一株罗斯氏菌Rothia sp.菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株罗斯氏菌Rothia sp.菌株及其应用。

背景技术

线虫给农作物、经济作物带来严重的危害，造成巨大经济损失的同时，也严重影响了人们的生活。一直以来，对线虫防治主要以化学农药为主，但长期使用化学农药引起的环境生态问题，导致很多化学杀线虫剂被禁用，因此利用线虫的天敌对线虫进行生物防治，逐渐受到重视。微生物作为防治线虫的主要资源之一，具备易培养，生长周期短等优势，因此利用微生物及其代谢产物防治线虫是线虫生物防治的主要途径之一。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) 是一种可独立生存的腐生线虫，易于在实验室培养，在线虫防治的微生物筛选实验中被广泛应用。

目前，尚未有关罗斯氏菌属菌株毒杀线虫的报道。

发明内容

本发明主要提供一株罗斯氏菌Rothia sp.菌株及其应用。本发明筛选的菌株为放线菌门，放线菌纲，放线菌目，微球菌科，罗斯氏菌属(Rothia)，该菌株对线虫具有较好的毒杀作用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一株罗斯氏菌Rothia sp.，该菌株为罗斯氏菌已于2021年7月 14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.22896。

本发明还提供以上所述罗斯氏菌Rothia sp.菌株在防治线虫中的应用。

本发明还提供以上所述一种防治线虫的方法，所述方法包括：制备罗斯氏菌Rothia sp.菌株的发酵液，将所得发酵液或提取物作用于线虫；该菌株已于 2021年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.22896。

进一步地，所述罗斯氏菌Rothia sp.菌株发酵液的制备方法，包括以下步骤：将放线菌Rothia sp.菌株接种至LB液体培养基或NB液体培养基中150 rpm-180rpm，26-37℃培养3-5天后，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一株放线菌Rothia sp.菌株，该菌株发酵液对线虫具有显著致死作用。本发明首次提供罗斯氏菌属菌株在防治线虫中的应用。

本发明所述防治线虫方法，以LB液体培养基或NB液体培养基作为发酵培养基，所得发酵液具有较好的活性。接种所述菌株后，28℃培养温度下， LB培养基培养的发酵液在1小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到 96.51％，28℃培养温度下，LB培养基培养的发酵液稀释一倍在3小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到88.6％；NB培养基培养的发酵液在5小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到94.1％。35℃培养温度下，LB 培养基培养的发酵液在3小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到 95.67％；NB培养基培养的发酵液在6小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到88.25％。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明实施例所述培养基的组成和配制方法如下：

LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7-7.4，121℃灭菌20分钟。

NB培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4-7.6，121℃灭菌20分钟。

秀丽隐杆线虫(C.elegans)在线虫防治的微生物筛选实验中被广泛应用，本发明实施例以秀丽隐杆线虫(C.elegans)为例，说明本发明所述放线菌Rothia sp.菌株在防治线虫中的应用。

以下实施例所述发酵液毒杀秀丽隐杆线虫(C.elegans)活性测定方法如下：

a.用移液枪吸取上述已处理好的发酵液，加入到直径为3cm培养皿中，每个培养皿中加入1mL，作为实验组；对照组为加入等体积(1mL)已灭菌的同种培养基液体，空白对照加入等体积(1mL)无菌水。最后向每个平板中加入约150条测试线虫，实验组和对照组各做三个平行。

b.观察细菌发酵液的活性测试：不同时间段对活性测试结果进行观察，在显微镜下进行计数，记录线虫死亡数和线虫总数。

c.致死率的计算方法：

致死率＝(线虫死亡数/线虫总数)％。

实施例1

一株罗斯氏菌Rothia sp.菌株，该菌株从植物根部土壤中分离得到，分离方法为稀释涂布平板法，根据16s rRNA序列对比，确定该菌株为罗斯氏菌属。该放线菌菌落成熟是为乳白色，菌落表面湿润，易挑起。

该菌株已于2021年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号：CGMCC No.22896。

实施例2

罗斯氏菌Rothia sp.首先在LB固体培养基上培养，再转接到已灭菌装有 100mLLB液体培养基的250mL三角瓶中于28℃，180rpm液体摇床培养2 天作为种子液。转接1mL种子液于已灭菌装有100mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在28℃对实施例1所述Rothiasp.菌株进行液体摇床180rpm 培养4天后，将部分发酵液用2mL的离心管(12000rpm，10min)离心除去菌体，用移液枪吸取上清，将上清液收集于20mL无菌小瓶中。

进行罗斯氏菌Rothia sp.发酵液毒杀秀丽隐杆线虫(C.elegans)的活性实验。将处理好的发酵液加入到直径为3cm的平皿中，实验组1加入1mL处理好的发酵液；实验组2对发酵液进行稀释，加入500μL发酵液和500μL无菌水，对照组为加入等体积(1mL)已灭菌的同种培养基液体，空白对照加入等体积(1mL)无菌水。最后向每个平板中加入约150条测试线虫，实验组和对照组各做三个平行。结果用百分率表示，具体如下表1所示。

表1 LB培养基28℃培养发酵液毒杀秀丽隐杆线虫活性

结果表明：罗斯氏菌Rothia sp.菌株于LB培养基，28℃，180rpm条件下培养4天的发酵液对秀丽隐杆线虫(C.elegans)有强的毒杀作用，发酵原液在 1小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到96.51％。稀释一倍的发酵液在3小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到88.6％。

实施例3

罗斯氏菌Rothia sp.首先在LB固体培养基上培养，再转接到已灭菌装有 100mLLB液体培养基的250mL三角瓶中于35℃，180rpm液体摇床培养2 天作为种子液。转接1mL种子液于已灭菌装有100mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中在35℃对罗斯氏菌Rothia sp.进行液体摇床180rpm培养4天后，将部分发酵液用2mL的离心管(12000rpm，10min)除去菌体，用移液枪吸取上清，将上清液收集于20mL无菌小瓶中。

进行罗斯氏菌Rothia sp.发酵液的毒杀秀丽隐杆线虫(C.elegans)的活性实验。结果用百分率表示，具体如下表2所示。

表2 LB培养基35℃发酵液毒杀秀丽隐杆线虫活性

结果表明：罗斯氏菌Rothia sp.菌株于LB培养基，35℃，180rpm条件下培养4天的发酵液对秀丽隐杆线虫(C.elegans)有强的毒杀作用，发酵液在3 小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到95.67％。

实施例4

罗斯氏菌Rothia sp.首先在LB固体培养基上培养，再转接到已灭菌装有 100mLNB液体培养基的250ml三角瓶中于28℃，180rpm液体摇床培养2 天作为种子液。转接1mL种子液于已灭菌装有100mL NB液体培养基的250 mL三角瓶中在28℃对罗斯氏菌Rothia sp.进行液体摇床180rpm培养4天后，将部分发酵液用2mL的离心管(12000rpm，10min)除去菌体，用移液枪吸取上清，将上清液收集于20mL无菌小瓶中。

进行罗斯氏菌Rothia sp.发酵液的毒杀秀丽隐杆线虫(C.elegans)的活性实验。结果用百分率表示，具体如表3所示。

表3 NB培养基28℃发酵液毒杀秀丽隐杆线虫的活性

结果表明：罗斯氏菌Rothia sp.菌株于NB培养基，28℃，180rpm条件下培养4天的发酵液对秀丽隐杆线虫(C.elegans)有强的毒杀作用，发酵液在5 小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到94.1％。

实施例5

罗斯氏菌Rothia sp.首先在LB固体培养基上培养，再转接到已灭菌装有 100mLNB液体培养基的250mL三角瓶中于35℃，180rpm液体摇床培养2 天作为种子液。转接1mL种子液于已灭菌装有100mLNB液体培养基的250 mL三角瓶中在35℃对Rothia sp.进行液体摇床180rpm培养4天后，将部分发酵液用2mL的离心管(12000rpm，10min)除去菌体，用移液枪吸取上清，将上清液收集于20mL无菌小瓶中。按照上文所述的发酵液杀线虫活性测定方法进行罗斯氏菌Rothia sp.发酵液的毒杀秀丽隐杆线虫(C.elegans)的活性实验。结果用百分率表示，具体如下表4所示。

表4 NB培养基35℃发酵液毒杀秀丽隐杆线虫活性

结果表明：罗斯氏菌Rothia sp.菌株于NB培养基，35℃，180rpm条件下培养4天的发酵液对秀丽隐杆线虫(C.elegans)有强的毒杀作用，发酵液在6 小时对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致死率达到88.25％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。