是由构成型活性的人巨细胞病毒即刻早期启动子CMV驱动，它位于多个克隆位点的上游，使得基因可以高水平的表达。该基因载体包含复制病毒的所有元件，其中的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件可以促进RNA加工，增强病毒和转基因RNA的核输出，极大的增加了包装细胞的病毒滴度，有助于基因在靶细胞中的表达。最后，PLVX-Puro还包含一个中央多嘌呤通道元件(central polypurine tract，CPPT)，在靶细胞感染期间增加病毒基因组的核输入，从而改善载体整合和更有效的转导。PLVX-Puro包含一个嘌呤霉素抗性基因(puromycin，Puro)，在小鼠磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)启动子的控制下，用于选择稳定的转导剂。该载体还包含一个pUC复制源和一个大肠杆菌氨苄西林耐药基因(Ampicillin，Ampr)，用于细菌的繁殖和阳性菌选择。

2)“psPAX2”、“pMD2.G”是第三代慢病毒包装质粒。

实施例：

一、PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA载体构建

由生工(Sangon)生物工程(上海)股份有限公司合成tRNA2_LeuTAA上下游引物及酶切位点，PCR扩增5’含XhoⅠ和3’BanHⅠ酶切位点的tRNA2_LeuTAA全长及侧翼序列。pMD19-T转化克隆，挑选阳性菌行DNA测序鉴定。提取质粒后利用takara核酸内切酶XhoⅠ和BanHⅠ将tRNA2_LeuTAA基因及PLVX-Puro载体线性化并利用DNA聚合酶将二者拼接。行DNA测序获得PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA载体。PCR扩增引物为：

FP:CCGCTCGAGCGGAAGGGTTCGTTTGTTCAATGATTA

RP:CGGGATCCCGATGGCTGAAGCAGCCCATAG

二、PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA细胞稳转株的建立

接种293FT细胞至T25细胞培养瓶，细胞生长融合至70-80％时，行细胞转染；转染体系如下：将核心质粒PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA及病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G按4:3:1比例加入500ul无血清培养基DMED中稀释，核心质粒2ug，包装质粒按比例计算，加入8ulP3000(赛默飞)装载质粒；另将12ul lipofectamine 3000(赛默飞)转染试剂加入500ul无血清培养基DMED中稀释，轻柔混匀；再将2管溶液轻柔混匀，室温静置10-15min。将转染混合物轻柔加入培养瓶，37℃，5％CO

接种PC-3细胞至T25细胞培养瓶，细胞生长融合至20-30％时，弃上清培养基，将3ml病毒液及2ml10％FBS培养基加入培养瓶，待细胞生长融合至90％，细胞传代培养于6孔板，二代细胞融合至50％后加入1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml puro抗生素，培养48h后，更换含puro抗生素细胞培养3-4天，选择细胞全部死亡的最低浓度为筛选浓度。用含Puro培养基传代3代后的细胞行PCR鉴定为阳性即可保种。

本发明的上述细胞系可以稳定的表达tRNA2_LeuTAA，可以作为研究tRNA2_LeuTAA过表达对前列腺细胞生物学行为影响及作用机制的有效工具。

在本实施例中，如图1所示，“PLVX-Puro载体”是一种基于HIV-1的慢病毒表达载体，由构成型活性的人巨细胞病毒即刻早期启动子CMV驱动，它位于多个克隆位点的上游，PLVX-Puro还包含一个中央多嘌呤通道元件(central polypurine tract，CPPT)，一个嘌呤霉素抗性基因(puromycin，Puro)，小鼠磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)启动子，一个pUC复制源和一个大肠杆菌氨苄西林耐药基因(Ampicillin，Ampr)。如图2所示，tRNALeuTAA在PC-3稳转株PLVX-Puro-tRNA2_LeuTAA中表达明显上调。

在本发明的上述实施例中，通过构建慢病毒转移载体、包装慢病毒、通过慢病毒感染，puro抗性筛选建立表达tRNA2_LeuTAA的前列腺癌细胞系，并通过PCR验证tRNA2_LeuTAA过表达效率，能够为探索tRNA2.Leu在前列腺癌细胞中高表达的生物学作用以及在前列腺发生发展中的作用机制奠定基础。

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。