畜牧饲料添加剂

技术领域

本发明涉及畜牧饲料添加剂以及相应的食物产品，其有助于在热应激下培育动物。

背景技术

畜牧学添加剂通常用于提高动物膳食的营养价值。该类添加剂尤其包括酶和某些植物源的(phytogenics)。植物源(植物衍生的、天然的、植物学的)饲料添加剂是由特定的植物基原料和植物衍生的和/或矿物基载体充分混合而成的组合物。为此，可使用精油和/或植物油，以及大量高活性的草药和具有特定芳香和开胃特性的香料。

植物源产品被用作畜牧学添加剂，研发用于提高动物的品质，例如改善家禽的健康和/或用于生产可获利的家禽产品，特别是用于育肥和产蛋。植物源产品被认为是合成产品的天然替代品，而合成产品正是消费者想避免的，包括饲料制造商、预混者和动物生产者也想避免合成产品。

目前在欧盟，欧洲议会和理事会在2003年9月22日作出的第1831/2003号法规(EC)中关于动物营养添加剂的修订本正在完善。目前，法例在第6条规定了提到的5类饲料添加剂：

1.饲料添加剂应根据其功能和性质，按照第7、8和9条规定的程序，分为以下类别中的一种或多种：

(a)技术添加剂：任何为技术目的而添加到饲料中的物质；

(b)感官添加剂：任何物质，其添加到饲料中可改善或改变饲料的感官性质，或动物源食品的视觉特性；

(c)营养添加剂；

(d)畜牧学添加剂：任何用于对健康动物的品质产生有利影响或用于对环境产生有利影响的添加剂；

(e)抗球虫剂(coccidiostat)和组织滴虫抑制剂(histomonostat)。

在修订后的法规中，计划引入一个新的(d)子类别，专门用于改善动物福利的饲料添加剂。

由于世界人口的急剧增长，目前估计到2050年人口将达到近100亿，对动物源食品的需求将在目前的基础上增加40％。人口增长和蛋白质需求增长的最大份额将发生在亚洲、非洲和拉丁美洲的新兴工业化国家。其中许多国家都是热带气候和湿热带气候。

在这些气候条件下，密集饲养的畜牧物种会受到热应激的影响。

例如，在家禽中出现的热应激典型症状表现为以下症状：

i.采食量减少和摄水量增加

ii.运动和产蛋减少

iii.呼吸频率强烈增加(每分钟喘息高达250次)，并且喘息以刺激蒸发带来的热损失

iv.血液中CO

v.这些代偿机制的线粒体活性(＝总代谢率)显著增加

vi.在相对湿度>50％的情况下，通过蒸发冷却几乎不可行，导致发病率和死亡率增加

在最近的文献中，动物在热应激下的品质下降和一般发病率增加与肠道屏障完整性受损有关。肠道屏障由多层组成，可防止微生物入侵。肠腔含有抗菌肽(AMP)、分泌型免疫球蛋白A(IgA)和共生细菌，共生细菌通过竞争性抑制和产生丁酸盐等(具有屏障保护性能)来抑制病原体的定植。粘液层覆盖在肠表面，提供物理屏障。上皮层由单层上皮细胞组成，由小膜蛋白封闭，称为紧密连接蛋白，例如紧密连接蛋白(claudin)、闭合蛋白(occludin)和紧密粘连蛋白(zona occluden)(ZO1)，防止有害分子和病原体经细胞旁通道进入。该层还含有上皮内淋巴细胞、M细胞、产生粘液的杯状细胞和产生细菌素的潘氏细胞。固有层含有大量免疫细胞，包括固有免疫系统和适应性免疫系统的免疫细胞。

假设在热应激条件下，特别是紧密连接蛋白受损的情况下，更容易导致生物体暴露于致病菌及其促炎细胞壁脂多糖和其他有毒病因(

Pearce等人(2013A)描述了暴露于热应激的生长期猪，其血清内毒素水平增加以及肠道热休克蛋白表达量增加。在热应激下，可以观察到在细胞水平上，热休克蛋白(HSP)水平升高。HSP是介导细胞保护的分子伴侣，通过维持适当的蛋白质折叠，释放生存信号和保持细胞骨架的完整性。Pearce等人(2013A)指出，HSP在维持紧密连接(TJ)蛋白的定位方面起着重要作用。为了补偿不可逆损伤的紧密连接分子的损耗，在热应激下观察到它们的基因和蛋白质表达均上调。因此，任何对肠道屏障功能的损害都伴随着对动物福利、动物健康和动物品质的实质性损害。

肠道屏障的缺陷可通过跨上皮电阻(TEER)的降低或诸如异硫氰酸荧光素右旋糖酐(FITC右旋糖酐)等大分子通透性的增加来测量(Pearce等人，2013B)。

柑橘类水果，包括橙、葡萄柚、柠檬、酸橙、红橘和柑桔，都属于最常见的培育水果。为了满足消费者日益增长的需求，全球产量也在逐年增加。柑橘加工业产生大量的废物。柑橘皮废料几乎占了湿果质量的50％。柑橘类废料具有很高的经济价值，因为它富含各种类黄酮、类胡萝卜素、膳食纤维、糖、多酚、精油和抗坏血酸，以及大量的一些微量元素(Sharma等人，2017)。柑橘类水果含有一定量的黄酮类化合物。但是，葡萄柚和蜜柚的果肉和果皮中主要含有苦味黄酮类化合物柚皮苷(naringin)，而橙和柠檬中的黄酮类化合物主要是橙皮苷(hesperidin)。两种黄酮类化合物均以糖苷(橙皮苷和柚皮苷)的形式存在于上述柑橘类水果中，并以各自的糖苷配基(橙皮素(hesperitin)和柚皮素(naringenin))的形式存在(Suntar等人，2018)。

以下方案(方案1，Suntar等人，2018)概述了柑橘类水果中含有的主要黄酮类化合物：

方案1：酸橙(C.aurantium)中含有的主要黄酮类化合物的化学结构

在CaCo2细胞中可以看到橙皮苷和橙皮素，糖苷配基橙皮素能有效地吸收到小肠的肠上皮细胞中。随后，游离橙皮素或橙皮素结合物都可以进入血液循环。糖苷橙皮苷在大肠主要被分解为芦丁醇和橙皮素，然后可以进入结肠上皮细胞以及，如上文所述，进入血液循环。橙皮苷和橙皮素的代谢和吸收已为人们所熟知(Brand等人，2008)。

总的来说，黄酮类化合物已知可以通过上调内源性抗氧化酶系统介导细胞保护作用。橙皮苷和柚皮苷两者均显示出对抗氧化酶具有上调作用，这种调控作用依赖于以转录因子Nrf2作为主调控器(Zhu等人，2017，Chen等)。

柚皮苷通过上调热休克蛋白，协助缺血应激大鼠心肌修复机制的启动(Rani等人，2013)。将化学纯化的橙皮苷以20mg/kg的日粮水平，单独或者与染料木素组合施给热应激的肉鸡，可以观察到对胸肌中的热休克蛋白70产生了差异性调控(Kamboh等人，2013)。但是，由于橙皮苷的施用下调了热休克蛋白70的表达，该研究的结果存疑。相反，特定物质对热休克反应的上调表明有助于修复机制。

研究证明，在CaCo2细胞单层中，橙皮苷和柚皮苷在非应激条件下都有助于维持肠道屏障完整性(Noda等人，2012)。目前还没有关于柑橘黄酮类化合物，特别是柚皮苷在热应激条件下对具有肠道屏障功能保护作用的研究报道。

唇形科(Lamiaceae family)是一个重要的草本科，包含了多种具有生物学和医学应用的植物。该家族最有名的成员是各种芳香品种，例如百里香、薄荷、牛至、罗勒、鼠尾草、香薄荷、迷迭香、夏枯草、牛膝草、香蜂草，以及其他使用较为有限的品种。

牛至属(Origanum Genus)。牛至是唇形科下的草本多年生植物和亚灌木，原产于欧洲、北非和亚洲温带。一些品种也移植到北美和其他地区。植株具有强烈芳香的叶片和丰富的管状花，并具有持久的彩色苞片。所述属包括野马郁兰(Origanum vulgare L.)或甘牛至(common marjoram)，和马郁兰(Origanum majorana L)或甜马郁兰。

野马郁兰(Origanum vulgare)。野马郁兰(O.vulgare)是一种芳香、木本的多年生植物，原产于地中海地区(葡萄牙和安达卢西亚)、欧洲(包括不列颠群岛)、南亚和中亚的石质斜坡和岩石山区。牛至油中主要成分(萜类化合物)为：香芹酚(多达70％)、萜品烯-4-醇(26％)、顺式桧烯(13.3％)、邻伞花烃(9.3％)、γ-萜品烯(5.8％)、反式桧烯(5.7％)、对-薄荷-1-烯-8-醇(p-menth-1-en-8-ol)(5.1％)、b-侧柏烯(4.9％)、α-萜品烯(3.5％)。

在传统民间医药中，牛至可用于治疗多种疾病。所报告的有益效果包括抗痉挛、抗菌和助消化等特性。

百里香属(Thymus Genus.)。百里香属是唇形科的一部分，包括350多种常绿芳香植物。在地理上，这些植物的分布延伸到亚洲、北非和欧洲。虽然出于烹饪或观赏的用途培育了不止一种，但百里香(Thymus vulgaris)是研究最为广泛的品种。百里香品种用于传统医药已经有数千年的历史，其展示出了广泛的治疗性能，包括抗菌、抗炎，甚至其芹菜素成分还具有抗癌作用。

百里香。GC-MS和GC-FID分析揭示了一种银斑百里香(Thymus vulgaris L.)精油中的主要活性成分为百里酚(41.0％)、香叶醇(26.4％)、侧柏醇(42.2％顺式桧烯水合物和7.3％反式桧烯水合物)和芳樟醇(72.5％)。其他的还含有冰片和香芹酚。百里香(thyme)的化学类型是根据油的组成来确定的。地理来源和天气会影响化学类型和成分，这在一项比较来自法国两个地区和塞尔维亚两个地区的精油的研究中得到了证明，在法国两个地区中芳樟醇化学型含有76.2％芳樟醇，百里酚化学型含有47.1％百里酚，在塞尔维亚两个地区中香叶醇化学型含有59.8％香叶醇，桧烯水合物化学型含有30.8％顺式桧烯水合物。百里酚(2-异丙基-5-甲基苯酚)和5-丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是百里香的萜类化合物，已被显示出具有麻醉作用。此外，百里酚还表现出能抑制维生素K的合成，从而有可能用作抗凝剂。百里香还具有抗痉挛、抗菌、抗炎、免疫调节和抗氧化的特性，这些作用归因于挥发性百里香油中所含的百里酚。大量的研究证实了百里香通过其抗痉挛和溶粘液特性在呼吸道疾病中产生的有益效果。其他研究也表明了，它在动物模型中治疗胃肠道疾病方面所具有的潜在潜力，且不产生任何潜在毒性。

迷迭香属(Rosmarinus Genus.)。迷迭香是唇形科中一个木质属，是具有芳香常绿针状叶的多年生草本植物，原产于地中海盆地。

迷迭香(Rosmarinus officinalis)。俗称的迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)，是地中海灌木草本植物，广泛分布于欧洲、美洲和亚洲国家。它是一种常见的香料，在世界范围内用于烹饪、医药和商业用途的香精和食品工业。将迷迭香叶(新鲜或干燥)的特征性香气用于烹饪或作为草药茶少量食用，而因其具有抗氧化性能，迷迭香提取物也用于延长易腐食品的保质期。近年来，欧盟批准将迷迭香提取物(E392)作为一种安全有效的天然抗氧化剂用于食品保鲜。植物化学研究表明，叶中含有0.5％至2.5％的挥发油。迷迭香油的主要成分包括单萜烃类化合物(α-和β-蒎烯)、莰烯、柠檬烯、樟脑(10％至20％)、冰片、桉叶素(cineole)、芳樟醇和马鞭烯醇。迷迭香含有多种挥发性和芳香成分。这种植物中的黄酮类化合物包括香叶木素、香叶木苷、芫花素、木犀草素、高车前素和芹菜素。此外，迷迭香中的萜类成分包括三萜齐墩果酸、乌索酸和二萜鼠尾草酚。迷迭香中的酚类包括咖啡酸、绿原酸、唇形草鞣质酸、新绿原酸和迷迭香酸。迷迭香含有大量的水杨酸盐。近年来的药理学研究表明，迷迭香及其成分，特别是咖啡酸衍生物，例如迷迭香酸，在民族医药中具有多种传统用途，包括镇痛、抗炎、抗癌、抗风湿、抗痉挛、抗肝毒性、抗动脉粥样硬化、祛风和利胆作用(Uritu等人，2018年)。

Hosseini等人(2018年)报道，肉桂醛和百里酚的混合物在社会应激(过度拥挤应激)的肉鸡中表现出无差异的反应。在这项研究中使用了百里香油与肉桂醛的混合物。另一项针对肉鸡的研究报道了百里香油对肠道完整性的有益效果(Placha等人，2014)。百里香在动物对应激条件的总体恢复力的积极作用可能源于其通过Nrf2通路诱导内源性抗氧化反应的潜力(Kluth等人，2007；FangFang等人，2018)。牛至也存在类似的情况。Zou等人(2016,(B))报道，牛至精油有助于在猪中改善肠道形态和提高紧密连接蛋白的表达，与肠道菌群的变化有关。在

对于迷迭香，目前文献中只有一项关于热应激的研究。Türk等人(2016年)报道，采用含有125g/T和250g/T高浓度迷迭香油但不经济的完全饲料进行饲喂，减少了鹌鹑睾丸中的脂质过氧化，从而降低繁殖失败率。

在动物营养学中，改善热应激对动物健康和品质不利影响的常用策略包括：

·抗氧化维生素，特别是维生素C

·缓冲物质和电解质，以补偿损耗和碱中毒

·合成甜菜碱(N,N,N-三甲基氨基乙酸)，一种甲基供体，特别有利于维生素B12和叶酸的维生素代谢以及甲硫氨酸代谢。

甜菜碱的常规剂量为0.5至1.0kg/t饲料。

Saeed等人(2017)综述了甜菜碱在家禽业中用于应对热应激问题的应用。在甜菜碱作为一种天然抗热剂降低家禽业热应激问题的背后，尚需要对其在遗传和分子基础上的作用机制作进一步研究。

甜菜红碱是一类红色和黄色吲哚衍生色素，发现于石竹目植物中，如仙人掌(barbary)，它们取代了花青素色素。在一些高级真菌也能发现甜菜红碱，如赭红拟口蘑(Tricholomopsis rutilans)。它们通常在花瓣中尤为明显，但也会使含有它们的植物果实、叶片、茎和根着色。它们包括色素，例如在甜菜，特别是在甜菜根中发现的色素。“甜菜红碱(betalain，betal)”这个名称来源于根甜菜(Beta vulgaris)的拉丁名，“甜菜红碱”首次取自该拉丁名。甜菜、三角梅、苋菜和许多仙人掌的深红色都是由甜菜红碱带来的。其具有由红色到紫色的特别色调，这是独特且不同于大多数植物中的花青素色素的。

甜菜红碱包括两类：

1.甜菜红素(Betacyanin)，包括红色到紫色的甜菜红碱色素。植物中存在的甜菜红素包括甜菜苷(betanin)、异甜菜苷(isobetanin)、丙甜菜苷(probetanin)和新甜菜苷(neobetanin)。

2.甜菜黄素(Betaxanthin)，是呈黄色到橙色的甜菜红碱。植物中存在的甜菜黄素包括仙人掌黄质、紫茉莉黄质、马齿苋黄质和梨果仙人掌黄质。

甜菜苷是一种甜菜红碱，也叫甜菜根红，因为它可以从红色的甜菜根中提取得到。

通过与

AU2005229753A1公开了一些植物成分，通过提供营养物质来实现优化健康和预防疾病，从而改善多种疾病。为了某些目的公开了一系列不同的化学品。在抗疲劳化学品中，提到了1,8-桉叶素。所公开的抗肌肉松弛化学品的列表中，除其他外，包括1,8-桉叶素和百里酚。抗炎化学品的列表中，除其他外，包括1,8-桉叶素和柚皮苷。

US4759932公开了一种通过在饲料中添加沸石来降低动物热应激程度的方法。

US2008032021A1公开了一种家禽饲料添加剂，其包含源自草药和香料中至少一种的精油，并包含百里酚和香芹酚作为其主要成分，以及源自柠檬酸、富马酸、黄腐酸和腐殖酸中至少一种的有机酸。

Maria Miguel提供了苋科某些品种中存在的甜菜红碱的综述(Maria Miguel，2018)。

WO2017037157A1公开了一种家禽饲料添加剂组合物，该组合物是一种可流动的植物源化合物混合物，该植物源化合物包括微胶囊化的百里香精油和包含在微粒状干皂树树皮粉中的皂苷，用于提高消化率以及在育肥或产蛋或育种方面的品质。

因此需要一种改良畜牧饲料，以便在热应激下改进育种，从而有助于动物福利。

发明内容

本发明的目的是提供具有特定成分的新型畜牧饲料添加剂或饲料产品，以提高在培育中动物的抗热应激能力。

所述目的通过所要求保护的主题来解决。

根据本发明，提供了畜牧饲料添加剂，其包括1,8桉叶素和柚皮苷或甜菜红碱中的至少一种。

具体地，所述畜牧饲料添加剂包括至少1.5％1,8桉叶素(w/w)和柚皮苷或甜菜红碱中的至少一种。

具体地，饲料添加剂包括至少2％1,8桉叶素(w/w)，优选地至多(up to)5.5％或至多6％(w/w)。

具体地，饲料添加剂包括至少3％柚皮苷(w/w)，优选地至多6％(w/w)，和/或至少0.1％甜菜红碱(w/w)，优选地至多3％(w/w)。

具体地，饲料添加剂包括

a)1,8桉叶素和柚皮苷的比例为至少0.2:1(w/w)；和/或

b)1,8桉叶素与甜菜红碱的比例为至少4:1(w/w)。

具体地，1,8桉叶素与柚皮苷的比例为0.125:1、0.2:1、0.25:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.25:1中的至少任一者，优选地至多1.5:1(w/w)。1,8桉叶素与柚皮苷的优选比例为0.5:1-1.5:1(w/w)或0.5:1-1:1(w/w)的范围内。

具体地，1,8桉叶素与甜菜红碱的比例为4:1、5:1、6:1；7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、15:1、20:1、22:1、25:1、30:1、33:1、35:1、40:1、44:1、45:1、50:1、55:1、60:1中的至少任一者，优选地至多64:1(w/w)。1,8桉叶素与甜菜红碱的优选比例为10:1-30:1(w/w)的范围内。

具体地，1,8桉叶素是作为饲料添加剂的1,8桉叶素组分提供的。

具体地，柚皮苷是作为饲料添加剂的柚皮苷组分提供的。

具体地，甜菜红碱是作为饲料添加剂的甜菜红碱组分提供的。

具体地，饲料添加剂包括包含1,8桉叶素的组分，以及包含柚皮苷的组分或包含甜菜红碱的组分中的至少一种，这些组分均为植物源组分。

具体地，1,8桉叶素是作为纯的化合物或纯化的化合物提供的，或者是作为包含1,8桉叶素的芳香植物的精油提供的，例如唇形科植物的天然或自然精油，例如百里香、薄荷、牛至、罗勒、鼠尾草、香薄荷、迷迭香、夏枯草、牛膝草、柠檬香峰草等芳香香料，还有樟脑、月桂、月桂叶、茶树、甜罗勒、苦艾、迷迭香、普通鼠尾草或大麻。根据具体实施方案，上述任何植物品种的天然同一精油或者包含纯化的或纯的1,8桉叶素的人工组合物用作1,8桉叶素源。

具体地，1,8桉叶素包含在精油或非精油中，优选地在唇形科植物的精油或非精油中，优选地在迷迭香属植物的精油或非精油中。具体地，所述精油是迷迭香精油。

根据具体实施方案，精油成分不经微胶囊化。但是，根据替代的实施方案，微胶囊化的精油可用作1,8桉叶素源。具体地，将包含1,8桉叶素的精油微胶囊化。

具体地，柚皮苷是作为纯的化合物或纯化的化合物提供的，或者是作为含有类黄酮的植物产品提供的，例如源自柑橘植物的含柑橘黄酮类化合物的产品。

具体地，柚皮苷包含在柑橘类植物材料中，优选柑橘或葡萄柚，特别是柑橘果皮或果渣的植物材料中。

具体地，甜菜红碱是作为纯的化合物或纯化的化合物提供的，或者是作为含有甜菜红碱色素的植物产物提供的，例如源自甜菜的产品。具体地，甜菜红碱是甜菜苷、异甜菜苷、丙甜菜苷和新甜菜苷中的任一种或多种。具体地，甜菜红碱源自红色甜菜根。

具体地，甜菜红碱包含在石竹目(Caryophyllales order)植物的生物材料中，优选苋科植物，优选根甜菜、甜菜根或仙人掌，或真菌(例如，赭红拟口蘑(Tricholomopsisrutilans))的生物材料。

通常，饲料添加剂包括标准量和浓缩形式的组分1,8桉叶素、柚皮苷和/或甜菜红碱。

具体地，饲料添加剂包括可流动的植物源化合物混合物或由可流动的植物源化合物混合物组成，并且任选地进一步包括助剂或赋形剂。

具体地，饲料添加剂包括可流动的植物源化合物混合物或由可流动的植物源化合物混合物组成。具体地，这些植物源化合物选自由精油、碳水化合物、干草药、香料组成的组。具体地，已知混合物还包括膨胀剂、抗结块剂或其他赋形剂中的任一种或多种。

具体地，饲料添加剂还包括一种或多种精油(任选地精油为微胶囊化或游离形式)，以及干草药、香料、碳水化合物、膨胀剂或抗结块剂，或其他赋形剂。

具体地，包含1,8桉叶素的精油以及任选地本文所述的其他精油通过喷雾干燥水包油(o/w)乳液来制备。

通常，将精油与干物质均匀混合以产生饲料添加剂，该饲料添加剂是可在室温下长时间储存的干性可流动的固态油(oil in solid)(o/s)混合物或分散体。

例如，本文所述的饲料添加剂可以如此造粒，或与其他营养性饲料物质一起造粒以产生颗粒饲料产品，而在生产期间甚至在长期储存后，精油不会有明显损失。具体地，饲料添加剂或饲料产品是作为储存稳定的粉末或者可造粒或颗粒制剂提供的，其在室温下或高达25℃的温度下具有至少18个月的稳定性。在长时间储存后，饲料产品中仍然保留至少65％的精油，优选地为至少70％。

优选地，本文所述的饲料添加剂含有20-60％(w/w)干草药。在优选的干草药中有以下的粉末：白芷根、茴香、苹果、洋蓟、香峰草、伏牛花、罗勒、桦树叶、苦酸橙、黑醋栗、黑莓、蓝莓、菖蒲、决明子、雪松、洋甘菊、栗子、升麻、肉桂、香茅、三叶草、款冬、日本鬼灯檠、普通荨麻、蒲公英、莳萝、接骨木花、桉树、小茴香、龙胆、生姜、银杏、葡萄籽、葡萄子、葡萄柚、大白屈菜、绿茶、山楂、啤酒花、辣根、马尾、牛膝草、吐根、柠檬、柠檬香峰草、柠檬草、甘草、独活草、玛卡、万寿菊、马郁兰、药蜀葵、薄荷、槲寄生、艾蒿、巴西榥榥木、橡木、橄榄叶、橙、牛至、欧芹、西番莲、胡椒薄荷、松针、紫松果菊、车前草、苦木、白坚木、皂树、覆盆子叶、长叶车前草、玫瑰、迷迭香、芸香、玫瑰果、红花、鼠尾草、檀香、香薄荷、西伯利亚人参、肥皂草、圣约翰草、八角茴香、针叶林根、茶、百里香、直立委陵菜、缬草根、苦艾、蓍草或育亨宾树皮。

本文所述的饲料添加剂可进一步包括干香料，例如1-15％(w/w)，如甜胡椒、樟脑、香菜、豆蔻、辣椒、胡椒、丁香、芫荽、孜然、姜黄、胡芦巴、大蒜、杜松子、肉豆蔻、洋葱、红辣椒、胡椒或姜黄根。

还可以使用膨胀剂及抗结块剂等赋形剂，例如用量在20-60％(w/w)范围的，例如麦麸、米糠或其他谷物麸皮、变性淀粉、乳糖或右旋糖等有机源赋形剂，以及例如二氧化硅、石灰石或膨润土等无机源赋形剂。

具体地，饲料添加剂包含植物源皂苷，例如包含在微粒状干皂树树皮粉中的皂苷，优选地包含3％至10％(w/w)的量的皂苷。

具体地，饲料添加剂还包含至少一种包含香芹酚和/或百里酚的精油。

根据一个具体实施方案，包含1,8桉叶素的精油组分还包含香芹酚和/或百里酚。因此，可以使用1,8桉叶素、香芹酚和/或百里酚的混合物。

根据另一具体实施方案，使用精油混合物，其中1,8桉叶素提供在精油组分中，并且在附加精油组分中提供香芹酚或百里酚中的任一种或两种。

优选地，包含香芹酚和/或百里酚的精油是植物提取物。香芹酚和/或百里酚的合适来源是芳香植物，例如百里香或牛至。具体地，饲料添加剂包括至少0.05％或至少0.1％的香芹酚(w/w)和/或至少0.05％或至少0.1％的百里酚(w/w)。

具体地，本文所述的饲料添加剂中包含总量为4％至16％(w/w)的精油。

具体地，本文所述饲料添加剂中使用的精油是作为植物材料的精油提取物提供的。

具体地，饲料添加剂是作为储存稳定、可造粒或颗粒状的干性制剂提供的，在室温下具有至少18个月的稳定性。

具体地，饲料添加剂用于制备包含所述饲料添加剂的饲料产品，例如通过与营养物质和/或赋形剂混合来制备。具体地，饲料添加剂提供在用于制备家禽、猪或反刍动物饲料产品的制剂中。

本发明还提供了包含本文所述饲料添加剂的饲料产品。具体地，饲料产品包括浓度为至少5mg/kg或至少6mg/kg的1,8桉叶素。1,8桉叶素的优选上限为20、12或10mg/kg中的任一者。

具体地，饲料产品包含浓度为5-20mg/kg或6-18mg/kg或6-12mg/kg范围内的1,8桉叶素，特别是约(+/-2mg)10mg/kg的1,8桉叶素。

具体地，饲料产品包含浓度为至少5或10mg/kg，或至少11或12mg/kg的柚皮苷。柚皮苷的优选上限为30、24或18mg/kg中的任一者。

具体地，饲料产品包含浓度为5-25mg/kg，或12-30mg/kg范围内的柚皮苷，特别是约(+/-2mg)15mg/kg的柚皮苷。

具体地，饲料产品包含浓度为至少0.2或0.3mg/kg，或至少0.4或0.5mg/kg的甜菜红碱。甜菜红碱的优选上限为2.4、1.2或0.6mg/kg中的任一者。

具体地，饲料产品包含浓度为0.2-2.0mg/kg或0.5-1.8mg/kg范围内的甜菜红碱，特别是约(+/-0.21mg)1.7mg/kg的甜菜红碱。

具体地，饲料产品不含抗生素。

根据具体实施方案，饲料产品包括饲料添加剂，饲料添加剂的剂量(每吨饲料产品的添加剂克数)为100、150、200、250、300、400或500g/t中的至少任一者，优选地剂量为100-1000g/t，或200-500g/t的范围内，例如，至多为饲料产品的750mg/kg，或至多为饲料产品的400mg/kg，或具体是400g/t或500g/t。

具体地，饲料产品是作为预混料提供的，以生产完全饲料(用作完全膳食)，或者是作为完全饲料提供的，不需要添加其他营养物质。具体地，饲料添加剂的优选剂量(浓度)为完全饲料的200至500mg/kg，或200至400mg/kg。

例如，将饲料添加剂混合到饲料材料中，例如，磨碎的谷物，基于谷物生产酒精的副产品，如油菜籽、亚麻籽、大豆等油籽，如豆粕、菜籽粕、菜籽饼、亚麻籽粕、亚麻籽饼等油料生产的副产品，或者如鱼粉、肉粉、肉骨粉、羽毛粉、血粉等鱼类和肉类加工业副产品，水解动物源蛋白质，以及矿物预混料，优选地是颗粒化的。

具体地，饲料产品以颗粒的形式提供。

优选地，本文所述的饲料添加剂或饲料产品通过将材料压缩或模塑成颗粒形状的工艺制成颗粒。

根据具体方面，本文所述的饲料添加剂或饲料产品用于畜牧育种。

具体地，本文所述的饲料添加剂或饲料产品用于培育处于热应激风险的畜牧动物或遭受热应激的畜牧动物。

根据具体方面，本文所述的饲料添加剂或饲料产品用于提高畜牧动物中的饲料转化。具体地，提高的饲料转化通过增加的营养物消化率或降低的饲料转化率来确定，例如，利用相应的体外或体内模型进行确定。

具体地，本文所述的饲料添加剂或饲料产品可用作消化率提高剂和品质增强剂，例如，根据法规(EC)1831/2003所定义的消化率提高剂和品质增强剂，用于家禽的育肥或产蛋或育种，直至产蛋。

根据具体方面，本发明提供了培育处于热应激风险的畜牧动物或遭受热应激的畜牧动物的方法，所述方法包括饲喂本文所述的饲料产品。

根据具体方面，还提供了用本文所述的饲料产品饲养畜牧动物的方法，其中，相比于采用不含本文所述饲料添加剂的等量饲料产品进行饲养，本文所述饲料促使所述动物的一个或多个生物物理特性得到改善，特别是其中动物暴露于热应激超过至少7天或至少14天(连续热应激天数或在育种期间热应激总共天数)。热应激在本文中应理解为由于育种室温度升高而导致的状况，通常其中白天温度为28至35℃，夜间温度为22至28℃。

具体地，所述饲料使得饲料转化率得到改善。通常，所述改善是当以每千克饲料产品至少100mg或200mg的量投喂所述组合物时，在35天期间日增重优选增加(平均)至少1.0％或至少2.0％。

具体地，所述饲料产生了比商业用甜菜碱更高的生长性能效率。

具体地，当以每千克饲料产品至少100或200mg的量投喂所述组合物时，所述改善使得在至少35天的期间内，优选地，饲料转化率降低至少1.5％或至少2％。

具体地，当以每千克饲料产品至少100或200mg的量投喂所述组合物时，所述改善使得在至少35天的期间内，蛋白质消化率优选增加至少1％。添加剂的示例性剂量范围为200-400mg/kg饲料或200-500mg/kg饲料。

本文所述饲料添加剂的1,8桉叶素组分与柚皮苷组分或甜菜红碱组分相组合的非常特定的作用模式，使得能够配制以维持肠道屏障功能以及随之的动物福利、动物健康和动物品质为目标的植物源饲料添加剂、饲料产品和相应饲料。

特别地，饲料添加剂是一种植物源家禽饲料添加剂，有助于维持家禽，例如鸡(肉鸡或蛋鸡)或火鸡，猪，或反刍动物的动物福利。

具体地，本文所述的饲料添加剂或饲料产品用于在热应激条件下进行育种，旨在：

■改善品质，和/或

■改善热休克反应，和/或

■改善肠道屏障完整性。

因此，本发明是基于在唇形科植物精油的效果方面的惊讶发现，例如唇形科植物油混合物(例如，一种或多种植物或品种来源的油混合物)与柚皮苷或甜菜红碱结合对肠道细胞中热休克蛋白和热应激动物热休克反应的调节作用，以及对肠道屏障功能的维持。

附图说明

具体实施方式

在整个说明书中使用的具体术语具有以下含义。

本文中所使用的关于饲喂动物、膳食或饲料产品使用的术语“无抗生素”，是指用不含抗生素的饲料产品饲喂动物。尽管动物可能已经按照兽医处方接受过抗生素治疗，但常规膳食中不会含有额外的抗生素作为生长增强剂。由此防止在食用家禽肉或蛋的人体内积累抗生素等有害物质。本文所述组合物有效地改善了食品转化，从而取代了饲料产品中的抗生素。因此，可以提高优质肉的生产率。

在本文中，牲畜或家禽等动物的术语“生物物理特性”应理解为动物或种群的生物和非生物功能，特别包括影响其生存、发展和进化的因素，特别包括提高动物饲料转化效率的因素，例如通过体外或体内模型确定的因素。这些因素包括，例如肠膜通透性、营养物消化率、(回肠)蛋白质消化率、营养物转运、抗菌或抗氧化作用。

本文所用的“饲料转换效率”(FCE)应理解为具体是指动物将饲料质量转化为增加的体重(例如肌肉或蛋的质量)的效率的测量值。该效率可以作为饲料转化率(FCR)来确定，即在特定时间内食用的食物质量除以体重增量。例如，与食用不含这种饲料添加剂的动物相比，用设计为提高饲料转化效率的饲料添加剂饲喂的动物，其消耗的食物量更少，但产生了相似的肉量。通常地，家禽的饲料转化率为1.2至2.5，猪的饲料转化率为1.5至3.0，根据遗传品种有所不同。如果饲料转换率增加或者影响饲料转换效率的因素降低了例如至少2％，优选地至少2.5％，则可以确定饲料转换率的增加或者该因素的降低。

影响饲料转化效率的直接因素包括，例如营养物消化率、(回肠)营养物或蛋白质消化率、肠膜通透性、刷状缘膜营养物转运系统，或者间接因素包括，例如改善动物健康状况，减少对免疫反应的能量和蛋白质需求，包括抗菌作用。

在本文中术语“肠膜通透性”应理解为决定肠道吸收营养物质的因素，例如通过肠道的细胞膜。这种生物物理特性可以通过体外模型来确定，使用结直肠上皮细胞来测试与特定物质接触时的通透性变化。本文中术语“营养物转运系统”应理解为包括葡萄糖、肽和氨基酸等营养物从小肠腔穿过刷状缘膜(brush border membrane)进入肠上皮细胞的活性运输。这种营养物转运系统是特定的酶，包括钠依赖型葡萄糖转运蛋白(SGLT1)以及小肽和氨基酸转运蛋白(PEPT1)。这种生物物理特性可以通过体外模型来确定，使用结直肠上皮细胞来测试SGLT1转运酶在与特定物质接触时的基因表达变化。本文中术语“抗菌作用”应理解为指对单胃动物(包括家禽)可能致病的细菌具有可能的抑菌作用。这种生物物理特性可以通过体外模型来确定，使用细菌细胞来测试与特定物质接触时细菌细胞生长的变化。

本文中关于饲料添加剂的术语“组分”应理解为组合物的一部分，该组合物可包括一种或多种其他化合物、组分和赋形剂。本文所述的饲料添加剂是一种组合物，具体包括至少一种(精)油组分，该组分包括1,8-桉叶素，作为化合物或活性化合物，以及至少一种其他组分，包括化合物(或活性化合物)柚皮苷和/或甜菜红碱，但还可以包括生物组分，主要是植物源组分和其他赋形剂，包括例如无机赋形剂。

具体地，所述1,8-桉叶素组分是包含特定量1,8-桉叶素的精油。用作本文所用1,8-桉叶素化合物来源的示例性植物材料为百里香、迷迭香或桉树中的任一种或多种。

本文所述的油组分具体地是通过从植物材料中提取油得到的，例如通过冷萃取或热萃取技术，使用水相和任选的油相，从而获得油的油包水(w/o)乳液。

根据具体实施例，1,8-桉叶素组分按如下方式制备：在采用喷雾技术的混合器中，将精油组分以30:70或40:60或50:50或60:40(w/w)中的任一种比例喷洒在二氧化硅上并彻底混合，例如混合至少30分钟。

精油通常是从植物材料中，通过适合于含有油分的特定植物部位的移除方法来提取的。常用的提取方法有：水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、CO

根据具体方面，该制备方法采用制备水包油(o/w)乳液，该乳液包括油和任选的聚合物、增溶剂和/或洗涤剂，随后在受控温度下进行喷雾干燥，得到可流动的干性油组分。

精油可以微胶囊的形式提供。通常地，精油的微胶囊化提供了其与周围环境的隔离，例如将油与水相中其物质的恶化作用隔离(例如在胃肠道环境中)，延缓挥发油的蒸发，在饲料加工(造粒)期间，防止因湿度和高温引起的摩擦和蒸发，或者改善粘性材料的加工性能。此外，可以有效地控制油离开微胶囊的速率，如在胃肠道中持续或受控地释放油，目的在于在肠道中提供有效量的活性化合物。因此，可以以同步的方式实现油和其他组分的释放以在体内实现协同效果。

可以使用范围广泛的材料和方法进行封装，以产生适合预期用途的持久程度和释放方法。适与在油的微胶囊化中使用的非限制示例性聚合物材料可包括真核或原核来源的天然聚合物，例如包括淀粉水解物，例如糊精、改性淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、羧基纤维素钠、甲基纤维素，乙基纤维素、动物或植物蛋白质或蛋白质水解物，如明胶、胶原、蛋黄、小麦蛋白、酪蛋白、牛奶蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白或其混合物。可使用各种微胶囊化的物理和化学方法，这取决于所使用的油和所需的聚合物壳包衣。从方便起见，通过任何合适的方式，包括喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥、托盘干燥、吸附及其组合，使o/w乳液脱水从而封装精油。优选地，微胶囊化油是通过将具有如上文所定义的含水相且含有聚合物封装剂的乳液进行喷雾干燥而制备得到的。喷雾干燥参数由最终微胶囊化油所需的物理特性决定。这些物理参数包括粒径、流速和含水量。

油组分通常具有良好的流动性，并且可以均匀地分布在整个组合物中。方便地，油组分是粉末。可以将任何合适的添加剂加入油中，例如流动剂，如二氧化硅，以增加油的流动性。

如本文所述的柚皮苷组分和/或甜菜红碱组分具体地分别是包含特定量的化合物柚皮苷和甜菜红碱的植物材料。具体地，植物材料是作为颗粒干粉末提供的。

本文中所用的术语“粉末”具体理解为包含多个颗粒的可流动材料。所述颗粒可具有平滑的外表面和/或扁平的形态。在某些实施方案中，颗粒植物材料是具有特征性气味的米黄色至深棕色粉末。

本文中所用的颗粒植物材料具体是通过研磨干植物材料以获得特定粒径来获得的，例如对应于可流动材料，例如与SiO

颗粒的平均最大尺寸为250-500μm。典型的颗粒材料中最少有95％的粒径低于500μm。优选地，颗粒植物材料的平均粒径为100-350μm。

植物粉末材料可来源于植物的各个部分，具体地，可使用纤维性植物材料，例如包括树皮、根、梗(stalk)、茎(steam)、叶、果实、果皮、花、种子或其组合。

用作本文所用柚皮苷组分来源的示例性植物材料是芸香科(Rutaceae)植物的植物材料，例如柑橘类水果，例如柑橘果皮或果渣。具体地，柚皮苷可以从这些植物产品中提取并用作饲料添加剂组分，或者植物产品也可以用作饲料添加剂组分。

用作本文所用甜菜红碱组分来源的示例性植物材料是来源于石竹目植物的植物材料，例如植物(例如甜菜)的果实、叶、茎和根。具体地，甜菜红碱可以从这些植物产品中提取并用作饲料添加剂组分，或者植物产品也可以用作饲料添加剂组分。

根据具体实施例，在饲料混合器中将柚皮苷组分和/或甜菜红碱组分与二氧化硅上的精油组分混合，以及任选地与其他赋形剂混合。

本文所述饲料添加剂或饲料产品的水分含量通常小于12％，优选小于8％。

本文所用术语“赋形剂”应指饲料组合物中常用的添加剂成分，例如植物源和/或无机饲料添加剂成分。具体地，饲料添加剂及其添加剂组分应理解为用于动物营养的产品，其目的是提高饲料质量，或改善动物的品质和健康。饲料添加剂通常经过精心挑选，对人畜健康和环境都不会造成有害影响。

在这方面，术语“饲料”通常指任何提供能量和营养需求的动物饲料成分的混合物，这些动物饲料组分例如蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和微量营养素。例如，用于肉鸡育肥的家禽饲料每日摄入量通常在每天50-250克/头之间。根据另一实施例，猪饲料的每日摄入量，根据具体生理状态，通常在每天50-1500克/头之间。根据另一实施例，反刍动物饲料的每日摄入量，根据具体物种和生理状态，通常在每天150-35000克/头之间。

本文所述的饲料添加剂可具体包括赋形剂，例如其他精油、干草药、香料和其他赋形剂，包括色素、调味物质、防腐剂，或将组合物配制成所需形式需要的任何物质，例如膨胀剂、防结块剂、稀释剂、填充剂、粘合剂，崩解剂、吸附剂或成粒剂。典型的赋形剂例如是迷迭香叶、杜松子、车前子壳、麦麸、石灰石、SiO

本文所用的术语“可流动”应具体指粉末形式的组分混合物，包括例如可流动的颗粒材料。例如，在重力的影响下，可流动混合物可通过漏斗或料斗流入另一容器。在本发明中，可流动粉末混合物适用于饲料混合和造粒的装置。术语“可流动”在食品和饲料行业中是公知的，并且对于本领域技术人员来说具有明确的含义。

可流动混合物在使用中具有若干优点，特别是在工业规模的使用上。相比于例如不可流动的固体材料，该混合物可相对容易且能源高效地进行处理、存储和运输。这种优点在造粒过程中与避免液化步骤的能力相结合尤其重要。

本文所用的可流动混合物具体包括至少一种包含1,8-桉叶素的(精)油组分，以及至少一种其他组分，其包括柚皮苷或甜菜红碱，以及任选地其他组分和赋形剂，其中这些组分全部混合在一起而不包含任何实质量液体，以形成干性混合物，任选地将该干性混合物研磨成可流动的的粉末，优选为可造粒的粉末。

具体地，1,8-桉叶素组分与至少一种包含柚皮苷或甜菜红碱的其他组分混合饲喂，提供了一种固有地改善活性化合物的体内缓释特性的植物源系统，以改善所需的生物物理特性。优选地，1,8-桉叶素组分、柚皮苷组分或甜菜红碱组分中的任一种或多种或全部是不溶解或在胃中仅轻微溶解。饲料添加剂组合物的组分可充分提供给肠道和/或结肠，使得活性化合物可同时作用于生物物理特性。

因此，当使用本文所述的饲料添加剂或饲料产品时，可以在肠道中获得协同效果。

本文所用的术语“家禽”具体是指主要用于肉类(肉鸡)和蛋类(蛋鸡)的驯化家禽；包括鸡形目(Galliformes)鸟类，例如鸡、火鸡、珍珠鸡、雉鸡、鹌鹑和孔雀；以及雁形目(Anseriformes)游禽，例如鸭和鹅。

家禽可以在整个生长期内，或至少持续至少3周，优选至少4周的期间内用相同的饲料组合物进行饲喂，以提高饲料的利用效率或饲喂效率，例如提高每单位饲料的产量。可以发现，对照组和实验处理组在孵化后28天的整个生长期的最终体重和增重上有着显著差异。虽然处理组之间的采食量几乎相等，但是对于用本发明的饲料添加剂组合物饲喂的家禽，特别是鸡来说，饲料效率(即g饲料/g增重)可能显著更好。

本文所用的术语“猪(swine)”，是指体格肥壮、四肢短小、杂食性偶蹄目哺乳动物(猪科)，其皮肤粗硬，口鼻长而柔韧；特别地是指家猪和野猪。

本文所述的用于家禽或猪的饲料具体是颗粒状或糊状的。

在实施例1中描述了本文所述用于培育家禽或猪的饲料添加剂组合物的示例性组合物。

本文所使用的术语“反刍动物”应指反刍哺乳动物，包括例如牛、山羊、绵羊、长颈鹿、牦牛、鹿、羚羊和一些大型袋鼠(macropod)(袋鼠(kangaroo))。

具体地，本文所述的用于反刍动物(例如牛)的饲料制成颗粒，或者将饲料添加剂混合到以下的一种或多种：牧草青贮、玉米青贮、豆粕或磨碎谷物。

实施例1中描述了本文所述用于培育反刍动物(例如牛)的饲料添加剂组合物的示例性组合物。

本文还提供了针对测定饲料添加剂组合物中活性物质1,8-桉叶素、柚皮苷和甜菜红碱的分析方法的进一步实施例。

本文还提供了针对饲料添加剂效果的体内和体外试验的进一步实施例，例如

i.暴露于热应激秀丽隐杆线虫寿命延长作用的体内试验，

ii.CaCo2细胞热休克蛋白诱导作用的体外试验；

iii.在体外通过迁移CaCo2细胞跨上皮电阻(TEER)测试肠道屏障功能；

iv.在体内验证柚皮苷对热应激下肉鸡生长性能的有益效果以及评估有益剂量水平；

v.在体内验证柚皮苷与不同浓度1,8-桉叶素组合对热应激下肉鸡生长性能、热休克蛋白反应和肠道屏障完整性的有益效果；以及

vi.在体内验证柚皮苷与1,8-桉叶素组合或1,8-桉叶素与甜菜红碱组合的有益效果。

通过参考以下实施例，将更充分地理解上述描述。但是，这些实施例仅代表实施本发明的一个或多个实施方案的方法，而不应理解为限制本发明的范围。

示例性组合物包含以下成分，将这些成分混合至干性可流动混合物中。鉴于该油组分是特定的唇形科植物油或唇形科植物油(例如牛至油和/或迷迭香油和/或百里香油)的混合物，将油组分标准化为1,8桉叶素浓度，黄酮类组分来源于柑橘黄酮类化合物，将其标准化为柚皮苷浓度，甜菜红碱组分来源于甜菜根粉，将其标准化为甜菜红碱浓度。

表1：配方I；用于家禽(肉鸡、蛋鸡、火鸡)和猪的新型饲料添加剂配方组合物

示例性饲料添加剂配方I包含1.50％的1,8-桉叶素(w/w)；有效比为0.65:1(w/w1,8-桉叶素：柚皮苷)。

表2：配方II；用于家禽(肉鸡、蛋鸡、火鸡)和猪的新型饲料添加剂配方组合物

示例性饲料添加剂配方II包含1.50％的1,8-桉叶素(w/w)；有效比为22:1(w/w 1,8-桉叶素：甜菜红碱)。

表3：配方III；用于反刍动物的新型饲料添加剂配方组合物

示例性饲料添加剂配方III包含0.375％的1,8-桉叶素(w/w)；有效比为0.5:1(w/w1,8-桉叶素：柚皮苷)。

表4：配方IV；用于反刍动物的新型饲料添加剂配方组合物

示例性饲料添加剂配方IV包含0.375％的1,8-桉叶素(w/w)；有效比为12:1(w/w1,8-桉叶素：甜菜红碱)。

称为“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”的饲料添加剂含有

a)有效比在0.2:1-1.5:1范围内的柚皮苷，特别是0.65:1(w/w，1,8-桉叶素：柚皮苷)；和/或

b)有效比在4:1-64:1范围内的甜菜红碱，特别是22:1(w/w，1,8-桉叶素：甜菜红碱)。

在本文所述的测试系统中测试该配方，以显示各化合物组合的协同效果。

例如，当以推荐剂量水平使用时，协同效果定义为与标准参考添加剂相比，具有更高的生长性能效率。

根据实施例，“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”的剂量在200至400mg/kg范围内或在完全饲料的200至400mg/kg范围内。

此外，在体内试验系统(动物试验)中，采用一般推荐剂量的甜菜碱(500mg/kg完整饲料)作为阳性对照组。与常用的商业解决方法相比，这种方法证明了“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”具有更高的效率。

活性物质分析证据的说明

1.1,8桉叶素(1,8Cineole或1,8-Cin)(化合物“A”)

2.柚皮苷(Naringin或Nar)(化合物“B”)

3.甜菜红碱(Betalain或Betal)(化合物“C”)

试验方法和结果的说明

4.试验I：秀丽隐杆线虫寿命延长试验

5.试验II：CaCo2细胞热休克蛋白诱导的体外试验

6.试验III：在体外通过迁移CaCo2细胞跨上皮电阻(TEER)测试肠道屏障功能

7.试验IV：在体内验证柚皮苷(化合物“A”)对热应激下肉鸡生长性能的有益效果以及评估最佳剂量水平

8.试验V：在体内验证柚皮苷(化合物“B”)与不同浓度1,8-桉叶素(化合物“A”)组合对热应激下肉鸡生长性能、热休克蛋白反应和肠道屏障完整性的有益效果

9.试验VI：在体内验证柚皮苷与1,8-桉叶素(AB)组合，或1,8-桉叶素与甜菜红碱(AC)组合的有益效果。

说明：

GC MS

气相色谱分析采用聚焦GC与购于Thermo(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的DSQII MS联用。在240℃的进样温度下以不分流模式进行进样(进样量1μl)。在购于Restek(德国巴特洪堡)的Rxi-5ms熔融石英柱(内径30m×0.25mm；膜厚0.25μm)上以恒定流量进行分离。烘箱程序在50℃开始，第一步温度以5℃min

质谱仪在选择性离子检测(SIM)模式下工作，选择质荷比为m/z 154、m/z 139、m/z111、m/z 108的离子。离子源的温度调节为240℃，传输线温度配置为300℃。

LC MS

实验在安捷伦1100系列高效液相色谱系统(安捷伦系列1100HPLC系统)上进行。分离柱为购于安捷伦的Poroshell 120EC-C18 Eclipse(内径50×3mm，粒径2.7μm)。流动相为梯度的水和乙腈，均含0.1％甲酸。初始条件为15％乙腈5min，然后在5min内梯度运行至20％乙腈。在随后的5分钟内运行至100％乙腈，最后运行至15％乙腈再保持5分钟。总色谱运行时间为20分钟。流量设置为0.8mL min

采用安捷伦6520QTOF在负离子模式下进行质谱检测。采用以下离子源条件：干性气体温度350℃，干性气体流量10.5L min

LC MS(Pires Goncalves等人，2012)

在配备有UV-Vis检测器(双波长，Waters 2489)和Jupiter-15(

使用Bruker-Daltonics Esquire 3000Plus进行ESI-MS分析。蒸发器温度为325℃，电压保持在4.0kV。鞘流气为氮气，工作压力为26psi(6.0L/min)。化合物在正离子模式下进行电离。

试验方法说明

对于这项研究，开发了一套利用秀丽隐杆线虫的具体试验。在正常温度条件下，秀丽隐杆线虫的寿命约为14天(包含全部幼虫阶段)。幼虫在3至4天后长到成虫状态。将温度升高到37℃可将秀丽隐杆线虫的剩余寿命大幅缩短至10至15小时。因此，在本试验中，通过对照物(抗坏血酸和甜菜碱)和许多其他植物源化合物(薄荷油、桉树油)延长了秀丽隐杆线虫的寿命，并对其中部分纯化活性成分(胡椒碱、辣椒素、姜辣素、丁香酚)进行了筛选。所有受试物质的使用浓度(mg/L)在之后转换为完全膳食中这些物质的膳食浓度(mg/kg)。

表5：试验I：化合物A、B和C及其他活性成分的浓度

秀丽隐杆线虫野生株型N2，变异株Bristol均从美国明尼苏达大学的秀丽隐杆线虫遗传中心(CGC)获得。根据标准方案(Brenner S，1974，The genetics ofCaenorhabditis elegans)，在20℃下将线虫维持在接种了大肠杆菌OP50的线虫生长培养基(NGM)琼脂板上。根据标准方案(Stiernagle T,2006；Maintenance ofC.elegans.WormBook 1-11)，还进行了冷冻线虫以及使用次氯酸盐处理产卵成虫的漂白法获得同步化种群等方法。

根据Stiernagle，利用NGM液体和包装大肠杆菌HT115在液体培养中获得同步化线虫。在NGM液中加入羧苄青霉素以灭活大肠杆菌。在96孔微孔板的每个孔中分配56μl NGM液体，向其中添加含有10个同步化L1幼虫的10μl M9缓冲液。L1幼虫在20℃下保持摇动，3天内长到成虫状态。所有对照物(抗坏血酸、甜菜碱)和试验物(化合物“A”和“B”)加入M9缓冲液中制备成储备溶液，并超声处理5min。储备溶液(10倍)的浓度如下(抗坏血酸500/1000mg/L，甜菜碱5000mg/L，化合物“A”75mg/L，化合物“B”500mg/L，化合物“C”6.88mg/L)。向培养基中添加7μl每种提取物储备溶液，以使终浓度达到100mg/L(抗坏血酸)、500mg/L(甜菜碱)、7.5mg/L(化合物“A”)、50mg/L(化合物“B”)和0.6875mg/L(化合物“C”)。对照组线虫一直用相同体积的M9缓冲液进行处理。

在含或不含对照添加剂(抗坏血酸、甜菜碱)和在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂组分“A”和“B”的情况下，在20℃下培养青年成虫N2线虫48小时。

如(Gill MS,Olsen A,Sampayo JN,Lightgow GJ,2003；Free Radic Biol Med35:558-565)所述，利用微孔板耐热试验测定存活率。简单来说，用M9缓冲液/

为了确定每条线虫的存活时间，生成一条单独的荧光曲线。死亡时间定义为观察到荧光超过基线水平后1小时，并且首先通过触摸激发进行验证。根据个体死亡时间绘制Kaplan-Meier存活曲线。

为了研究两种参考物(抗坏血酸、甜菜碱)和植物源化合物(包括“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”的化合物“A”、“B”和“C”)对热应激的保护作用，在热应激条件下对秀丽隐杆线虫进行了寿命延长测试(图1)。选择参考物和植物源物质的试验浓度，以反映动物膳食中的最终膳食浓度(例如，参考物甜菜碱在动物膳食中的浓度为250至1000mg/kg；在秀丽隐杆线虫模型中，甜菜碱的试验水平为500mg/L＝500mg/kg＝500mg/kg)。两种参考物(抗坏血酸和甜菜碱)下，寿命都延长了0.5至1.5小时。在化合物“A”(图1D)、“B”(图1C)和“C”(图1E)的试验浓度下，寿命延长了0.5至1.5小时。

有趣的是，辛辣物质和凉爽精油经常被推荐用于抵消热应激的消极后果，并且部分用于常见的饲料添加剂产品，但使用辛辣物质和凉爽精油的对比例没有显示出对延长寿命的益处(图2F、G、H、I、J、K)。

对于这项研究，开发了一套利用CaCo2单层细胞的具体试验。CaCo2细胞在37℃下进行常规培养。将温度升高到41℃会在这些细胞中引起热休克反应(诱导热休克蛋白)，以抵消细胞损伤并启动修复机制。因此，在本试验中，以剂量依赖性方式研究了甜菜碱(参考物)和化合物“A”和“B”支持和增强自然热休克反应的潜力。

材料

含Earle盐MEM、胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素和胰蛋白酶EDTA购于BiochromGmbH(德国柏林)。Entero-STIM肠上皮分化培养基和MITO+Serum Extender从康宁(德国威斯巴登)获得，细胞培养板购于葛莱娜第一生化国际有限公司(Greiner Bio OneInternational GmbH)(奥地利克雷姆斯明斯特)购买。RNeasy迷你试剂盒从Quiagen(德国希尔登)获得，i Script cDNA合成试剂盒和iQ SYBR Green Supermixture试剂盒来自Bio-Rad(德国慕尼黑)和oligo-dT引物来自Eurofins Genomics(德国埃伯斯贝格)。

人CaCo2细胞(DSMZ，德国布伦瑞克)维持在添加有10％FBS和100U/mL青霉素或100μg/mL链霉素的含Earles盐MEM中，并在37℃下含5％CO

为了分析甜菜碱(参考物)和化合物“A”、“B”和“C”对热休克蛋白HSP70表达的影响，在第4天将这些物质添加至细胞，将细胞与提取物一起过夜培养15小时。将试验物溶解于完全分化培养基中并分别稀释至以下终浓度：甜菜碱(250/500/1000/1500mg/L)；化合物“A”(7、5、15、30和60mg 1,8-桉叶素/L)；化合物“B”(6、12、18、24、30和60mg柚皮苷/L)；化合物“C”(0.55、1.10、2.20mg甜菜红碱/L)。为了诱导热应激，样品在41℃下孵育1小时，对照样品则在37℃下孵育相同时间。

采用实时定量PCR(德国慕尼黑Bio-Rad，C1000热循环仪和CFX96实时系统)检测HSP70的mRNA表达。用RNeasy迷你试剂盒分离总RNA，然后取50ng总RNA用i Script cDNA合成试剂盒(终体积：20μL)转录成cDNA，并根据制造商的说明用iQ SYBR Green Supermix进行实时PCR。简单地说，对于实时PCR，将2μL cDNA加至18μL主混合物(10μL iQ SYBR Greensupermix(2×)，2μL引物[3pmol/μL]，6μL无核酸酶水)。在95℃下3分钟以DNA变性和聚合酶活化，然后进行40次PCR循环。一个次扩增循环分为三个部分：95℃变性15秒，60℃退火延伸60秒，在每次循环后读取一次板。最后，通过逐渐升高温度至95℃进行熔融曲线分析，以排除底漆二聚体的形成。通过2

为了研究化合物“A”、“B”和“C”在额外诱导热休克反应上的益处，将分化CaCo2细胞暴露于逐步增多的化合物“A”、“B”和“C”中，代表上述在动物膳食中应用的剂量范围(图3B、C、D)。作为参考物，对常用的抗热应激饲料添加剂甜菜碱也进行了相应的试验(图3A)。与对照组相比，甜菜碱对热休克蛋白70的诱导没有显示出明显的剂量性反应。与未经处理的对照细胞相比，100、250和1000mg/L甜菜碱竟降低了热休克蛋白70的诱导水平(-7至-19％)，500和2000mg/L甜菜碱引起了热休克蛋白70反应的非显著增加(+10至+12％)(图3A)。相比之下，“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”的全部三种化合物都比对照组有明显的益处，并且表明存在剂量性反应或超过最佳浓度(图3B、C、D)。对于化合物“B”，与未经处理的对照细胞相比，已测试的柚皮苷最低浓度引起了明显但增加不显著(+16％)的HSP70诱导。对于柚皮苷浓度为12至30mg/L的化合物“B”，可以观察到HSP 70诱导几乎在相同水平的显著增加(+24至+27％)。相反，60mg柚皮苷/L导致不良影响(-23％)，表明超出了最佳剂量范围。类似地，与对照细胞相比，含7.5mg 1,8桉叶素/L的化合物“A”使HSP70诱导增加15％。含15和30mg1,8-桉叶素/L的化合物“A”分别使HSP 70基因表达增加22％和24％。测试的最高剂量(45mg 1,8-桉叶素/L)竟可使HSP 70表达增加44％。但是，由于原材料价格的原因，该浓度不考虑在“在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂”的产品配方中使用。所测试的最高浓度属于Türk等人(2016)报告的范围内。为了测试单一化合物是否有附加效应，例如，图3E中给出了单独使用化合物“A”和“C”以及两种物质组合对HSP70诱导的示例。在单独使用20.8％和21.1％的物质“A”和“C”的测试水平下，如图3C和图3D所示，HSP70表达几乎显著或显著增加，处于可比水平。两种物质的组合几乎使HSP 70诱导增加了一倍，达到40.2％，并且清楚显示了两种物质的改善作用(图3E)。

为了测试化合物“A”、“B”和“C”是否有助于在热应激条件下支持肠道屏障的完整性，利用迁移CaCo2细胞层进行了实验。在无菌生物安全2级细胞培养罩中，将0.8mm孔PET迁移小室放入24孔板(每种条件4个孔)。所有材料先用乙醇灭菌再进入。

制备细胞培养基：将4.5g/L葡萄糖、15％胎牛血清和1％青霉素链霉素(PenStrep)加入DMEM培养基，并在水浴中加热至37℃。

将200-400μl人上皮性结直肠腺癌(Caco-2)的细胞液加入细胞培养基中，以1.5×10

细胞在37℃、5％CO

由于甜菜红碱首次显示出能改善CaCo2细胞单层中HSP70诱导(图3D)，因此对其肠道屏障完整性的保护作用进行了测试。结果表明，在热应激条件下，与未处理对照细胞相比，在迁移培养板上生长的CaCo2细胞经甜菜红碱预处理后TEER的降低了显著减小(图4)。由此可以首次得出结论，甜菜红碱对肠道屏障完整性具有保护作用。

尚未有报告关于化合物“B”在体内改善动物福利上的有益效果(改善品质、热休克反应和肠道屏障完整性)。由于化合物“B”在所有体外试验中都表现出良好的反应，因此第一次体内试验旨在研究该化合物对热应激下肉鸡的品质和热休克反应的有益效果。甜菜碱常用作改善热应激下动物品质的添加剂，本试验将甜菜碱作为阳性对照组。

本试验从总共1400只1日龄罗斯(Ross)308雄性肉鸡中采用了1152只。在筛选过程中，任何一只显示出健康问题、受伤、体型太小或状况较差等迹象的1日龄肉鸡都会被排除在外。肉鸡在孵化场进行性别鉴定。全部1日龄雏鸡分别称重并按体重分组。然后将这些鸟分配到36个围栏(6个处理组重复6次)，每个围栏最初包括34只肉鸡。在实验第4天，每个围栏去除最弱的2只肉鸡，并通过负筛选将所有围栏平等分为32只鸟每围栏。用不含任何其他植物源添加剂的基础饲料饲喂阴性对照组的鸟。参考组用提供500mg/kg饲料甜菜碱的饲料进行饲喂，其中甜菜碱来自天然甜菜碱来源(

表5：试验IV：实验性处理组

这项试验在德拉康研究中心(Delacon Research Facility)(捷克共和国南摩拉维亚州)进行。这些鸟在地面围栏内饲养，每个围栏的面积为2.1m

以基于小麦、玉米和豆粕为基础饲料饲喂这些鸟类。对于每个饲喂期(起始期/生长期、生长期/结束期)，按等营养(iso-nutritive)对饲料进行计算(表6)。按照饲养员的建议，将膳食中营养物浓度计算为满足肉鸡当前的推荐量。根据所采用的2阶段饲养法，从第1天至第21天提供起始期/生长期膳食，从第22天至第42天提供生长期/结束期膳食。在试验IV、V、VI所使用的单阶段膳食组成和计算的营养成分见下表。所有膳食都以颗粒饲料的形式提供给这些鸟。

表6：试验IV、V、VI：实验性膳食的组成和计算分析

在施泰尔埃格(奥地利)德拉康生物技术有限公司(Delacon Biotechnik GmbH)工厂制备预混料。预混料制备成提供添加水平为0.1％(1.0mg/kg)的预期膳食终浓度。在预混料制备好后，预混料中活性物质即为所需浓度。

由饲料厂Biosta s.r.o.

生产后直接取样。每个处理组和阶段的饲料各取1kg，在阴凉干燥的条件下储存在试验设施中，直至最终报告获得批准。

在中波希米亚州的Zemědělská oblastní实验室，对饲料中的营养物进行分析。对饲料中的干物质、粗蛋白、粗脂肪、灰分、糖、淀粉、钙、磷进行了分析。此外，还分析了饲料中的活性成分。

在实验第21天和第42天，从每个重复组中取2只鸡处死收集肝脏和空肠，以测定基因表达。

用SAS软件包进行统计学分析。在检查数据的均一性后，采用常规检验方法(图基(Tukey)检验)对平均值进行比较。P≤0.05则认为具有统计学显著性，0.05

表7示出了试验IV饲料中柚皮苷的分析浓度。饲料中柚皮苷活性物质的回收率接近100％，因此在最终饲料中也具有所制定的含量。通过分析可知参考物甜菜碱也具有同样高的回收率。

表7：试验IV-试验饲料中甜菜碱和柚皮苷的含量

由于化合物“B”(柚皮苷)在热应激条件下对动物福利方面的积极作用(如保护肠道屏障功能，改善性能相关作用)尚未被报道，本试验的目的是评估化合物“B”与标准剂量(500mg/kg)的参考物甜菜碱的剂量依赖性作用。在预热应激期(第0至第21天)，参考物(+4.9％)和所有剂量(12、18、24和30mg/kg饲料)的化合物“B”(+2.79％至+13％)均对体重和日增重产生了有益效果。与阴性对照相比，即使是所试验最低剂量(12mg/kg)的化合物“B”都能产生显著影响(+13％)(图5和图6)。参考物和化合物“B”对体重增长和日增重的积极作用在热应激条件下(第22至第42天)也继续存在(图5和图6)。但是，在热应激下，与化合物“B”相比，参考物甜菜碱对体重增长的影响高出2％到5％(图5和6)。与热应激期前相比，在热应激下可以观察到化合物“B”存在明显的剂量性反应(图5和图6)。由于在整个生长期(entire mast period)内都喂食具有抵抗热应激消极影响的添加剂，因此直到试验结束，即使最低剂量的化合物“B”也能一直保持强力的预处理效果。在第42天，与未处理对照组相比，参考物(+170g)和化合物“B”(+80至+140g)处理组的鸟的体重明显更大(图5和图6)。与阴性对照组相比，用最低剂量的化合物“B”可以获得最高的终体重(+140g)。在饲料转化率方面也能观察到与体重增长类似的结果(图7)。

在化合物“B”的剂量性反应试验(试验IV)中，可以观察到对热应激下肉鸡品质的有益效果。结果表明，最低剂量12mg/kg柚皮苷完全膳食产生的性能值(体重/增重/FCR)略好于甜菜碱参考组。更高浓度的化合物“B”不没有对生长性能产生进一步的益处。在化合物“B”的剂量性反应试验中，可以观察到对热应激下肉鸡品质的有益效果。因此，在本试验中，以剂量依赖性方式(6/12/24mg/kg饲料)向化合物“B”添加1,8-桉叶素(化合物“A”)，并加入恒定12mg柚皮苷/kg饲料，对所产生的附加值进行评估。参考组则单独添加500mg/kg甜菜碱或500mg甜菜碱+12mg 1,8-桉叶素/kg。

本实验从总共1400只1日龄罗斯308雄性肉鸡中采用了1224只。在筛选过程中，任何一只表现出健康问题、受伤、体型太小或状况较差等迹象的1日龄肉鸡都会被排除在外。肉鸡在孵化场进行性别鉴定。全部1日龄雏鸡分别称重并按体重分组。然后将这些鸟分配到36个围栏(6个处理组重复6次)，每个围栏最初包括34只肉鸡。在实验第4天，每个围栏去除最弱的2只肉鸡，并通过负筛择将所有围栏平等分为32只鸟每围栏。

用不含任何其他植物源添加剂的基础饲料饲喂阴性对照组的鸟。第2和第6参考组用提供500mg/kg甜菜碱(来自天然甜菜碱来源(

表8：试验V：验证试验的实验性处理组

试验V的方案设计，包括动物场舍和管理，实验性膳食的制备和组成，以及器官取样和统计学方法，都与试验IV类似。

表9示出了试验V饲料中甜菜碱、柚皮苷和1,8桉叶素的分析浓度。分析值表明，所有实验组均达到或超过了最低规定值。

表9：试验V：试验饲料中甜菜碱、柚皮苷和1,8-桉叶素的计算含量

由于化合物“B”在第一次体内试验中显示出对热应激下肉鸡的性能参数具有有益效果，具有相比于参考物甜菜碱略好的作用，本试验的目的是测试固定剂量的化合物“B”(12mg/kg)加剂量逐步增加的化合物“A”(6至24mg/kg)组合的协同/有益效果。本研究旨在于探索将化合物“A”和“B”的组合用于在热应激条件下支持动物福利的新型饲料添加剂，该添加剂的作用超过了参考物甜菜碱的作用。此外，将甜菜碱与中间剂量化合物“A”(12mg/kg)的组合选作第二参考，以测试甜菜碱与化合物“A”是否存在协同效果。与试验1类似，所有添加剂(甜菜碱和化合物“A”与“B”的组合)在预热应激期就已经发挥出促生长的作用(图8和图9)。与阴性对照相比，单独甜菜碱在日增重上增加了2.5％，而加入12mg/kg化合物“A”后将这种作用降低至近1％。相比之下，所有化合物“B”加化合物“A”的组合都超过了甜菜碱单独的促生长作用，更不用说是甜菜碱加物质A组合的促生长作用(图8和图9)。此外，可以观察到组合“AB”存在明显的剂量性反应作用(+2.1％；+2.5；+4.7％)(图8和图9)。在第一次试验中观察到，与阴性对照相比，参考物甜菜碱在热应激条件下具有更好的促生长作用(+2.0％)。在热应激条件下，所有组合“AB”明显超过甜菜碱单独的生长性能效果。在热应激期前发现试验组合AB发现剂量性反应作用，但在热应激条件下未观察到。与阴性对照相比，所有试验组合“AB”的生长性能提高了5.2％至5.6％，与参考物甜菜碱相比，则提高了3.0％至3.5％(图8和图9)。最有趣的是，参考物甜菜碱与中等剂量的化合物“A”组合在热应激期前不具有效果，但在热应激期的促生长作用甚至于略好于组合“AB”。但是，由于在整个生长期(entire mast period)都使用具有抗热应激作用的饲料添加剂，“AB”组合总体上对最终体重产生了最大改善，相比于阴性对照提高了(+4.8％，+5.2％，+4.9％)，相比于参考物甜菜碱提高了(+1.6％，+2.0％)，而相比于甜菜碱加中等浓度化合物“A”的组合则提高了(+0.2％、+0.7％、+0.4％)。在FCR(食物转化率)方面，也能发现与生长性能非常相似的效果(图10)。

在柚皮苷(化合物“B”)与不同浓度的1,8-桉叶素(化合物“A”)组合有益效果的体内验证试验中，结果表明，所有受试的“AB”组合都比阳性对照甜菜碱单独更加有效，甚至比甜菜碱+化合物“A”的组合更有效。因此，该系列最后一个体内试验的目的是测试除了组合“AB”外，组合“AC”在热应激条件下是否比作为阳性对照的500mg/kg甜菜碱具有更强的保护和生长性能。

本试验从总共960只1日龄罗斯308雄性肉鸡中采用了816只。在筛选过程中，任何一只表现出健康问题、受伤、体型太小或状况较差等迹象的1日龄肉鸡都会被排除在外。肉鸡在孵化场进行性别鉴定。全部1日龄雏鸡分别称重并按体重分组。然后将这些鸟分配到36个围栏(6个处理组重复6次)，每个围栏最初包括34只肉鸡。在实验第4天，每个围栏去除最弱的2只肉鸡，并通过负筛选将所有围栏平等分为32只鸟每围栏。

用不含任何其他植物源添加剂的基础饲料饲喂阴性对照组的鸟。第2参考组用提供500mg/kg饲料甜菜碱(来自天然甜菜碱来源(

表10：试验VI：实验性处理组

试验VI的方案设计，包括动物场舍和管理，实验性膳食的制备和组成，以及器官取样和统计学方法，都与试验IV类似。

表11中显示了试验VI中甜菜碱、1,8-桉叶素、柚皮苷和甜菜红碱的分析浓度值。

表11：试验VI-试验饲料中甜菜碱、1,8-桉叶素、柚皮苷和甜菜红碱的含量

由于对物质“B”和“C”对CaCo2细胞热休克反应的附加积极作用的发现(图3E)，在本系列的最后一个试验中评估了，在热应激条件下，不仅物质“AB”的组合，而且物质“AC”的组合对热应激肉鸡的生长性能也显示出有益效果。在热应激期前，与未处理阴性对照相比，阳性对照(甜菜碱)以及两种组合“AB”和“AC”就能将体重提高3.60％至4.65％(图11)。结果表明“AC”是最有效的组合，而在本试验中，“AB”的效果略低于甜菜碱(图11)。但是，在热应激期间，“AB”和“AC”两种组合都展现出了其具有提高肉鸡品质的较高潜能。与阳性对照相比，两种添加剂使最终体重增加了约1％，相当于最终体重增加了50g。与阳性对照甜菜碱相比，“AB”和“AC”两种组合甚至可以在热应激阶段使日增重提高约1.5％(图12)。在最终体重和日增重方面的改善也反映在FCR方面(图13)，“AB”和“AC”组合均对FCR产生了相比于阳性对照(甜菜碱)更高的改善程度。

Brand W，van der Wel PA，Rein MJ，Barton D，Williamson G，van Bladeren PJ，Rietjens IM.Metabolism and transport of the citrus flavonoid hesperetin inCaco-2cell monolayers.Drug Metab Dispos.2008Sep；36(9)：1794-802.doi：10.1124/dmd.107.019943.

Chen RC，Sun GB，Wang J，Zhang HJ，Sun XB.Naringin protects againstanoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9c2 cells via the Nrf2 signalingpathway.

Esatbeyoglu T，Wagner AE，Schini-Kerth VB，Rimbach G.Betanin--a foodcolorant with biological activity.Mol Nutr Food Res.2015Jan；59(1)：36-47.

Ghaffarian R，Muro S.Models and methods to evaluate transport of drugdelivery systems across cellular barriers.J Vis Exp.2013Oct 17；(80)：e 50638.

Hosseini SM，Farhangfar H，Nourmohammadi R.Effects of a blend ofessential oils and overcrowding stress on the growth performance，meat qualityand heat shock protein gene expression of broilers.Br Poult Sci.2018Feb；59(1)：92-99.doi：10.1080/00071668.2017.1390209.

FangFang，Li H，Qin T，Li M，Ma S.Thymol improves high-fat diet-inducedcognitive deficits in mice via ameliorating brain insulin resistance andupregulating NRF2/HO-1pathway.Metab Brain Dis.2017；32：385-393.

Kamboh AA，Hang SQ，Bakhetgul M，Zhu WY.Effects of genistein andhesperidin on biomarkers of heat stress in broilers under persistent summerstress.Poult Sci.2013；92：2411-2418.

Kluth D，Banning A，Paur I，Blomhoff R，Brigelius-Flohé R.Modulation ofpregnane X receptor-and electrophile responsive element-mediated geneexpression by dietary polyphenolic compounds.Free Radic Biol Med.2007Feb 1；42(3)：315-25.

Lee CH，Wettasinghe M，Boiling BW，Ji LL，Parkin KL.Betalains，phase IIenzyme-inducing components from red beetroot(Beta vulgaris L.)extracts.NutrCancer.2005；53(1)：91-103.

Maria Miguel，Antioxidants 2018；7(4)：53.

Noda S，Tanabe S，Suzuki T.Differential effects of flavonoids onbarrier integrity in human intestinal Caco-2cells.J Agric Food Chem.2012May9；60(18)：4628-33.doi：10.1021/jf300382h.

Pearce SC，Mani V，Boddicker RL，Johnson JS，Weber TE，Ross JW，Rhoads RP，Baumgard LH，Gabler NK.Heat stress reduces intestinal barrier integrity andfavors intestinal glucose transport in growing pigs.PLoS One.2013Aug 1；8(8)：e70215.doi：10.1371/journal.pone.0070215(A).

Pearce SC，Mani V，Weber TE，Rhoads RP，Patience JF，Baumgard LH，GablerNK.Heat stress and reduced plane of nutrition decreases intestinal integrityand function in pigs.J Anim Sci.2013Nov；91(11)：5183-93.doi：10.2527/jas.2013-6759(B).

Pires Goncalves J C，de Souza Trassi MA，Lopes N B，

Placha I，Takacova J，Ryzner M，Cobanova K，Laukova A，Strompfova V，Venglovska K，Faix S.Effect of thyme essential oil and selenium on intestineintegrity and antioxidant status of broilers.Br Poult Sci.2014Feb；55(1)：105-14.doi：10.1080/00071668.20130.

Rani N，Bharti S，Manchanda M，Nag TC，Ray R，Chauhan SS，Kumari S，AryaDS.Regulation of heat shock proteins 27 and 70，p-Akt/p-eNOS and MAPKs byNaringin Dampens myocardial injury and dysfunction in vivo after ischemia/reperfusion.PLoS One.2013 Dec 6；8(12)：e82577.doi：10.1371/journal.pone.0082577.

Saeed M，Babazadeh D，Naveed M3，Arain MA，Hassan FU，Chao S.Reconsideringbetaine as a natural anti-heat stress agent in poultry industry：a review.TropAnim Health Prod.2017 Oct；49(7)：1329-1338.doi：10.1007/s11250-017-1355-z.Epub2017 Jul 21.

Sharma K，Mahato N，Cho MH，Lee YR.Converting citrus wastes into value-added products：Economic and environmently friendlyapproaches.Nutrition.2017Feb；34：29-46.doi：10.1016/j.nut.2016.09.006.

Suntar I，Khan H，Patel S，Celano R，Rastrelli L.An Overview on Citrusaurantium L.：Its Functions as Food Ingredient and Therapeutic Agent.Oxid MedCell Longev.2018 May 2；2018：7864269.doi：10.1155/2018/7864269.

Türk G，

Uritu CM，Mihai CT，Stanciu GD，Dodi G，Alexa-Stratulat T，Luca A，Leon-Constantin MM，Stefanescu R，Bild V，Melnic S，Tamba BI.Medicinal Plants of theFamily Lamiaceae in Pain Therapy：A Review.Pain Res Manag.2018 May 8；2018：7801543.doi：10.1155/2018/7801543.

Wieten L，van der Zee R，Spiering R，Wagenaar-Hilbers J，van Kooten P，Broere F，van Eden W.A novel heat-shock protein coinducer boosts stressprotein Hsp70 to activate T cell regulation of inflammation in autoimmunearthritis.Arthritis Rheum.2010 Apr；62(4)：1026-35.doi：10.1002/art.27344.

Zhu C，Dong Y，Liu H，Ren H，Cui Z.Hesperetin protects against H2O2-triggered oxidative damage via upregulation of the Keap1-Nrf2/HO-1 signalpathway in ARPE-19 cells.Biomed Pharmacother.2017；88：124-133.

Zou Y，Wang J，Peng J，Wei H.Oregano Essential Oil Induces SOD1 and GSHExpression through Nrf2 Activation and Alleviates Hydrogen Peroxide-InducedOxidative Damage in IPEC-J2 Cells.Oxid Med Cell Longev.2016；2016：5987183.doi：10.1155/2016/5987183(A).

Zou Y，Xiang Q，Wang J，Peng J，Wei H.Oregano Essential Oil ImprovesIntestinal Morphology and Expression of Tight Junction Proteins Associatedwith Modulation of Selected Intestinal Bacteria and Immune Status in a PigModel.Biomed Res Int.2016；2016：5436738.doi：10.1155/2016/5436738(B).

序列表

<110> 地绿康生物技术有限公司

<120> 畜牧饲料添加剂

<130> DC002P

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

gcgggaaatc gtgcgtgaca tt 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gatggagttg aaggtagttt cgtg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

ctagcctgag gagctgctgc gacag 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gttccctgct ctctgtcggc tcggct 26