叶酸靶向关节炎部位pH敏感多功能纳米载体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种叶酸靶向关节炎部位pH敏感多功能纳米载体的制备方法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

靶向给药系统(TDDS)的研究已经成为药剂学研究热点。其特点是将药物最大限度地运送到病灶靶区,从而极大地提高了治疗效果。巨噬细胞是人体免疫系统重要细胞之一。当关节炎发生时，巨噬细胞在炎症刺激因子作用下被激活并迁移至炎症部位，进而促进炎症的发生。与正常巨噬细胞不同的是，活化巨噬细胞高度表达β-叶酸受体（Folatereceptor β，FRβ），因此炎症关节部位的巨噬细胞的累积可以作为与叶酸连接的成像和治疗药物特异性靶向位点。叶酸靶向纳米粒可以选择性的攻击病态的巨噬细胞，对正常巨噬细胞没有影响，不会造成副作用和全身毒性。

聚缩酮是Murthy等人于2005年首次合成并报道了一类新型高分子聚合物，其在中性和碱性环境下不降解，在酸性条件下会降解为易代谢的中性小分子，引起的pH值变化小，不会引发炎症反应。Murthy等首先通过缩醛反应获得了一种聚缩酮PPADK，并将其运用于药物递送系统，但其降解产物是芳香族化合物，具有潜在毒性。该课题组之后通过缩酮反应制得另一种聚缩酮PCADK，主链由缩酮单元连接而成，具有良好的生物相容性、生物降解性和pH敏感性。其降解产物为无毒中性小分子，这些降解产物已经被FDA批准为间接的食品添加剂。基于以上优点，聚缩酮有效的弥补了聚酯类材料的不足，有望成为靶向肿瘤及急性炎症部位的理想载体。聚缩酮微粒在体内的中性环境中不降解，而在酸性环境降解，能够快速的在酸性部位释放药物，使药物在正常组织中的分布量较少,减少药物的毒副作用和不良反应,实现了高效低毒的治疗策略。聚缩酮的降解产物为中性小分子，能够有效的保护蛋白和核酸药物，进而起到减少药物用量和不良反应，同时提高治疗效果的作用。

因此，本专利以新型pH敏感高分子材料聚缩酮为原料，加入由叶酸修饰的聚乳酸羟基乙酸（PLGA），制备可包载核酸的靶向关节炎部位的多功能纳米粒。这种多功能纳米粒，通过叶酸靶向，能够特异性靶向到关节炎部位的巨噬细胞；利用聚缩酮pH敏感的特点，纳米载体在病灶部位快速释放，提高了治疗效果，降低全身毒副作用；且聚缩酮降解产物为中性，对核酸起到保护作用，进而减少用量和不良反应。

发明内容

本发明提到的一种叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体，能够特异性靶向到关节炎部位的巨噬细胞；利用聚缩酮pH敏感的特点，纳米载体在病灶部位快速释放，提高了治疗效果，降低全身毒副作用；而且聚缩酮降解产物为中性，对核酸起到保护作用，进而减少用量和不良反应。

本发明提到的一种叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的制备方法，操作简便。

本发明提到的一种叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的制备方法，其特征在于将阳离子磷脂（DOTAP）通过静电作用与Mcl-1 siRNA结合，形成siRNA/DOTAP复合物，保护siRNA。

本发明提到的一种叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的制备方法，其特征在于将采用实验室自主合成的聚((环己烯86.7%，1,5-戊二醇13.3%)-1,4-二基丙酮二亚甲基酮)（PK3）作为载体，实现纳米粒的酸敏感特性，屏蔽DOTAP产生的正电荷并进一步保护siRNA。

本发明提到的一种叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的制备方法，其特征在于类风湿性关节炎（RA）炎症部位巨噬细胞表面高表达叶酸受体β，因此采用叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（FA-PEG-PLGA）作为载体，实现纳米粒的叶酸靶向性。

附图说明

图1为叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体粒径分布；

图2为叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的表面形态；

图3为叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体体外释放。

具体实施方式

本发明的具体实施方法，通过下面举例说明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。

实施例中给出的缩写：

FA-siRNA-PPNPs为乳化溶剂挥发法制备的叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体的名称

实施例1

采用改进的Bligh-Dyer法合成siRNA/DOTAP复合物：

称取2 nmol siRNA，溶于500 μL DEPC水中。称取1.25 mg DOTAP溶于500 μL DCM中。在超声条件下，将DOTAP溶液逐滴加入到siRNA溶液中，加入1.05 mL的甲醇，超声混匀。室温条件下孵育30 min，加入500 μL DCM和500 μL DEPC水，涡旋混匀，5000 rpm离心5min。吸除上层甲醇-水混合溶液，得到下层siRNA/DOTAP复合物的DCM溶液。

实施例2

乳化溶剂挥发法制备的叶酸靶向关节炎部位的pH敏感多功能纳米载体：

分别准确称取10mgPK3、10mgFA-PEG-PLGA和10mgPLGA，加入到实施例1得到的siRNA/DOTAP复合物的1mLDCM溶液，补加相同体积的丙酮，作为O相。称取2 g PVA，加入到100 mL DEPC水中，加热溶解，作为W相。将2 mL O相在超声条件下（200 W）缓慢加入到4 mLW相中，超声3 min，得到初乳。将得到的初乳加入到10 mL DEPC水中，室温条件下持续搅拌4h挥发有机溶剂，18000 rpm离心15 min，DEPC水洗涤收集纳米粒，重复3次，-40°C冷冻干燥，4°C保存。

实施例3

纳米粒的包封率测定：

采用Cy5-siRNA制备纳米粒用于包封率的测定。在纳米粒离心后，准确量取上清体积，检测上清在650/670 nm下的荧光强度，计算上清中siRNA的浓度，计算得到上清中siRNA总质量，纳米粒的包封率如表1所示：

表1缓释微粒的载药量与包封率

实施例4

纳米粒的粒径测定：

称取1 mg冻干纳米粒，重悬在1 mL DEPC水中，冰浴超声分散，采用ZS90纳米粒度电位分析仪检测纳米粒的粒度，多分散系数和电位，每个样品重复3次，粒径分布结果如图1与表2。

表2缓释微粒的粒径

实施例5

纳米粒的形态测定：

取适量的纳米粒重悬于DEPC水中，冰浴超声分散，滴加在铜网上，滤纸吸干多余的液体，用TEM电镜检测纳米粒形态，结果如图2。

实施例6

纳米粒的体外释放测定：

采用Cy5-siRNA制备用于体外释放研究的纳米粒。为了评价纳米粒在中性生理环境（pH 7.4）和酸性细胞内环境（pH 5.0–6.0的核内体，pH 4.0–5.0的溶酶体）的释放情况，选取pH 7.4 和pH 5.0 的PBS作为体外释放介质。准确称量10 mg冻干纳米粒，重悬于1 mLPBS（10 mM，pH 7.4或pH 5.0）中，装入50 kDa的透析袋中，将透析袋移到20 mL PBS（10 mM，pH 7.4或pH 5.0）中，置于37°C恒温摇床，100 rpm震荡。在预定的时间点（1 h，2 h，4 h，6h，12 h，24 h），收集1 mL体外释放液并更换等体积新鲜的相应pH值的PBS缓冲液。通过荧光分光光度计测定体外释放液的荧光强度，每个样品测定3次，结果如图3。