抗癌和免疫增强的新靶点

技术领域

本申请要求2018年4月5日提交的美国申请号62/652,948的优先权，其公开内容通过整体引用并入本文中。

本公开提供了一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其含有KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂，以及一种通过向需要的受试者给药KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂来治疗或预防癌症的方法。另外，本公开提供了一种用于免疫增强的药物组合物，其含有KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂，以及一种通过向需要的受试者给药KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂来免疫增强的方法。此外，本公开提供了一种使用KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种来筛选抗癌试剂的方法，以及一种使用KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种来提供分析癌症预后所必需的信息的方法。

背景技术

尽管在过去几年中在理解癌症的病因学和治疗癌症的方法方面取得了进步，但它仍然是全世界死亡的主要原因。尽管针对许多恶性肿瘤存在抗癌治疗，但是这种治疗常常不能完全控制此类恶性肿瘤或对所有患者均无效。当前用于治疗癌症的大多数方法是相对非选择性的。通过手术去除受影响的组织，通过放射疗法缩小实体瘤的大小，或者使用化学疗法迅速杀死癌细胞。特别地，化学疗法可引起耐药性，并且有时会限制可给药的剂量。它会引起严重的副作用，因此他们可能会排除潜在有效试剂的使用。因此，需要研发更具靶标特异性的和更有效的癌症疗法。

人的适应性免疫系统是一种非常精确的系统，其能够特异性地去除癌细胞。特别地，T细胞确定细胞介导的适应性免疫，并识别和去除细胞所暴露的非自身抗原或异常抗原。T细胞每个细胞表达约20,000至40,000个TCR分子，并识别APC的100,000个pMHC分子中的几种抗原(由其肽序列确定)以开始信号传导。此类TCR分子应作为高度敏感的传感器发挥作用，其需要识别出非常微小的抗原变化并传递信号。这种细胞介导的适应性免疫以非常精确的方式起作用，以有效去除癌细胞。如果抗原特异性的适应性免疫系统无法正常运行，则会在去除癌细胞的能力方面引起严重问题。例如，如果癌细胞表面上的蛋白PD-L1或PD-L2与T细胞表面上的蛋白PD-1结合，则T细胞将无法攻击癌细胞。因此，为了有效治疗癌症，有必要除去阻碍T细胞除去癌细胞能力的因素。

因此，发明人已经进行了研究以开发使用人类免疫系统的癌症治疗方法，并且发现抑制KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种的活性和表达，可导致对癌症的发展、生长、侵袭和转移的显著抑制。

发明内容

技术问题

本公开的一个目的是提供一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，以及一种治疗或预防癌症的方法。

本公开的另一个目的是提供一种用于免疫增强的药物组合物，以及一种免疫增强的方法。

本公开的另一个目的是提供一种筛选抗癌试剂的方法。

本公开的另一个目的是提供一种提供分析癌症预后所必需的信息的方法。

技术方案

为了实现本公开的目的，本公开的一方面提供了一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其含有KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂作为活性成分，以及一种通过向需要的受试者给药KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂来治疗或预防癌症的方法。

术语“KIRREL3(IRRE样蛋白3的种类)”是指由KIRREL3基因编码的蛋白，其属于肾素样蛋白家族的成员，也被称为“NEPH2”。它在胎儿和成人大脑中以及肾小球的足细胞中表达，并且据报道参与肾脏的血液过滤功能和突触形成。

术语“CNTN4(接触蛋白-4)”是指由CNTN4基因编码的蛋白，其属于免疫球蛋白超家族。据报道是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的神经元膜蛋白，它作为细胞粘附分子起作用，并参与发育中的神经系统中轴突连接的形成。

术语“CD351(分化簇351)”是指以高亲和力结合IgA和IgM的Fc受体，也称为“Fcα/μR”。据报道，在小鼠中，该受体在巨噬细胞、滤泡树突状细胞、边缘区和滤泡B细胞以及肾小管上皮细胞上表达。据报道，在人体中，它在肠固有层细胞、潘氏细胞、扁桃体中的滤泡树突状细胞、活化的巨噬细胞和某些类型的前生发中心(pre-germinal centre)IgD+/CD38+B细胞上表达。

KIRREL3、CNTN4和CD351可以为人源的KIRREL3、CNTN4和CD351。更具体地，KIRREL3的氨基酸序列可以为或包括NCBI中公开的NCBI参考序列：NP_115920.1的序列。CNTN4的氨基酸序列可以包括NCBI中公开的NCBI参考序列：NP_783200.1的序列。CD351的氨基酸序列可以为或包括NCBI中公开的NCBI参考序列：AAL51154.1的序列。另外，KIRREL3、CNTN4和CD351的每个氨基酸序列可以为或包括，但不限于，与NCBI参考序列：NP_115920.1、NP_783200.1、AAL51154.1的每个序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，以及具有KIRREL3、CNTN4和CD351的特性或功能的氨基酸序列。

KIRREL3的基因可以为或包括编码人源的KIRREL3的氨基酸序列的核酸序列，或NCBI中公开的NCBI参考序列：NM_032531.4的核酸序列。CNTN4的基因可以为或包括编码人源的CNTN4的氨基酸序列的核酸序列，或NCBI中公开的NCBI参考序列：NM_175607.3的核酸序列。CD351的基因可以为或包括编码人源的CD351的氨基酸序列的核酸序列，或NCBI中公开的NCBI参考序列：AY063125.1的核酸序列。另外，KIRREL3、CNTN4和CD351的每个核酸序列可以为或包括，但不限于，与NCBI参考序列：NM_032531.4、NM_175607.3、AY063125.1的每个序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的核酸序列，以及能够产生具有KIRREL3、CNTN4和CD351的特性或功能的氨基酸的核酸序列。

术语“KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂”是指抑制选自KIRREL3、CNTN4和CD351中的至少一种的活性或表达的物质。“KIRREL3、CNTN4和22CD351的一种或多种抑制剂”和“KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂”可互换使用。例如，抑制剂可以为抑制所有的KIRREL3、CNTN4和CD351的活性或表达的物质。作为另一个例子，抑制剂可以为抑制KIRREL3和CNTN4的、或KIRREL3和CD351的、或CNTN4和CD351的活性或表达的物质。作为另一个例子，抑制剂可以为抑制KIRREL3的、或CNTN4的、或CD351的活性或表达的物质。作为另一个例子，抑制剂可以为KIRREL3抑制剂、CNTN4抑制剂和CD351抑制剂的组合。作为另一个例子，抑制剂可以为KIRREL3抑制剂和CNTN4抑制剂的组合、或KIRREL3抑制剂和CD351抑制剂的组合、或CNTN4抑制剂和CD351抑制剂的组合。

KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂可以优选抑制癌细胞逃避T细胞的功能。KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂阻断癌细胞中存在的KIRREL3、CNTN4和/或CD351的活性，从而抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351使T细胞无法攻击癌细胞的机制，并维持T细胞对癌细胞的免疫活性。或者，KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂特异性结合KIRREL3、CNTN4和/或CD351蛋白，并干扰KIRREL3、CNTN4和/或CD351与T细胞的结合。或者，KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的特定代谢途径，以降低蛋白的表达，或导致KIRREL3、CNTN4和/或CD351变性，从而使蛋白丧失活性。因此，根据本公开的KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂在治疗或预防癌症中非常有效。

KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂可包括但不限于任何化合物、蛋白、融合蛋白、抗体、氨基酸、肽、病毒、碳水化合物、脂类、核酸、提取物或馏分，只要它抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的活性或表达。KIRREL3抑制剂、CNTN4抑制剂和CD351抑制剂可以是彼此独立的相同或不同类型。例如，所有抑制剂可以为抗体。作为另一个例子，两种抑制剂可以为抗体，并且一种抑制剂可以为化合物。

在一种实施方式中，与未用KIRREL3、CNTN4和CD351的抑制剂处理的癌细胞相比，KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂是降低癌细胞中KIRREL3、CNTN4和/或CD351的表达的抑制剂。降低KIRREL3、CNTN4和/或CD351的表达可能是指由KIRREL3、CNTN4和/或CD351基因产生的mRNA和/或蛋白水平降低或没有。KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂可包括但不限于以互补方式与KIRREL3、CNTN4和/或CD351基因的DNA或mRNA结合的反义核酸、siRNA、shRNA、miRNA、核酶等。KIRREL3抑制剂、CNTN4抑制剂和CD351抑制剂可以是彼此独立的相同或不同类型。例如，所有抑制剂可以为siRNA。作为另一个例子，两种抑制剂可以为siRNA，并且一种抑制剂可以为反义核酸。

术语“反义核酸”是指含有与某些mRNA或其片段或其衍生物的序列互补的核酸序列的DNA或RNA，其与mRNA中的互补序列结合或杂交并抑制mRNA翻译成蛋白。

术语“siRNA(小干扰RNA)”是指短双链RNA，其能够通过切割某些mRNA来诱导RNAi(RNA干扰)。siRNA包括具有与靶基因的mRNA同源的序列的正义RNA链和具有与其互补的序列的反义RNA链。siRNA可以抑制靶基因的表达，因此可用于基因敲减、基因治疗等。

术语“shRNA(短发夹RNA)”是单链RNA，其包括通过氢键形成双链部分的茎部分和环部分。它被诸如Dicer的蛋白加工转化成siRNA，并执行与siRNA相同的功能。

术语“miRNA(微小RNA)”是指21至23个非编码RNA，其在转录后通过促进靶RNA的降解或通过抑制其翻译来调节基因表达。

术语“核酶”是指具有酶样功能的RNA分子，其识别特定的碱基序列并将其切割。核酶包括与靶信使RNA链的互补碱基序列特异性结合的区域和切割靶RNA的区域。

与KIRREL3、CNTN4和/或CD351基因的DNA或mRNA互补结合的反义核酸、siRNA、shRNA、miRNA、核酶等可以抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的mRNA的翻译，其向细胞质中的转运，其成熟或，对KIRREL3、CNTN4和/或CD351的生物学功能至关重要的任何其他活性。

在一种实施方式中，与未用KIRREL3、CNTN4和CD351的抑制剂处理的癌细胞相比，KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂是使癌细胞中KIRREL3、CNTN4和/或CD351的功能失活或降低其活性的抑制剂。KIRREL3、CNTN4和/或CD351的抑制剂可包括但不限于与KIRREL3、CNTN4和/或CD351蛋白特异性结合的化合物、肽、肽模拟物、融合蛋白、抗体、适体等。KIRREL3抑制剂、CNTN4抑制剂和CD351抑制剂可以是彼此独立的相同或不同类型。

术语“特异性”或“特异性地”是指仅结合靶蛋白而不影响细胞中其他蛋白的能力。

术语“抗体”可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合体抗体、人源化抗体和人类抗体，并且还可以包括新抗体以及本领域已知或本领域商业化的抗体。抗体不仅可以包括具有两条重链和两条轻链的全长形式，而且还可以包括抗体分子的功能片段，只要它们特异性结合KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种即可。抗体分子的功能片段是指至少具有其抗原结合功能的片段，并且可以包括但不限于Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。

术语“肽模拟物”是指抑制诱导KIRREL3、CNTN4和/或CD351活性的KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种蛋白的结合域的肽或非肽。

术语“适体”是指单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)，其本身具有稳定的三级结构并且能够以高亲和力和特异性结合靶分子。

本公开的药物组合物中含有的抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的活性或表达的物质可以抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351对T细胞功能的抑制，因此可以增加或维持T细胞攻击和杀死癌细胞的能力。在此，与未使用KIRREL3、CNTN4和/或CD351抑制剂处理的组相比，用KIRREL3、CNTN4和/或CD351抑制剂处理的组中T细胞攻击和杀死癌细胞的能力可提高5％至200％。因此，本公开的药物组合物可用于预防或治疗癌症。

可以通过本公开的药物组合物治疗或预防的癌症可以包括但不限于胃癌、肺癌、肝癌、结肠直肠癌、结肠癌、小肠癌、胰腺癌、脑癌、骨癌、黑色素瘤、乳腺癌、硬化性腺病、子宫癌、子宫颈癌、头颈癌、食道癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、肉瘤、前列腺癌、尿道癌、膀胱癌、血癌、白血病、淋巴瘤、纤维腺瘤等。

根据本公开的药物组合物可以单独含有活性成分，或者可以另外含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、防腐剂等。

药学上可接受的载体可以包括，例如，用于口服给药或非口服给药的载体。用于口服给药的载体可以包括，例如，乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。用于非口服给药的载体可以包括，例如，水、合适的油、盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇等。药学上可接受的稳定剂可以包括，例如，抗氧化剂，诸如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。药学上可接受的防腐剂可以包括，例如，苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇等。其他药学上可接受的载体可以是在文献“Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1995”中公开的那些。

本公开的药物组合物可以使用各种方法给药于动物，包括人。例如，它可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药可以包括但不限于静脉内给药、肌内给药、动脉内给药、骨髓内给药、硬膜内给药、经皮给药、皮下给药、腹膜内给药、鼻内给药、肠内给药、局部给药、舌下给药、直肠给药等。

本公开的药物组合物可以制备成用于口服或肠胃外给药的制剂，这取决于如上所述的给药途径。

使用本领域已知的方法，用于口服给药的制剂可以制成粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂等形式。例如，本公开的活性成分可以与合适的赋形剂和/或佐剂混合，然后加工成颗粒混合物以获得用于口服给药的片剂或糖衣片剂。合适的赋形剂的实例可以包括但不限于，糖，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇，麦芽糖醇等，淀粉，包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉等，纤维素类，包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素等，以及填充剂，诸如明胶、聚乙烯吡咯烷酮等。任选地，可以加入崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠。此外，本公开的药物组合物可以进一步含有抗凝剂、润滑剂、湿润剂、芳香剂、乳化剂和防腐剂等。

使用本领域已知的方法，用于肠胃外给药的制剂可以制成注射剂、凝胶剂、气雾剂、鼻吸入剂的形式。

这些给药形式可以参考本领域已知的文献“Remington's PharmaceuticalScience,15th Edition,1975.Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania18042,Chapter 87:Blaug,Seymour”中公开的那些形式。

根据本公开的药物组合物的总有效剂量可以通过分级治疗方案以单剂量或以多剂量给药于受试者。

可以考虑多种因素，由本领域普通技术人员来确定根据本公开的药物组合物的合适剂量或药物组合物中活性成分的含量，所述因素诸如给药途径、给药次数、患者年龄、体重、健康状况、性别、疾病的严重性、饮食和排泄率等。例如，根据本公开的药物组合物的总剂量可以为每天患者每1kg体重约0.01μg-1000mg，或0.1μg-100mg。剂型、给药途径和给药方法没有特别限制，只要药物组合物显示出本发明的效果即可。

本公开的另一方面提供了用于受试者中免疫增强的药物组合物，其含有KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂作为活性成分。

当将药物组合物给药于有需要的受试者时，它可以完全或部分降低受试者中KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种的表达或活性，以提高T细胞介导的免疫应答的水平。

因此，本公开的药物组合物可以用于免疫增强。例如，它可以用于需要预防、治疗或改善与免疫缺陷、免疫功能低下、免疫系统受损、免疫损害等有关的疾病的受试者。

本公开的另一方面是提供一种治疗或预防受试者的癌症的方法，其包括向受试者给药KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂。并且，本公开的另一方面提供了一种受试者免疫增强的方法，其包括向受试者给药KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂。在这些方法中，除非另外特别指出，否则相关的术语具有与以上针对药物组合物所解释的术语相同的含义。

本公开的另一方面是提供一种筛选抗癌试剂的方法，其包括：

(a)用候选抗癌试剂处理癌细胞；和

(b)测量癌细胞中KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种的表达或活性。

任选地，筛选抗癌试剂的方法可以进一步包括以下步骤：如果与未用候选抗癌试剂处理的组相比，用候选抗癌试剂处理的组显示KIRREL3、CNTN4和CD351 mRNA或蛋白的一种或多种的表达水平较低(或显著较低)，或KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制T细胞活性的水平较低(或显著较低)，则将候选抗癌试剂确定为抗癌试剂。在此，较低(或显著较低)水平可表明量减少了5％-95％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％和90％)。减少的量还可以指KIRREL3、CNTN4和CD351的每种减少的量的总和，或KIRREL3、CNTN4和CD351的独立减少的量。未用候选抗癌试剂处理的组可以是未加入任何物质的癌细胞，或者是用除KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂外的任何物质诸如抗癌试剂处理的癌细胞。

术语“筛选”是指在蛋白、融合蛋白、抗体、肽、抗生素、酶、化合物或任何其他物质中发现具有特定性质诸如敏感性或活性的靶物质。

术语“候选抗癌试剂”可以指根据通常的选择方法随机选择的或被认为能够抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的表达或活性的核酸、蛋白、抗体、化合物、提取物或天然物质。候选抗癌试剂可以优选为抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的表达和/或活性的物质。

KIRREL3、CNTN4和/或CD351的表达或活性可以通过确定KIRREL3、CNTN4和/或CD351的mRNA或蛋白的表达水平或通过确定KIRREL3、CNTN4和/或CD351抑制T细胞活性的程度来进行测量。

确定KIRREL3、CNTN4和/或CD351的mRNA的表达水平的方法可以包括但不限于本领域常规已知的任何方法，诸如逆转录酶PCR、竞争性逆转录酶PCR、实时逆转录酶PCR、RNA酶保护试验、RNA印迹、DNA芯片或RNA芯片。

确定KIRREL3、CNTN4和/或CD351蛋白的表达水平的方法可以包括但不限于本领域常规已知的任何方法，诸如蛋白印迹、ELISA、放射免疫分析、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫组化、免疫沉淀法、补体结合测定法、FACS或蛋白芯片。

确定KIRREL3、CNTN4和/或CD351抑制T细胞活性的程度的方法可以包括但不限于本领域常规已知的任何方法，诸如RT-PCR、蛋白印迹、ELISA、放射免疫法、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化、免疫沉淀、完全固定试验(completefixation assay)或FACS。

另外，在本公开的筛选方法中，可以使用常规方法，诸如使KIRREL3、CNTN4和/或CD351蛋白与候选物质反应以测量活性，酵母双杂交，搜索与KIRREL3、CNTN4和/或CD351蛋白结合的噬菌体展示肽克隆，使用天然材料和化学库的HTS(高通量筛选)，药物命中HTS，基于细胞的筛选或基于DNA阵列的筛选，来确认KIRREL3、CNTN4和/或CD351活性被抑制。

筛选抗癌试剂的方法可以在体外或体内进行。对于体内，用候选抗癌试剂处理癌细胞的步骤可以由向具有癌细胞或患有癌症的受试者给药候选抗癌试剂的步骤代替。这样的受试者可以是动物，诸如人、小鼠等。

筛选抗癌试剂的方法基于本发明中的新公开，即抑制KIRREL3、CNTN4和/或CD351的活性或表达可以抑制癌细胞逃避T细胞的功能。本公开的筛选方法是非常有利的，因为它允许通过简单且廉价的方法容易地开发新的抗癌试剂。

本公开的另一方面提供了一种提供分析癌症预后所必需的信息的方法，包括测量从受试者分离的细胞或组织中KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种的表达或活性。

在该方法中，除非另外特别指出，与KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种的表达或活性及其测量有关的术语具有与针对组合物和筛选方法所解释的术语相同的含义。

术语“预后”是指关于疾病进展、疾病改善、疾病复发、转移和死亡可能性的预测。例如，在本公开中，预后是指治愈癌症患者或改善癌症患者的状况的可能性。

从受试者分离的细胞或组织可以是癌细胞或已经发生癌症或存在癌细胞的组织。

提供分析癌症预后所必需的信息的方法基于以下事实：癌细胞中KIRREL3、CNTN4和CD351中的一种或多种的较低的活性或表达可以增加T细胞活性和增殖，从而提高癌症治疗效果。

本文中使用冠词“a”和“an”是指冠词的语法宾语的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“成分”是指一种成分或多种成分。本文中使用术语“A、B和/或C”是指A，或B，或C，或A和B，或A和C，或B和C，或A、B和C。

附图说明

图1示出了KIRREL3抑制的CD4+T细胞的增殖(％)。

图2示出了KIRREL3抑制的CD8+T细胞的增殖(％)。

图3示出了CNTN4抑制的CD4+T细胞的增殖(％)。

图4示出了CNTN4抑制的CD8+T细胞的增殖(％)。

图5示出了CD351抑制的CD4+T细胞的增殖(％)。

图6示出了CD351抑制的CD8+T细胞的增殖(％)。

图7a、7b、7c和7d示出了，当用KIRREL3抑制剂处理肺癌细胞系A549和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图8a、8b、8c和8d示出了，当用KIRREL3抑制剂处理结肠癌细胞系HCT-116和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图9a、9b、9c和9d示出了，当用KIRREL3抑制剂处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图10a、10b、10c和10d示出了，当用KIRREL3抑制剂处理胃癌细胞系MKN-74和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图11a、11b、11c和11d示出了，当用KIRREL3抑制剂处理白血病细胞系U937和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图12a、12b、12c和12d示出了，当用CNTN4抑制剂处理肺癌细胞系A549和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图13a、13b、13c和13d示出了，当用CNTN4抑制剂处理结肠癌细胞系HCT-116和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图14a、14b、14c和14d示出了，当用CNTN4抑制剂处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图15a、15b、15c和15d示出了，当用CNTN4抑制剂处理胃癌细胞系MKN-74和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图16a、16b、16c和16d示出了，当用CNTN4抑制剂处理白血病细胞系U937和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图17a、17b、17c和17d示出了，当用CD351抑制剂处理肺癌细胞系A549和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图18a、18b、18c和18d示出了，当用CD351抑制剂处理结肠癌细胞系HCT-116和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图19a、19b、19c和19d示出了，当用CD351抑制剂处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图20a、20b、20c和20d示出了，当用CD351抑制剂处理胃癌细胞系MKN-74和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图21a、21b、21c和21d示出了，当用CD351抑制剂处理白血病细胞系U937和PBMC时，PBMC的细胞毒性(％)。

图22示出了用KIRREL3抑制剂处理的小鼠中肿瘤的大小。

图23示出了用CNTN4抑制剂处理的小鼠中肿瘤的大小。

图24a、24b和24c示出了用CD351抑制剂处理的小鼠中肿瘤的大小。

实施例

在下文中，将参考实施例进一步详细解释本发明构思的示例性实施方式。然而，以下实施例旨在举例说明本发明，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

这个实施例是为了确认KIRREL3、CNTN4和CD351是否抑制T细胞的增殖和活性，并确保癌细胞逃避T细胞介导的免疫系统。

将人血置入装有EDTA(或肝素)的10ml试管中，并以1:1的比例与PBS混合。将Ficoll-Paque PLUS置入50ml试管中，然后加入血液样本。离心后，收集人PBMC(外周血单核细胞)。离心所得物，并除去上清液。然后，加入RBC裂解液(1x)，移液，并在冰上保存3分钟。之后，加入50ml的10％FBS RPMI1640，并且将混合物离心以除去上清液。然后，加入FACS缓冲液，并通过离心除去上清液。随后，加入50ml的MACS缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白和2mM EDTA的PBS)，计数细胞数，并在离心后完全除去上清液。

基于50ml试管中1×10

基于2×10

重组人IgG1 Fc蛋白(Cat.No.110-HG)和重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合蛋白(Cat.No.156-B7)购自R&D系统。重组人KIRREL3 His标签蛋白(Cat.No.4910-K3)购自R&D系统。

在PBS中将7.5μg/ml或10μg/ml的每种蛋白分别与2.5μg/ml的抗CD3抗体(BioLegend，Cat.No.317325)混合。将得到的混合物在4℃下涂覆在96孔板上，并用PBS洗涤孔3次。

将实施例1.1中制备的CD4+T细胞和CD8+T细胞以2×10

用抗CD3抗体激活CD4+T细胞和CD8+T细胞72小时。CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖可以通过CFSE荧光细胞染色的程度来确认，并使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)通过流式细胞术进行分析。

重组人IgG1 Fc蛋白(Cat.No.110-HG)和重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合蛋白(Cat.No.156-B7)购自R&D系统。重组人CNTN4 His标签蛋白(Cat.No.2205-CN)购自R&D系统。

在PBS中将7.5μg/ml或10μg/ml的每种蛋白分别与2.5μg/ml的抗CD3抗体(BioLegend，Cat.No.317325)混合。将得到的混合物在4℃下涂覆在96孔板上，并用PBS洗涤孔3次。

将实施例1.1中制备的CD4+T细胞和CD8+T细胞以2×10

用抗CD3抗体激活CD4+T细胞和CD8+T细胞72小时。CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖可以通过CFSE荧光细胞染色的程度来确认，并使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)通过流式细胞术进行分析。

重组人IgG1 Fc蛋白(Cat.No.110-HG)和重组人PD-L1/B7-H1 Fc嵌合蛋白(Cat.No.156-B7)购自R&D系统。重组人CD351 His标签蛋白(Cat.No.9278-FC)购自R&D系统。

在PBS中将10μg/ml的每种蛋白分别与1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml或6.0μg/ml的抗CD3抗体(BioLegend，Cat.No.317325)混合。将得到的混合物在4℃下涂覆在96孔板上，并用PBS洗涤孔3次。

将实施例1.1中制备的CD4+T细胞和CD8+T细胞以2×10

用抗CD3抗体激活CD4+T细胞和CD8+T细胞72小时。CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖可以通过CFSE荧光细胞染色的程度来确认，并使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)通过流式细胞术进行分析。

图1和图2分别示出了CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖百分比(％)。

与用IgG1处理的对照组相比，用PD-L1处理的对照组抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。PD-L1与T细胞表面的蛋白PD-1结合，并且抑制T细胞的增殖。因此，它导致抑制T细胞攻击和杀死癌细胞的功能。

与用IgG1处理的对照组相比，用KIRREL3处理的组明显抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。并且，与用PD-L1处理的对照组类似，用KIRREL3处理的组抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。

这意味着如果通过阻断或敲减中和KIRREL3，则就可以抑制KIRREL3对T细胞增殖的抑制。因此，可以有效地实现癌症治疗。

图3和图4分别示出了CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖百分比(％)。

与用IgG1处理的对照组相比，用PD-L1处理的对照组抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。

与用IgG1处理的对照组相比，用CNTN4处理的组明显抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。并且，与用PD-L1处理的对照组类似，用CNTN4处理的组抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。

这意味着如果通过阻断或敲减中和CNTN4，则就可以抑制CNTN4对T细胞增殖的抑制。因此，可以有效地实现癌症治疗。

图5和图6分别示出了CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖百分比(％)。

与用IgG1处理的对照组相比，用PD-L1处理的对照组显著抑制CD4+T细胞的增殖，而与用IgG1处理的对照组相比，用PD-L1处理的对照组对CD8+T细胞的增殖的抑制不显著。

与用IgG1处理的对照组以及用PD-L1处理的对照组相比，用CD351处理的组明显抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。

这意味着通过阻断或敲减中和CD351，可以抑制CD351对T细胞增殖的抑制。因此，可以有效地实现癌症治疗。

这个实施例是为了确认当使用KIRREL3、CNTN4或CD351的抑制剂中和KIRREL3、CNTN4或CD351时，PBMC对癌细胞的细胞毒性能力是否增强。

将人血置入装有EDTA(或肝素)的10ml试管中，并以1:1的比例与PBS混合。将Ficoll-Paque PLUS置入50ml试管中，然后加入血液样本。离心后，收集人PBMC。离心所得物，并除去上清液。然后，加入RBC裂解液(1x)，移液，并在冰上保存3分钟。之后，加入50ml的10％FBS RPMI1640，并且将混合物离心以除去上清液。然后，加入FACS缓冲液，并通过离心除去上清液。随后，加入50ml的MACS缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白和2mM EDTA的PBS)，计数细胞数，并在离心后完全除去上清液。

在4℃下用PBS中1.0μg/ml的抗CD3抗体(BioLegend,Cat.No.317325)涂覆96孔板，并用PBS洗涤孔三次。将上述制备的PBMC与10％FBS RPMI1640混合，并以6×10

将肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HCT-116、乳腺癌细胞系MDA-MB-231、胃癌细胞系MKN-74和白血病细胞系U937分别与1μl的CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)混合，然后在37℃下保存3min。随后，将FBS加入到含有癌细胞的试管中，并在冰上保存10分钟。之后，通过离心除去上清液。向所得物中加入30ml的FACS缓冲液，移液，并离心以除去上清液。然后，加入10％FBS RPMI1640，移液，并离心以除去上清液。之后，将所得物与10ml的10％FBSRPMI1640混合，并计数细胞数。

在实施例2.1中制备的96孔板的每个含有PBMC的孔中以3×10

在实施例2.2中制备PBMC与癌细胞的混合物。这些混合物用10μg/mL的抗人KIRREL3抗体、抗人CNTN4抗体或抗人CD351抗体，或50nM的KIRREL3 siRNA、CNTN4 siRNA或CD351 siRNA培养24小时。

下表1提供了未处理的对照组和使用用于阻断KIRREL3的四种中和抗体的组1-4，并且下表2提供了未处理的对照组和使用用于敲减KIRREL3的三种siRNA的组5-7。

表1：

表2：

下表3提供了未处理的对照组和使用用于阻断CNTN4的五种中和抗体的组1-5，并且下表4提供了未处理的对照组和使用用于敲减CNTN4的三种siRNA的组6-8。

表3：

表4：

下表5提供了未处理的对照组和使用用于阻断CD351的三种中和抗体的组1-3，并且下表6提供了未处理的对照组和使用用于敲减CD351的三种siRNA的组4-6。

表5：

表6：

将PBMC和癌细胞的混合物与抗体或siRNA培养24小时后，将细胞用7-氨基放线菌素D(7-AAD；BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)染色，以检测裂解的细胞。通过使用FACSDiVa软件(BD Biosciences)测定FL-1(CFSE)和FL-3(7-AAD)染色来分析PBMC对癌细胞的细胞毒性。

对于肺癌细胞系A549，图7a、7b、7c和7d示出了用KIRREL3中和抗体或siRNA处理的结果，图12a、12b、12c和12d示出了用CNTN4中和抗体或siRNA处理的结果，并且图17a、17b、17c和17d示出了用CD351中和抗体或siRNA处理的结果。

当用KIRREL3中和抗体、CNTN4中和抗体或CD351中和抗体处理肺癌细胞系A549和PBMC时，与未处理的对照组相比，对肺癌细胞的细胞毒性显著增加，即使根据抗体类型存在或多或少的差异。进一步地，当用KIRREL3 siRNA、CNTN4 siRNA或CD351 siRNA处理时，对肺癌细胞的细胞毒性也显著增加。

使用KIRREL3中和抗体或siRNA，对结肠癌细胞系HCT-116的结果示于图8a、8b、8c和8d中，对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果示于图9a、9b、9c和9d中，对胃癌细胞系MKN-74的结果示于图10a、10b、10c和10d中，并且对白血病细胞系U937的结果示于图11a、11b、11c和11d中。

另外，使用CNTN4中和抗体或siRNA，对结肠癌细胞系HCT-116的结果示于图13a、13b、13c和13d中，对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果示于图14a、14b、14c和14d中，对胃癌细胞系MKN-74的结果示于图15a、15b、15c和15d中，并且对白血病细胞系U937的结果示于图16a、16b、16c和16d中。

另外，使用CD351中和抗体或siRNA，对结肠癌细胞系HCT-116的结果示于图18a、18b、18c和18d中，对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果示于图19a、19b、19c和19d中，对胃癌细胞系MKN-74的结果示于图20a、20b、20c和20d中，并且对白血病细胞系U937的结果示于图21a、21b、21c和21d中。

如图8a-11d、13a-16d和18a-21d所示，当抗体或siRNA中和KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种时，在结肠癌、乳腺癌、胃癌和白血病中也观察到增加PBMC的细胞毒性的结果。

这个实施例是为了确认当使用KIRREL3、CNTN4或CD351的抑制剂中和KIRREL3、CNTN4或CD351时是否抑制小鼠中肿瘤的生长。

将源自C57bL6结肠腺癌细胞的MC-38细胞系以2×10

下表7提供了未处理的对照组和使用用于敲减KIRREL3的siRNA的组8。

表7：

下表8提供了未处理的对照组和使用用于敲减CNTN4的siRNA的组9。

表8：

下表9提供了未处理的对照组和使用用于敲减CD351的三种siRNA的组7、8和9。

表9：

在所有组中，从注射MC-38细胞后的第11天开始，以5天的间隔将靶向小鼠KIRREL3、小鼠CNTN4或小鼠CD351的siRNA注射到小鼠的肿瘤中三次。具体地，按照制造商的说明将PBS中10μg siRNA和7.5μl oligofectamine(Invitrogen)混合，然后以0.5mg/kg的剂量注射到小鼠体内诱发的肿瘤组织中。

图22提供了未处理的对照组和敲减了KIRREL3的组8的小鼠中肿瘤大小的结果。图23提供了未处理的对照组和敲减了CNTN4的组9的小鼠中肿瘤大小的结果。图24a、24b和24c提供了未处理的对照组和敲减了CD351的组7-9的小鼠中肿瘤大小的结果。

在未处理的对照组中，肿瘤在发生后继续生长。与未处理的对照组相比，在敲减了KIRREL3、CNTN4或CD351的组中，小鼠中肿瘤的生长速度明显被抑制。这意味着当阻断或敲减KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种以抑制其活性或表达时，将延迟或停止癌症的发展并抑制癌症的发生。因此，可以有效地使用KIRREL3、CNTN4和CD351的一种或多种抑制剂以预防癌症。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本公开的具体实施方式的许多等同方式。所附权利要求旨在涵盖这些等同方式。

序列表

<110> 韩国亿诺生物有限公司

<120> 抗癌和免疫增强的新靶点

<130> 18570KSR

<150> US 62/652,948

<151> 2018-04-05

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