凋亡易感细胞的调节

技术领域

本发明是关于细胞疗法领域。

背景技术

下面列出了被认为是本文公开的主题的有关背景的参考文献：

1.Watkins et al，″Tracking the T-cell repertoire after adoptivetherapy″.Clinical&Translational Immunology 6，e140(2017).

2.Turtle et al，″CD19 CAR-T cells of defined CD4+：CD8+composition inadult B cell ALL patients″.J.Clih Invest.126(6)：2123-38(2016).

3.Lamb et al，″Ex vivo T-cell depletion in allogeneic hematopoieticstem cell transplant：past，present and future″.Bone Marrow Transpplantation52，1241-1248(2017).

4.Baccher-Allan et al，“Multiple Sclerosis：Mechanisms andImmunotherapy”，Neuron，97：742-768，(2018).

5.Mazar J，et al.Cytotoxicity mediated by the Fas ligand(FasL)-activated apoptotic pathway in stem cells.J.Biol.Chem.2009；284：22022-22028.

6.Knight JC， Scharf EL，Mao-Draaver Y.Fas activation increases neuralprogenitor cell survival.J.Neurosci.Res.2010Mar；88(4)：746-57.

7.Locke et al，″Phase 1 Results of ZUMA-1：A Multicenter Study of KTE-C19 Anti-CD19 CAR T Cell Therapy in Rcfractory Aggressive Lymphoma″.MolecularTherapy 25；1(2017).

8.Sommemneer et al，Chimeric antigen receptor-modificd T cells derivedfron defined CD8+and CD4+subsets confer superior antitumor reactivity invivo.Leukemia.30，492-500(2016).

9.Bonifant et al，″Toxicity and management in CAR T-cell therapy″.Molecular Therapy Oncolytics20；3：16011(2016).

10.Kim et al，″Human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells expresshigh levels of FLIP and are resistant to Fas-mediated apoptosis″.Stem Cells；20：174-182(2002).

11.Sprent and Tough，“T Cell Death and Memory”.Science，293(5528)：245-8，(2001).

12.Strasser et al.，“The Many Roles of FAS Receptor Signaling in theImmune System”.Immunity，30(2)：180-92，(2009)

13.Zhang et al，″Host-reactive CD8

14.Roberto et al，″Role of naive-derived T memory stem cells in T-cellreconstitution following allogeneic transplantation″.Blood，125：2855-2864(2015).

15.Nashi et al，“The Role Of B Cells in Lupus Pathogenesis”.Int JBiochem Cell Biol.42(4)：543-550，(2010).

16.Baker et al，“Memory B Cells are Major Targets for EffectiveImmunotherapy in Relapsing Multiple Sclerosis”.EBioMedicine，16：41-50，(2017).

17.Hackett et al Mol.Ther.(2010)18(4)：674-683.

18.MacDonald KP et al，“Biology of graft-versus-host responses：recentinsights”.Biol Blood Marrow Transplant.19(1)：S10-S14，(2013).

19.Graham et al.″Allogeneic CAR-T Cells：More than Ease of Access？″Cells (2018)Oct；7(10)：155.

20.Xu Y et al.″Closely related T-memory stem cells correlate with invivo expansion of CAR.CS19-Tcells and are presented by IL-7and IL-15″.Blood.(2014)；3750-3760.

本文中对以上参考文献的承认不应被推测为意指这些参考文献以任何方式与本文公开的主题的可专利性有关。

背景

多种细胞疗法产品(自体的或同种异体的，特别是在癌症治疗中)是基于细胞的异种混合物作为原料的(Watkins等人，2017；Turtle等人，2016)。目前用于降低移植细胞群体毒性的分离和富集技术可能会产生更明确的最终产物，该最终产物由于耗尽技术的非选择性特性而缺乏一些所需的生物活性(Lamb等人，2017)。这些分离技术利用了机械或表型特征，这些特征通常过于粗糙，并且不够灵敏，不足以区分细胞群体中的期望细胞和不期望细胞。需要一种新的方法来将用于制造基于细胞的产物的起始材料标准化，以获得具有明确生物活性的良好表征且可再现的最终产物。优选地，该方法将在用细胞产物治疗患者之前离体使用，以减少副作用并改善结果。

选择性耗尽细胞疗法的另一个主要目标，例如在自身免疫病治疗领域，是开发有效的治疗策略来降低活化潜能和促炎反应(Baecher-Allan等人,2018)。

细胞疗法的另一个挑战是在再生医学领域，当起始材料是异质群体时，无效细胞正在降低细胞疗法产品的效力(Mazar J,2009；Knight,2010)。

在细胞疗法中难以使用异质群体的一个实例是嵌合抗原受体遗传工程化T(CAR-T)细胞的情况。利用已被研究用于各种抗肿瘤治疗的CAR-T细胞的过继性T细胞疗法(ACT)可以提供治疗若干癌症的有效方法，因为CAR-T细胞可以被遗传工程化以特异性识别抗原性不同的肿瘤群体(参见例如Locke等人,2017)。这些基于T细胞的疗法在临床试验中显示出对高度难治性B细胞恶性肿瘤的显著前景。然而，由于在大多数报告的试验中，患者接受了包含T细胞子集的随机组合物的T细胞产品，每个患者接受了不同的治疗剂，这可能影响了T细胞疗法的疗效，并使不同患者之间和跨试验的结果比较复杂化。Riddle&Maloney小组最近在ALL患者中的研究表明，与衍生自在表型组成上不同的未选择的T细胞的产物相比，由确定的T细胞子集产生的CAR-T细胞产物可以提供均匀的效力。(Turtle等人,2016；和Sommermeyer等人,2016)。

CAR-T细胞免疫疗法代表毒性管理的主要挑战。CAR-T细胞疗法最常见的两种毒性是CAR-T细胞相关脑病综合征(CRES)和细胞因子释放综合征(CRS)，其范围从轻度到危及生命，一系列炎症症状由细胞因子升高引起，通常在细胞施用的第一周内，并在1-2周内达到峰值，并与T细胞活化和增殖有关(Bonifant等人2016)。毒性的风险限制了CAR-T细胞疗法的广泛应用。目前降低与CAR-T细胞毒性相关的毒性的医学策略包括治疗后抗炎方式。例如，抗IL6受体或IL6受体拮抗剂和皮质类固醇，这两种方式都抑制炎症反应，并且因此在与细胞疗法相关的CRS和CRES的管理中是有效的。然而，缺点是这些治疗下调了免疫应答，并且它们阻止T细胞活化和取消临床益处的潜力令人担忧。毒性管理的挑战是控制症状而不损害疗效(Bonifant等人,2016)。

另一个挑战是转导效率。转导效率受T细胞质量的影响。T细胞的活化是有效转导的先决条件，因为原代人类T细胞在体外是非分裂静止细胞。此外，接受化疗的患者的T细胞质量受到损害。T细胞功能障碍很常见，并且经常无法在制造过程期间完全逆转(Graham等人2018)。

另一个挑战涉及治疗后免疫下调。有可能在进入抑制性肿瘤微环境时，CAR修饰的T细胞将变得无效。这在开发用于实体肿瘤的CAR-T细胞疗法的尝试中尤为重要。肿瘤环境中的凋亡信号传导下调所有免疫效应细胞。

研究表明，在体内T细胞扩增、存活、持久性和抗肿瘤活性方面，成熟效应细胞诸如效应记忆T细胞(EM)是比由早期分化、不太成熟的T细胞(主要是幼稚和中枢记忆(CM))制成的CAR-T细胞有效性低的CAR-T细胞(Sommermeyer D,2016，和Xu Y,2014)。

WO2013/132477公开了用于选择凋亡信号传导抗性细胞的装置和方法，包括将免疫细胞群体暴露于凋亡诱导配体。

一般描述

在其第一个方面，本发明提供了一种用于产生富集非活化/非成熟细胞的细胞群体的方法，包括：

a.获得包含哺乳动物细胞的异质群体的生物样品；

b.将获得的哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集非活性/非成熟细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。

在另一种实施方案中，所述哺乳动物细胞选自由免疫细胞和多潜能基质/间充质干细胞组成的组。

在一种实施方案中，所述非活性/非成熟细胞是免疫细胞。

在一种实施方案中，所述非活性/非成熟细胞是幼稚免疫细胞。

在一种实施方案中，所述容器包含生理溶液和/或生长培养基，和/或自体或非自体人类血浆。

在具体实施方案中，本发明提供了一种用于产生富集幼稚免疫细胞的细胞群体的方法，包括：

a.获得包含哺乳动物免疫细胞的异质群体的生物样品；和

b.将获得的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导成熟细胞的凋亡，而幼稚细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集幼稚细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述幼稚免疫细胞是幼稚T细胞或幼稚B细胞。

在另一种实施方案中，所述生物样品选自由动员的外周血细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、富集的CD3

在一种实施方案中，所述免疫细胞对于患者是自体的或对于患者是同种异体的。

在一种实施方案中，所述容器包含生理溶液和/或生长培养基，和/或自体或非自体人类血浆。

在一种实施方案中，凋亡诱导配体被固定在容器的内表面上或容器中包含的珠或膜上。

在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由TNF-α、Fas配体(FasL)、TRAIL和TWEAK组成的组。

在一种实施方案中，与凋亡诱导配体的所述接触步骤进行在约1小时至约48小时。

在一种实施方案中，所述接触步骤进行约2小时。

在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体是FasL，并且其中所述FasL以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。

在一种实施方案中，FasL以约100ng/ml的浓度施用。

在一种实施方案中，FasL以约10ng/ml的浓度施用。

在一种实施方案中，所述成熟细胞是选自由T

在另一方面，本发明提供了通过前述权利要求中任一项的方法制备的富集幼稚T细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述富集幼稚T细胞的细胞的特征为CCR7

在另一方面，本发明提供了本发明的富集幼稚T细胞的细胞群体，用于在治疗癌症和自身免疫病中使用。

在另一方面，本发明提供了保持其活化潜能作为用于遗传修饰的先决条件的富集T细胞的细胞群体，用于在治疗癌症和自身免疫病中使用。

在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的自身免疫病的方法，包括向所述患者施用通过本发明的方法制备的富集幼稚T细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述成熟细胞是选自由记忆和浆母细胞B细胞群体组成的组的成熟B细胞群体。

在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法制备的富集幼稚B细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述幼稚B细胞的特征为CD27

在另一方面，本发明提供了本发明的富集幼稚B细胞的细胞群体，用于在治疗癌症、自身免疫病或炎性疾病中使用。

在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的自身免疫病的方法，包括向所述患者施用通过本文所述的本发明方法制备的富集幼稚B细胞的细胞群体。

在另一方面，本发明提供了治疗患有自身免疫病的方法，所述方法包括：

a.将包含T细胞和B细胞的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体接触，其中所述接触降低所述T细胞和B细胞的活化水平；和

b.向有相应需要的患者施用步骤(a)中获得的所述细胞群体。

在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，包括施用本发明的富集非成熟T细胞的细胞群体，其中所述细胞保持其抗癌活性。

在另一方面，本发明提供了一种用于产生CAR-T细胞的方法，包括：

a.从生物样品分离单个核细胞；

b.通过使所述细胞与至少一种T细胞活化剂接触来活化所述细胞；和

c.用CAR构建体转导所述细胞；

其中所述方法还包括在活化步骤(b)之前和/或转导步骤(c)之后，使所述细胞与凋亡诱导配体接触，从而获得CAR-T细胞。

在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。

在一种实施方案中，所述生物样品选自由外周血单个核细胞(PBMC)、富集的CD3

在一种实施方案中，所述细胞是PBMC。

在一种实施方案中，所述T细胞活化剂是抗CD3和抗CD28抗体。

在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由FasL、TNF-α、TRAIL和TWEAK组成的组。

在一种实施方案中，与凋亡诱导配体的所述接触步骤进行在约1小时至约48小时。

在一种实施方案中，所述接触步骤进行约2小时。

在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体是FasL，并且所述FasL以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。

在一些实施方案中，FasL以约10ng/ml、50ng/ml或100ng/ml的浓度施用。

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并例示如何可在实践中实行本文公开的主题，现在将仅通过非限制性示例的方式，参考附图来描述实施方案，在附图中：

(H-N)是显示Fas-L处理的细胞的早期凋亡水平的图，通过使用膜联蛋白V

(O)和(P)是显示使用流式细胞术在FasL处理的辅助性T细胞(CD4

具体实施方式

本发明基于令人惊讶的发现，即免疫细胞的异质群体，例如从人类供体的G-CSF动员的外周血样品获得的细胞，暴露于凋亡诱导配体Fas-L，导致样品中存在的细胞的组成和活化状态的改变。特别是，受处理影响的细胞是成熟的、凋亡易感的T细胞亚型、B细胞和骨髓细胞，所有这些细胞表达不同水平的Fas(CD95)受体。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，可能由TNF超家族成员的特异性受体(包括例如FasL(术语FasL和Fas-L在本文中可互换使用)、TNFα、TRAIL、TWEAK)介导。这些受体在多种细胞群体中表达，主要是在成熟的活化细胞中，其中这些特异性受体的表达与受控的细胞死亡相关，使它们成为凋亡易感细胞，而幼稚细胞是不敏感的。由于细胞内机制，尽管死亡配体受体表达，其他细胞类型可能对死亡配体诱导的凋亡具有抗性(Kim等人2002)。对诱导的细胞死亡的不同敏感性可用作选择工具。

成熟的T细胞和B细胞表达Fas受体，并且易受Fas配体的凋亡效应的影响(Sprent和Tough,2001；Strasser等人2009)。本发明提出的Fas-L处理使用这种Fas-Fas配体机制来消除这些易受凋亡影响的反应性细胞(这些细胞在健康供体血液中处于稳定状态的较低水平，以及在自身免疫患者或炎性疾病患者的血液中处于较高水平)，并从而可以减少急性、不希望的促炎反应。

本发明的发明人证明，在G-CSF动员的外周血细胞中的T细胞中，辅助性T细胞(T

此外，发明人表明，在与凋亡诱导剂(例如FasL)一起孵育的G-CSF动员的外周血细胞中，CD4

源于幼稚T细胞的T

除了T细胞，其他免疫细胞诸如B细胞和骨髓细胞也受到FasL处理的影响。

因此，本发明提供了一种通过将免疫细胞群体暴露于凋亡诱导配体来修饰混合细胞群体诸如免疫细胞群体以包含分化较低的免疫细胞(例如T细胞、B细胞和骨髓细胞)的方法。这种经修饰的免疫细胞群体可用于包括免疫细胞移植的任何方法中，其中从移植物消除凋亡易感细胞可通过减少凋亡易感细胞(例如T或B或骨髓细胞)的促炎反应来增加移植物的效用。

因此，在其第一个方面，本发明提供了一种用于产生富集非活化/非成熟细胞的细胞群体的方法，包括：

a.获得包含哺乳动物细胞的异质群体的生物样品；和

b.将获得的哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集非活性/非成熟细胞的细胞群体。

在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞的异质群体是免疫细胞的群体。所述异质群体包括凋亡抗性和凋亡易感免疫细胞，包括凋亡易感T细胞和/或凋亡易感B细胞。

如本文所用，术语“凋亡易感T细胞”包括CD95

T

T

T

T

T

T

如本文使用的，术语“幼稚T细胞”包括CD95

如本文使用的，术语“凋亡易感B细胞”包括CD95

B过渡(CD27

B幼稚(CD27

B记忆细胞(CD27

B浆母细胞(CD27

在一种实施方案中，所述容器由生物相容材料制成。在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体被固定到容器的内表面。

根据另一种实施方案，所述凋亡诱导配体被固定到容器内存在的珠的表面。

根据另一种实施方案，容器选自由袋、柱、管、瓶、小瓶和烧瓶组成的组。

在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由TNF-α、Fas配体(FasL)、TRAIL和TWEAK组成的组。

在具体的实施方案中，凋亡诱导配体是Fas-L。

现有的过继细胞疗法技术使用修饰的、活化的或工程化的自体细胞。基于自体的疗法的局限性之一是需要为每个个体患者生成肿瘤特异性淋巴细胞，这在技术上和经济上都具有挑战性。然而，同种异体过继移植面临着移植物抗宿主病(GvHD)的危险。预先选择施用的活化T细胞以减少引起GvHD的细胞，可以导致肿瘤特异性治疗，而没有肿瘤外损伤的风险。

因此，在一种实施方案中，本发明的方法可用于制备表达重组B细胞抗原受体的自体细胞群体，例如CAR-T细胞移植，同时降低高水平释放细胞因子的风险。

在另一种实施方案中，本发明的方法可用于制备表达重组B细胞抗原受体的同种异体细胞群体，例如CAR-T细胞移植，同时降低细胞因子高水平释放的风险，并且另外减轻GvHD的风险。

在另一种实施方案中，本发明的方法可用于减少具有自身反应性的引起炎症的细胞，诸如在T细胞介导的自身免疫性和炎性疾病中，包括但不限于多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性糖尿病、1型和2型糖尿病、SLE(系统性红斑狼疮)、重症肌无力、进行性系统性硬化、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、原发性胆汁性肝硬化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、关节炎状况、关节发炎、湿疹、炎症性皮肤状况、炎症性眼病、结膜炎、胃灼热、炎症引起的组织坏死、特应性皮炎、乙型肝炎抗原阴性慢性活动性肝炎、气道炎症、哮喘和支气管炎。

在一种实施方案中，本发明的方法可用于通过减少促炎性TH1和TH17群体来降低免疫活性，这两种群体已知会提高自身免疫性多发性硬化(MS)中的自身免疫反应(Baecher-Allan等人,2018)。也就是说，根据本发明的一种实施方案，MS患者的外周单个核细胞被暂时去除，用凋亡诱导配体(例如FasL)处理，导致自身免疫负荷降低，并无自身反应克隆地(clean from autoreactive clones)重新移植到患者体内。

在另一种实施方案中，本发明的方法可用于减少自身免疫病诸如但不限于红斑狼疮(Nashi等人,2010)、多发性硬化(Baker等人,2017)中产生自身抗体的B细胞或B细胞抗原呈递。

在一种实施方案中，本发明的方法可用于在再生医学中使用祖细胞，诸如多潜能基质/间充质干细胞、神经祖细胞和内皮祖细胞，以改善由于施用选定群体而导致的结果。

在另一种实施方案中，本发明的方法可用于促进使用双脐带血作为造血干细胞移植的方法，即降低GvHD和一个脐带血单位的细胞对另一个的交叉攻击。

在另一种实施方案中，获得供体细胞的异质群体(例如，从健康、知情同意的干细胞供体的单采物获得的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)动员的外周血细胞)。将细胞与凋亡诱导配体(例如Fas配体)一起孵育。例如通过一个或更多个洗涤步骤从细胞培养物除去FasL。在一种实施方案中，不执行进一步的分离步骤。

在某些实施方案中，与凋亡诱导配体(例如FasL)的孵育可以在表面附着有FasL的装置中进行。

本发明公开了一种用于产生细胞群体的方法，凋亡易感细胞的特定亚型被从该细胞群体中耗尽。该方法使得能够从异质细胞群体中同时阳性选择支持移植的免疫细胞、期望的活性诸如抗肿瘤活性、支持组织再生的细胞和阴性选择具有有害作用诸如释放威胁生命水平的细胞因子的细胞、针对自身抗原的细胞、在引起移植物抗宿主病(GvHD)中起关键作用的细胞、具有引起炎症的特征或其他作用的细胞。

免疫细胞群体包括凋亡信号传导抗性细胞和凋亡信号传导敏感性细胞。该方法包括提供包含异质细胞群体的样品，将细胞与凋亡诱导配体一起孵育，从而从样品去除对凋亡更敏感的细胞(例如成熟效应细胞)，并富集凋亡信号传导抗性细胞(例如幼稚T或B或骨髓或CD34细胞或其他祖细胞)的群体。

描述了制备细胞群体的方法，所述细胞群体诸如遗传修饰的T细胞，例如表达嵌合抗原受体的T细胞，或一些其它活化的T细胞，并且具有较低的毒性和GvHD或其他毒性活性。该方法需要使细胞与凋亡诱导配体接触，例如在治疗性细胞制备的各个步骤期间，例如在培养和扩增表达重组抗原受体的T细胞群体之前或之后。

嵌合抗原受体(CAR)是一种重组生物分子，可特异性地结合靶细胞的细胞表面上存在的靶分子，例如B细胞上的CD19抗原。CAR分子的非限制性实例包括嵌合T细胞受体、人工T细胞受体或遗传工程化受体。这些受体可用于将单克隆抗体或其结合部分的特异性赋予所需细胞，例如T细胞。CAR可以结合抗原和转导T细胞活化，独立于MHC限制。因此，CAR是“通用的”免疫受体，可以治疗抗原阳性肿瘤的患者群体，而不论他们的HLA基因型。使用表达肿瘤特异性CAR的T淋巴细胞的过继免疫疗法可以是用于治疗癌症的强有力的治疗策略。

CAR编码序列可以通过本领域已知的任何方法产生，尽管优选地使用重组DNA技术产生。编码嵌合受体的若干区域的核酸可以通过本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。所得的编码区优选地插入表达载体，并用于转化合适的表达宿主细胞，优选地T淋巴细胞。使用病毒或非病毒转染载体将基因插入宿主基因组有若干可用的技术。例如，核酸可以注射穿过细胞的核膜直接进入细胞核中，或者使用病毒载体向细胞施用以产生遗传修饰的细胞。

用病毒载体转染是用于产生遗传修饰的细胞诸如T细胞的常用技术。这项技术被称为病毒转导。使用本领域熟知的方法，使用病毒诸如慢病毒或腺病毒或质粒作为载体，将核酸导入细胞。

外周血单个核细胞以及富集的T细胞群体(例如CD4+和CD8+T细胞)可以通过各种方法分离，用CAR表达载体转导，并通过本文所述的方法培养。

如本文使用的，术语“CAR-T”或“CAR-T细胞”是指用CAR构建体转导的T细胞。

如本文使用的，术语“CAR构建体”是指包含编码所需CAR的基因的载体，任选地还包含表达所述基因所需的另外核酸序列，并且任选地还包含编码用于增强CAR功能的辅助分子的另外组分。

如本文使用的，术语“单个核细胞(mononuclear cells)”是指任何具有圆形细胞核的血细胞。这些细胞由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞(monocytes)组成。术语“外周血单个核细胞”是指在外周血中发现的单个核细胞。

可以使用本领域熟知的方法从全血分离PBMC，例如使用ficoll(一种分离血液层的亲水性多糖)和梯度离心，其将血液分成具有血小板的顶层血浆、随后是一层单个核细胞和底层多形核细胞(诸如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞。

例如，可以通过梯度分离、淘析或亲和纯化从外周血分离T细胞。将细胞与凋亡诱导配体一起孵育，并且因此细胞群体向更不成熟的状态转移。然后，可以用例如指导CAR(例如CD19或HER2特异性CAR)表达的SIN慢病毒载体转导细胞。遗传修饰的T细胞可以在体外扩增，并且然后冷藏保存(cryopreserved)或新鲜提供以立即使用。可选地，T细胞可以用例如指导CAR(例如CD19或HER2特异性CAR)表达的SIN慢病毒载体转导，然后用凋亡诱导配体孵育细胞，并且从而细胞群体向更不成熟的状态转移。所选的遗传修饰的T细胞可以在体外扩增，并且然后冷藏保存或新鲜提供以立即使用。

如以下实施例所示，在用抗CD3/CD28抗体活化前，外周血单个核细胞暴露于FasL导致选择具有更高潜力被有效转导成CAR-T细胞的细胞，如通过表达CAR的细胞的数量和通过这些细胞暴露于靶抗原时分泌的IFNγ水平测量的。

因此，在CAR-T产生的程序期间(并且特别是在细胞活化步骤之前)暴露于FasL的步骤可以导致转导的改善，特别是但不限于自体CAR-T移植的情形，其中转导效率受损，例如由于以前的化疗治疗。

此外，如以下实施例所示，转导后FasL处理可降低潜在的促炎性CAR T细胞及其活化状态。因此，转导步骤后暴露于FasL的步骤可导致减少细胞因子释放风暴，或减轻同种异体CAR-T移植情形中GvHD的发展。

因此，在本发明的多个方面的另一个方面，提供了一种用于产生CAR-T细胞的方法，所述方法包括：

a.从生物样品分离单个核细胞；

b.通过将细胞与T细胞活化剂(例如抗CD3/CD28抗体)接触来活化所述细胞；

c.用CAR构建体转导所述细胞，

其中所述方法还包括在活化步骤(b)之前和/或转导步骤(c)之后，使所述细胞与凋亡诱导配体接触，从而获得CAR-T细胞。

在某些实施方案中，所述方法导致获得改进的转导效率。在某些实施方案中，所述方法在同种异体CAR-T移植的情况下导致患者细胞因子释放风暴减少或GvHD减少。

在一种实施方案中，所述分离的单个核细胞是外周血单个核细胞。在一些实施方案中，所述单个核细胞富集CD3

在一种实施方案中，所述活化步骤(b)进行约1-3天的时间段。在一种具体实施方案中，所述活化步骤进行约48小时(2天)。

本文使用的术语“转导(Transduction)”或“转导(Transducing)”是指通过载体将CAR构建体转移到T细胞中、导致CAR转录物整合到细胞中的方法。常见的技术使用病毒感染、病毒载体、电穿孔、原生质体融合、转座子/转座酶系统(参见例如Hackett等人(2010))和化学试剂来增加细胞渗透性，例如磷酸钙转染。常用于基因治疗的病毒有例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒。

当根据说明书阅读时，本文公开内容中的术语应该给出它们的平实和普通含义。鉴于整个说明书，本领域技术人员将理解所使用的术语。

如本文使用的，“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或一个以上。

如本文使用的，术语“约”表示值包括误差的固有变化，例如10％的变化。

实施例

该实验用从健康、知情同意的干细胞供体的单采物获得的G-CSF(粒细胞集落刺激因子)动员的外周血细胞(MPBC)样品进行。供体在白细胞单采术前接受4-5天的G-CSF(10-12μg/kg/天)。细胞用含有EDTA的缓冲液进行两次洗涤步骤，并以100±20x10

T细胞亚型的免疫表型分析通过使用下列抗体的流式细胞术(Miltenyi)来进行：CD4、CD8、CCR7、CD45RA、LFA1、CD95、CXCR3和CCR6。使用流式细胞仪(MACSquant,Miltenyi)从样品获得数据(图1)。根据其受体表达确定了以下群体：辅助性T细胞(T

图1中描述的FasR(CD95)表达谱显示，辅助性T(T

在收集后24小时内从健康供体的单采物获得的G-CSF MPBC样品，在封闭的输注袋系统中与Fas配体一起或不与Fas配体一起孵育。简而言之，对细胞进行计数，用含有EDTA的缓冲液洗涤两次，以在CellGro SCGM培养基(CellGenix)中100±20x10

FasL处理选择性地耗尽辅助性和细胞毒性T细胞子集二者。从图2A-图2G可以看出，在与FasL一起孵育后，辅助性和细胞毒性T

如图2A-图2G所示并如下面将进一步阐述的，与凋亡诱导剂(FasL)一起孵育的MPBC显示CD4

结果表明，暴露于凋亡诱导配体Fas-1选择性地耗尽辅助性T(T

不希望被理论所束缚，这些结果表明，与凋亡诱导配体Fas-L一起孵育导致凋亡易感的成熟辅助性T细胞的消除，留下较低分化状态的亚群。

此外，用FasL预处理还显著降低了效应记忆辅助性T(TH

总的来说，这些数据表明，与目前使用的完全T细胞耗尽方法不同，FasL预处理选择性地耗尽特定亚群，并减少活化。因此，并且不希望受到理论的束缚，看起来用凋亡诱导配体诸如FasL处理导致凋亡易感性成熟T细胞的消除，留下分化状态较低，较不活化并维持抗炎性的T细胞亚群。

接下来，在活化的T细胞亚型中评价CD25受体(细胞活化的标志物)的表达水平。从FasL预处理的MPBC和MPBC对照分离T细胞，并与抗CD3/CD28活化珠一起孵育1或2天。如图3A-图3B所示，并且与上述结果一致，活化后第1天和第2天，与对照T细胞相比，表达CD25

在这些实验中，将来自MPBC对照和与Fas-L一起孵育的MPBC的分离的T细胞计数并以0.75×10

重要的是要注意，如上数据所示，凋亡易感性成熟细胞的消除以及活化状态的降低不会影响T细胞群体的其他属性。图4显示，MPBC的FasL处理不影响移植物抗白血病活性(参见下面实施例4中的细节)。

Fas-L处理的MPBC或对照细胞通过在24孔板中以1x10^6个细胞/ml的浓度在补充30μg/ml抗CD3(eBioscience,16-0037,OKT3)和1000U/ml重组IL2(hr-IL-2R&D systems,202IL-500)的完全RPMI培养基(含有10％FCS、1％L-谷氨酰胺、0.2％β-巯基乙醇、1％Pen/Strep、1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸)中孵育而扩增。在第4天，用完全新鲜的培养基(含有抗CD3和IL-2)替换培养基，并且计数细胞，并将细胞以5x10^6个细胞/ml重新接种在6孔板中。对细胞进行计数，并且每隔一天更换培养基。在扩增的第12天，将两种不同类型的白血病细胞系MV4-11和U937细胞用2μM CFSE(eBioscience,65-0850)标记，并以2x10^4/100μl接种在96孔板的完全RPMI中。

将扩增的Fas-L处理的MPBC或对照细胞洗涤、计数，并以高浓度与标记的白血病细胞一起(MPBC:白血病细胞比率为1:1、1:5、1:10和1:30)共同培养过夜。在孵育结束时，用碘化丙锭对细胞进行染色以检测死亡细胞，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)分析活的CFSE-白血病细胞的数量；数据使用BD CellQuest软件(version3.3；BD Biosciences)分析(图4A-图4B)。

此外，MPBC杀死白血病细胞的能力也使用体内小鼠模型进行了评价。在该模型中，MV4-11白血病细胞在第0天被给予γ-辐射的NSG小鼠(10x10

除其他以外，T细胞的同种反应性取决于作为抗原呈递细胞的骨髓细胞(树突细胞和单核细胞)以及B细胞的抗原呈递(MacDonald等人,2013)。除了T细胞群体，APC也表达CD95，并也暴露于FasL，因此，我们假设它们可能起作用并有助于降低GvHD。对未处理的MPBC中CD95表达的评估显示B细胞群体中的中等水平，以及骨髓细胞中的高水平(图5A)。在FasL处理的MPBC中，检测到B细胞和骨髓细胞二者的凋亡细胞百分比显著升高(图5B)，这分别与两种细胞群体中负责抗原呈递的MHC II类细胞表面受体HLA-DR的0.36倍(P<0.001)和0.62倍(P<0.0001)的显著降低相关(图5C-图5D)。图3D描述了体内实验的结果，显示在第3、7和14天，FasL处理的MPBC移植小鼠的脾中人类T细胞数量显著减少。在这些FasL处理的MPBC移植小鼠的脾中进一步发现了显著低数量的人类B细胞和人类骨髓细胞(图5E-图5F)，其表达极低水平的HLA-DR

使用抗CD95抗体(Miltenyi)在B细胞亚型中测量MPBC对照细胞的FasR(CD95

图6显示了与FasL一起孵育2小时后和在对照细胞中的FasR表达水平(A)、早期凋亡细胞的百分比(B)和B细胞亚型的百分比(C)。从图6A可以看出，与过渡/幼稚细胞(早期分化的B细胞)相比，浆母细胞B细胞亚型(B细胞的最成熟亚型并在其表面表达FasR)的比例最高。与高FasR表达一致，该群体在与FasL一起孵育后显示最强的早期凋亡信号(图6B)。其他B细胞亚型也受到FasL处理的影响，因为早期凋亡细胞的百分比升高，并且在FasL处理后群体减少(图6C)，这表明在上述所有B细胞亚型中存在凋亡易感B细胞。

将人类MSC在培养基中保持其原始的未分化状态，并在其达到融合后传代。为了评估FasL对MSC的影响，将细胞以5×10

测试在有或没有FasL的培养物中生长的人类MSC在体内对GvHD的减轻。NOD.SCIDIL2Rg

如前述实施例所示，在G-CSF动员的外周血细胞与凋亡介质Fas配体(FasL)一起短暂孵育(例如2小时)后，T细胞的组成发生了改变。FasL处理降低了

因此，进行以下实施例以测试在CAR-T细胞制造过程中联合FasL是否可以减少潜在的细胞因子释放综合征(CRS)，提高嵌合抗原受体转导效率，并保持或甚至有助于CAR-T细胞的存活和抗肿瘤活性。

I.

以下实验是一项初步研究，旨在确定外周血单核细胞(PBMC)样品中诱导T细胞凋亡的FasL浓度范围、分化和对活化潜能的影响。

在Ficoll梯度上从血沉棕黄层分离外周血单个核细胞(PBMC)。在活化细胞之前或之后，用递增剂量的FasL处理PBMC。在涂有抗CD3/CD28抗体的24孔培养皿中进行活化。检查的FasL浓度为0、1、5、10、25、50或100ng/ml FasL。

分析了三组细胞：

1)用浓度为1-100ng/ml的FasL(MegaFasL Adipogen)孵育2小时的细胞。

2)用浓度为1-100ng/ml的FasL(MegaFasL Adipogen)孵育2小时，然后用抗CD3/CD28抗体活化48小时的细胞(用FasL孵育2小时+活化48小时)。

3)最初用抗CD3/CD28抗体活化48小时，并且然后用FasL孵育2小时的细胞(活化48小时+用FasL孵育2小时)。

接下来，使用流式细胞术分析每组细胞。

基于这些结果，描绘了FasL的浓度范围。

II.测试FasL在CAR-T细胞制造过程期间的不同阶段的作用

在Ficoll梯度上从血沉棕黄层分离PBMC。在涂有抗CD3/CD28抗体的24孔培养皿中进行活化。细胞在CAR-T细胞制造过程期间的不同阶段用FasL处理：在活化前(第1组)、活化后(第2组)和CAR-T转导后(第3组)，在这种情况下用ErbB2 CAR。FasL以0ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的浓度来使用。根据标准程序用慢病毒载体进行CAR-T转导(参见例如Zhang等人2017Biomark.Res.5:22；Fesnak等人Nature Protocols,Stem cell Technologies"Production of chimeric antigen receptor T cells")。

在CAR转导过程结束时(孵育10天后)，评价以下参数：生存力(7AAD

此外，通过将每个处理组的T细胞与靶抗原一起孵育进行特异性测定(人类肿瘤细胞系：MDA-MB-231)。ErbB2-CAR-T细胞识别肿瘤细胞，并引发促炎反应，在此期间细胞向培养基中释放IFNγ。收集培养基，并使用ELISA评价IFNγ水平。

这一实验结果表明：

与标准CAR-T相比，在活化前将细胞暴露于FasL导致了CAR转导的改进(图8)。在本实验中，0ng/ml FasL(无FasL)样品给出了高的转导背景。

CAR转导后暴露于高浓度FasL(50-100ng/ml)，导致与50ng/ml FasL一起孵育的细胞中的细胞死亡增加(活的转导细胞减少)。转导后用100ng/ml FasL处理后，没有细胞存活(图8)。

对CD4

在转导ErbB2-CAR-T细胞后，将这些细胞与其靶肿瘤细胞(MDA-MB-231人类细胞系)共培养。与标准CAR-T和活化后暴露于FasL的细胞相比，活化前暴露于FasL的细胞分泌高水平的IFNγ(图9)。INFγ分泌的增加表现为与FasL浓度的增加有关(图9)。通过GFP

总结以上结果，活化前FasL处理导致更好的CAR转导(图8)。结果显示，与标准CAR-T相比，该组的GFP

CAR转导的改进也反映在测量CAR-T细胞由其靶肿瘤细胞的刺激的测定中。与标准CAR-T和活化后暴露于FasL的细胞相比，活化前暴露于FasL并与其靶细胞一起孵育的细胞分泌高水平的IFNγ(图9)。INFγ分泌的增加表现为与FasL浓度的增加有关(图9)。

这些结果表明，在活化步骤之前与FasL一起孵育可能对CAR-T细胞的转导效率和对CAR-T细胞对抗原的响应增加具有有益的作用。

III.测试CAR-T细胞转导后低浓度FasL的影响

用不同浓度的Fas(0、1、10、50ng/ml)孵育转导的CAR-T细胞2小时。在用FasL处理后，在分析前，将CAR-T细胞在IL-2的存在下再孵育4天，以进一步恢复。

染色小组包括T细胞亚型(幼稚/CM/EM/eff细胞)，以及导致促炎反应恶化(在CRS和GvHD期间)的分泌IFNγ和IL17的TH1、TH17和TC1促炎亚型的另外小组。

与实验II中获得的结果相似，在转导后用10ng/ml和50ng/ml的FasL处理CAR-T细胞导致转导细胞(GFP