包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及一种包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒。

背景技术

前列腺癌为全世界男性最常见的恶性肿瘤之一。尽管被诊断出局部前列腺癌的大部分患者于根除性摄护腺切除手术(radical prostatectomy,RP)或是放射治疗后得以痊愈，将近30％的患者仍将经历生化复发。而纵使随后施予荷尔蒙治疗及/或化疗，仍有将近40％的患者会发展为转移性的去势抗性前列腺癌(metastatic castration-resistantprostate cancer,mCRPC)。以目前技术而言，由于无法治愈mCRPC，使得mCRPC患者于癌细胞转移至骨头后的死亡率几乎为100％。

前列腺仰赖雄性素受体(androgen receptor,AR)信息传递路径的信息传递以维持生长以及存活。睾酮为关键的AR配位体(androgen receptor ligand,AR ligand)，而诸如leuprorelin acetate或是goserelin等一世代荷尔蒙制剂通过抑制睾丸分泌睾酮而抑制AR信息传递的活性。然而，由于10％的睾酮由肾上腺所产生，且由于AR结构的突变或放大，都将导致无法成功抑制AR活性，进而使癌细胞产生抗性。上述原因促进了诸如abiraterone以及enzalutamide等二世代荷尔蒙制剂的发展，其中enzalutamide的作用机转通过完全地阻断AR配位体的结合区域(ligand-binding domain,LBD)从而防止AR通过与配位体结合而活化。因此，一世代荷尔蒙制剂以及二世代荷尔蒙制剂皆是通过阻断的方式调节AR信息传递以抑制癌细胞的生长。

前列腺专一性抗原(prostate-specific antigen,PSA)为一种AR信息传递的下游产物，专一性地表达于前列腺细胞，PSA启动子(PSApromoter)包含了受AR信息传递调控的雄性素反应因子(androgen response element,ARE)。在某些子集合的mCRPC患者中，其PSA表达量无法获得控制，而这归因于：具有治疗抗性的前列腺癌细胞通常除了野生型AR的表达以外，还存在有AR变异体(例如：AR-V7，为一种不具有LBD、不需要AR配位体可持续性活化的AR)的过度表达。因此，这也导致现有技术的一世代荷尔蒙制剂以及二世代荷尔蒙制剂皆难以成功地抑制AR信息传递。

综上所述，对于前列腺癌患者、特别是mCRPC患者的治疗模式的改良需要，极为迫切且至关重要。

发明内容

因此，本发明的目的即在提供一种包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒类病毒颗粒，可有效延缓以及抑制转移性的去势抗性前列腺癌细胞的生长。

本发明为解决现有技术的问题所采用的技术手段提供一种人类JC病毒的类病毒颗粒，用于将异源核酸递送至人体，包含：主要衣壳蛋白VP1(Viral protein 1,VP1)，其氨基酸序列如 SEQ ID NO：1所示；表达质粒，带有该异源核酸，该表达质粒由如SEQ ID NO：2所示的碱基序列中的前列腺细胞专一性启动子所驱动，其中，该前列腺细胞专一性启动子驱动该表达质粒于前列腺细胞表达。

在本发明的一实施例中提供一种人类JC病毒的类病毒颗粒，该前列腺细胞专一性启动子为前列腺专一性抗原启动子(prostate-specific antigen promoter,PSApromoter)。

在本发明的一实施例中提供一种人类JC病毒的类病毒颗粒，该表达质粒用以表达自杀基因。

在本发明的一实施例中提供一种人类JC病毒的类病毒颗粒，该前列腺细胞包括前列腺癌细胞及/或转移性的去势抗性前列腺癌细胞。

在本发明的一实施例中提供一种人类JC病毒的类病毒颗粒用于制备抑制前列腺癌细胞及/或转移性的去势抗性前列腺癌细胞生长的医药组成物的用途。

经由本发明所采用的技术手段，本发明的该包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒，可有效地递送该表达质粒至前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞，并且有效延缓以及抑制前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞的生长。

附图说明

图1a为显示根据本发明的一实施例的骨转移性的去势抗性前列腺癌的小鼠模式的股骨组织切片苏木素-伊红染色(H&E stain)图。

图1b为显示根据本发明的实施例的骨转移性的去势抗性前列腺癌的小鼠模式的股骨组织切片免疫组织化学染色(immunohistochemistry stain,IHC stain)图。

图2为显示根据本发明的实施例的静脉注射PSAtk-VLPs后再腹腔注射GCV(PSAtk-VLPs+GCV组)以及无治疗组的骨转移性的去势抗性前列腺癌的小鼠模式的骨转移性的去势抗性前列腺癌细胞的非侵入式3D活体分子影像图。

图3为显示根据本发明的实施例的静脉注射PSAtk-VLPs后再腹腔注射GCV(PSAtk-VLPs+GCV组)、无治疗组以及其他不同条件的实验组的骨转移性的去势抗性前列腺癌的小鼠模式的去势抗性前列腺癌细胞的非侵入式3D活体分子影像的发光强度统计折线图。

具体实施方式

以下根据图1a至图3，而说明本发明的实施方式。该说明并非为限制本发明的实施方式，而为本发明的实施例的一种。

依据本发明的一实施例的一种人类JC病毒的类病毒颗粒，用于将异源核酸递送至人体，包含：主要衣壳蛋白VP1(Viral protein 1,VP1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；表达质粒，带有该异源核酸，该表达质粒由如SEQ ID NO：2所示的碱基序列中的前列腺细胞专一性启动子所驱动，其中，该前列腺细胞专一性启动子驱动该表达质粒于前列腺细胞表达。

详细而言，前列腺癌细胞于发展成为去势抗性前列腺癌细胞后，该去势抗性前列腺癌细胞转移的可能性高(即，转移性的去势抗性前列腺癌细胞)，且临床常见的转移标的器官为骨头。因此，本发明的包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒的作用标的，主要针对转移性的去势抗性前列腺癌细胞，并进一步在本发明的实施例中针对骨转移性的去势抗性前列腺癌细胞实施相关实验。本发明的作用标的并不以骨转移性的去势抗性前列腺癌细胞为限，由于本发明的该表达质粒所具有的该前列腺细胞专一性启动子为前列腺专一性抗原启动子(prostate-specific antigen promoter，简称为PSA启动子)，因此，具有AR(简称为 AR(+))的其他前列腺癌细胞、去势抗性前列腺癌细胞以及转移性的去势抗性前列腺癌细胞皆可作为本发明的作用标的。

详细而言，本发明的人类JC病毒的类病毒颗粒以由该主要衣壳蛋白VP1自行组装并包装该表达质粒的方式所形成，包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒的相关制备材料及试验方法如下所示。

构筑包含有PSA启动子的表达质粒PSAtk：

使用引子5’-GTTAATTAATGTACACCTGCAGGCCTCTAG-3’以及引子5’-GGTGACGTCGACACAGCTCTCC-3’以pDRIVE-PSA-hPSA载体(InvivoGen,San Diego,CA) 作为模板放大人类PSA强化子(enhancer)/启动子片段。PCR产物与pUMVC1-tk质体DNA (Aldevron)一同经由BsrGI以及SalI(NEB)处理后使用T4 DNA连接酶连接并进行DNA定序确认。其中所使用的pUMVC1-tk质体已通过BsrGI以及SalI将其CMV启动子移除。

制备包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒(简称为PSAtk-VLP)：

JCPyV主要病毒蛋白表达质粒ΔpFlag-VP1可于大肠杆菌中表达主要衣壳蛋白VP1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所表达的主要衣壳蛋白VP1能够自行组装成VLPs。经由主要衣壳蛋白VP1自行组装而成的VLPs用于包装带有异源核酸的表达质粒。在本说明书的实施例中，该表达质粒PSAtk具有PSA启动子且带有人类第一型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(Human Herpes Simplex Virus type 1thymidine kinase,HSV-tk)，也就是自杀基因。当然，本案的该表达质粒所表达的基因并不以此为限，该表达质粒亦可用于表达小发夹RNA或是其他用于作为肿瘤基因治疗的相关异源核酸。其中ΔpFlag-VP1带有ampicillin 抗药性，而PSAtk带有kanamycin抗药性。将ΔpFlag-VP1及PSAtk转形至胜任细胞(JM109) 中。值得注意的是，ΔpFlag-VP1所表达的主要衣壳蛋白VP1于自行组装成VLPs的同时，会将同时存在于胜任细胞中的PSAtk包装入VLPs当中。将ΔpFlag-VP1及PSAtk转形至胜任细胞(JM109)后，添加抗生素ampicillin及kanamycin以进行筛选。而后进行PCR以确认两种质体同时存在于胜任细胞中。之后，VLP的纯化以及表达如参考文献(Lin,M.C.,Wang,M., Fang,C.Y.,Chen,P.L.,Shen,C.H.and Chang,D.(2014)Antiviral Res.103,2531)所述。简言之，细菌受IPTG诱导而裂解，并通过离心收集包含有可溶性蛋白的上清液，而后，将含有包装质体DNA的JCPyV VLPs(即，PSAtk-VLPs)通过10-30％蔗糖梯度进行纯化，并通过通过Centricon浓缩离心管(Millipore)中过滤进行浓缩。

依据本发明的实施例的一种人类JC病毒的类病毒颗粒，其中该表达质粒用以表达自杀基因。恶性肿瘤的自杀基因治疗是一种被认为有潜力的癌症治疗方法。它是先将治疗基因 (therapeutic genes)递送到肿瘤细胞中，此基因随后表现表达出对应序列的蛋白酵素，其可将外加的无毒性前驱化合物转变成有毒的化合物，进而杀死或是抑制肿瘤细胞的生长。本说明书中所示的实施例采用HSV-tk自杀基因，HSV-tk的表达让肿瘤细胞对抗病毒药物敏感，而ganciclovir(GCV)是其中一例，其为上述的其中一种前驱化合物，为核苷酸类似物。

详细而言，HSV-tk自杀基因所表达出的人类第一型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV- TK)可以磷酸化前驱药物GCV，被加上磷酸根的GCV，会在细胞复制时阻碍DNA合成的路径，使细胞走向凋亡(apoptosis)。肿瘤细胞为复制生长快速的细胞，故此项策略可有效抑制肿瘤细胞生长，而较不影响处于休眠时期或正常生长的细胞。

建立稳定表达荧光素酶的CRPC细胞株(stable luciferase-expressing CRPCcell line，简称为22Rv1-Dual)：

将人类前列腺癌细胞株22Rv1(ATCC,CRL-2505)培养于RPMI-1640培养基中，该培养基补充有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、L-谷胺酸、非必需氨基酸、HEPES以及penicillin/streptomycin抗生素溶液(Thermo Fisher Scientific,Cambridge,MA,USA)。稳定表达荧光素酶的22Rv1细胞通过感染慢病毒载体pLenti-II-CMV-Luc-IRES-GFP(Applied Biological Materials Inc.,Canada)而建立。感染后三天，使用含有G418(200μg/ml)的培养基筛选细胞。随后，于荧光显微镜下确认该细胞会表达GFP(通过相同启动子驱动表达荧光素酶)后，该细胞被命名为22Rv1-Dual。

通过异种移植小鼠模式以研究本发明抑制骨转移性的去势抗性前列腺癌细胞生长的结果：

五周龄雄性裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl)购自实验动物中心，并依据中山医学大学动物实验中心的The Institutional Animal Care and Use Committee所设立的准则执行小鼠模式的饲育。为了建立骨转移性的人类前列腺癌的小鼠模式，使用26号针将含有22Rv1-Dual 细胞(3×10

第1组：控制组，为无治疗组，即该组的小鼠未接受任何治疗。

第2组：每3天静脉注射1次100μg/100μl PSAtk-VLPs，共注射15次。

第3组：每3天腹腔注射1次300mg/kg GCV，共注射15次。

第4组：每2周皮下注射1次leuprorelin acetate(Leuplin Depot,2mg/kg)，共注射4次；同时，伴随着每1周腹腔注射2次enzalutamide(Xtandi,30mg/kg)，共注射13次。

第5组：下述处理历经15次循环：经由尾静脉施行静脉注射100μg/μl PSAtk-VLPs，随后在隔天腹腔注射300mg/kg GCV。

为了测量肿瘤的发光强度以作为治疗前的参考点，于随机化的一天使用非侵入式3D活体分子影像系统(IVIS Spectrum imaging system)进行肿瘤成像观察。随后，在治疗过程中将所有肿瘤的变化与该参考点进行比较，并且每10天记录一次。值得注意的是，于此期间测量出的发光强度反映了肿瘤大小的变化。于成像前10分钟，小鼠接受腹腔注射150mg/kg D-荧光素钾盐(Sigma Life Science,St.Louis,MO,USA)。使用2.5％异氟醚(isoflurane)进行麻醉。为了评估股骨内肿瘤，将肿瘤连同股骨作为一个整体而进行解剖。实验结束时，小鼠于腔室内以CO

如图1a以及图1b所示，本实施例分别通过H&E染色以及IHC染色确定前列腺癌细胞于小鼠股骨中的生长位置。

如图2以及图3所示，无治疗组的骨内前列腺癌细胞随着时间逐渐生长、肿瘤体积变大，而植入22Rv1-Dual细胞并接受PSAtk-VLPs伴随GCV治疗的组别(简称为PSAtk-VLPs+GCV)于64天后则呈现显著的抑制骨内前列腺癌细胞生长的结果。

更进一步而言，如图2以及图3所示，PSAtk-VLPs+GCV组所呈现出的疗效明显优于接受目前临床上所使用的荷尔蒙制剂(即，leuprorelin acetate+enzalutamide)的治疗的组别。此外，euprorelin acetate+enzalutamide与PSAtk-VLPs+GCV相比，PSAtk-VLPs+GCV更能够有效延缓肿瘤的生长。在治疗过程中，PSAtk-VLPs+GCV不仅可以抑制肿瘤的生长，且接受PSAtk-VLPs+GCV治疗后的组别的肿瘤体积，与接受治疗前的肿瘤体积相比，接受PSAtk- VLPs+GCV治疗后的肿瘤体积更小，显示出PSAtk-VLPs+GCV具有完全消除肿瘤细胞的可能性。

依据本发明的实施例的一种人类JC病毒的类病毒颗粒用于制备抑制前列腺癌细胞及/ 或转移性的去势抗性前列腺癌细胞生长的医药组成物的用途。

本案的该包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒，可随着血液循环有效地递送该表达质粒至前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞，从而使该表达质粒所带有的异源核酸(例如：自杀基因)得以顺利表达，进而有效延缓以及抑制前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞的生长。此外，如本案的实施例所示，该包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒搭配GCV，对于前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞而言，比起目前临床上所使用的荷尔蒙制剂更具有显著的功效，显示出本案的该包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒于前列腺癌细胞、特别是转移性的去势抗性前列腺癌细胞的相关疗法中的发展潜力。

以上的叙述以及说明仅为本发明的较佳实施例的说明，本领域技术人员当可依据以上权利要求书以及上述的说明而作其他的修改，只是这些修改仍应是为本发明的发明精神而在本发明的保护范围中。

序列表

<110> 思凯生科有限公司

<120> 包含有专一性表达于前列腺细胞的表达质粒的类病毒颗粒及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> PRT

<213> JC polyomavirus

<400> 1

Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Arg Lys Asp Pro Val Gln Val

1               5                   10                  15

Pro Lys Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr

            20                  25                  30

Gly Val Asp Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu Thr Pro Glu Met

        35                  40                  45

Gly Asp Pro Asp Glu His Leu Arg Gly Phe Ser Lys Ser Ile Ser Ile

    50                  55                  60

Ser Asp Thr Phe Glu Ser Asp Ser Pro Asn Lys Asp Met Leu Pro Cys

65                  70                  75                  80

Tyr Ser Val Ala Arg Ile Pro Leu Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr

                85                  90                  95

Cys Gly Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu Lys Thr Glu Val

            100                 105                 110

Leu Gly Val Thr Thr Leu Met Asn Val His Ser Asn Gly Gln Ala Thr

        115                 120                 125

His Asp Asn Gly Ala Gly Lys Pro Val Gln Gly Thr Ser Phe His Phe

    130                 135                 140

Phe Ser Val Gly Gly Glu Ala Leu Glu Leu Gln Gly Val Val Phe Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Thr Ile Phe Pro Lys Asn Ala Thr

                165                 170                 175

Val Gln Ser Gln Val Met Asn Thr Glu His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys

            180                 185                 190

Asn Lys Ala Tyr Pro Val Glu Cys Trp Val Pro Asp Pro Thr Arg Asn

        195                 200                 205

Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr Leu Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro

    210                 215                 220

Pro Val Leu His Ile Thr Asn Thr Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu

225                 230                 235                 240

Phe Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys Gly Asp Asn Leu Tyr Leu Ser Ala

                245                 250                 255

Val Asp Val Cys Gly Met Phe Thr Asn Arg Ser Gly Ser Gln Gln Trp

            260                 265                 270

Arg Gly Leu Ser Arg Tyr Phe Lys Val Gln Leu Arg Lys Arg Arg Val

        275                 280                 285

Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe Leu Leu Thr Asp Leu Ile Asn Arg

    290                 295                 300

Arg Thr Pro Lys Val Asp Gly Gln Pro Met Tyr Gly Met Asp Ala Gln

305                 310                 315                 320

Ile Glu Glu Val Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Gly Asp

                325                 330                 335

Pro Asp Met Met Arg Tyr Val Asp Arg Tyr Gly Gln Leu Gln Thr Lys

            340                 345                 350

Met Leu

<210> 2

<211> 6301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca cctgcaggcc tctagaaatc 60

tagctgatat agtgtggctc aaaaccttca gcacaaatca caccgttaga ctatctggtg 120

tggcccaacc ttcaggtgaa caaaggcact ctaatctggc aggatatcca aagcattaga 180

gatgacctct tgcaaagaaa aagaaatgga aaagaaaaag aaagaaagga aaaaaaaaaa 240

aaaaaagaga tgactctcag gctctgaggg gaaacgcctg aggtctttga gcaagtcagt 300

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aggggggaca ctagaccagg gacactctgg atgctgggga ctccagagac catgaccact 600

caccaactgc agagaaatta attgtggcct gtgtccctgt cctggagagg gtggaggtgg 660

accttcacta acctctacct tgaccctctc ttttagggct ctttctgacc tccaccatga 720

tactaggacc ccattgtatt ctgtaccctc ttgactcatg acccccactg cccactgcat 780

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cccaaatctt gtagggtgac cagagcagtc taggtgatgc tgtgcacacg gggtttgtgc 1080

cactggtgag aaacctgaga ttaggaatcc tcaatcttat actgggacaa cttgcaacct 1140

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ctctggagga acatattgta tcgattgtcc ttgacagtaa acaaatctgt tgtaagagac 1260

atatctttat tatctaggac agtaagcaag cctggatctg agagagatat atcttgcaag 1320

gatgcctgct ttacaaacat ccttgaaaca acaatccaga aaaaaaaagg tgttgctgtc 1380

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agccagagcc ttccaccctt gtctgcagga cagtctcaac gttccaccat taaatacttc 1500

ttctatcaca tccgcttctt tatgcctaac caaggttcta ggtcccgatc gactgtgtct 1560

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tttgctgcac gttggatttt gaaatgctag ggaactttgg gagactcata tttctgggct 1680

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agcatgagga ataaaagttc tagttttggt ctcagagtgg tgcagggatc agggagtctc 1860

acaatctcct gagtgctggt gtcttagggc acactgggtc ttggagtgca aaggatctag 1920

gcacgtgagg ctttgtatga agaatcgggg atctacccac cccctgtttc tgtttcatcc 1980

tgggcgtgtc tcctctgcct ttgtccccta gatgaagtct ccatgagcta cagggcctgg 2040

tgcatccagg gtgatctagt aattgcagaa cagcaagtgc agctctccct ccccttccac 2100

agctctgggt gtgggagggg gttgtccagc ctccagcagc atggggaggg ccttggtcag 2160

cctctgggtg ccagcagggc aggggcggag tcctggggaa tgaaggttta tagggctcct 2220

gggggaggct ccccagcccc aagcttacca cctgcacccg gagagctgtg tcgacggtat 2280

cgataagctt gatagcttca ccatggcttc gtaccccggc catcaacacg cgccgcgttc 2340

gaccaggctg cgcgttctcg cggccatagc aaccgacgta cggcgttgcg ccctcgccgg 2400

cagcaagaag ccacggaagt ccgcccggag cagaaaatgc ccacgctact gcgggtttat 2460

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cggggacgcg gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc cttatgccgt 2700

gaccgacgcc gttctgctcc tcatatcggg ggggaggctg ggagctcaca tgccccgccc 2760

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cgccgacctt gcccggcacc aacatcgtgc ttggggccct tccggaggac agacacatcg 2940

accgcctggc caaacgccag cgccccggca gcggctggac ctggctatgc tggctgcgat 3000

tcgccgcgtt tacgggctac ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagtgcg gcgggtcgtg 3060

gcgggaggac tggggacagc tttcggggac ggccgtccgc cccagggtgc cgagccccag 3120

agcaacgcgg gcccacgacc ccatatcggg gacacgttat ttaccctgtt tcgggccccc 3180

gagttgctgg cccccaacgg cgacctgtat aacgtgtttg cctggccttg gacgtcttgg 3240

ccaaacgcct ccgttccatg cacgtcttta tcctgggtta cgaccaatcg cccgccggct 3300

gccgggacgc cctgctgcaa cttacctccg ggatggtcca gacccacgtc ccacccccgg 3360

ctccataccg acgatatgcg acctggcgcg cacgtttgcc cgggagatgg gggaggctaa 3420

ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcactg 3480

acttctggct aataaaggaa atttatttta ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 3540

tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg 3600

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