蜜环菌在降解呕吐毒素方面的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及蜜环菌在降解呕吐毒素方面的应用。

背景技术

真菌毒素存在于受污染食物和饲料中，从食物链侵入人畜体内蓄积造成蓄积，对健康构成极大威胁。单端孢霉烯族毒素是粮食中最常见的一类污染性真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、伏马菌素、呕吐毒素等。呕吐毒素主体成分为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），化学名为3α, 7α, 15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-蒽-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。DON最早是1970年在日本发霉玉米和小麦中发现，在1973年因其能引起母猪拒食和产生催吐反应而得名。常温下呈无色针状结晶，可溶于水和也可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，具有较强的热抵抗力、耐高压、耐酸碱。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种非甾体雌激素真菌毒素，又称为F-2毒素，是一种主要由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，主要存在于被污染的玉米、小麦、大米、大豆等谷物中。ZEN会通过多种途径污染谷物、食品和饲料，严重威胁人类健康和生命安全，其化学结构与许多类雌激素具有相似的特性，会激活雌激素受体，引起农产动物的流产、死胎、畸形胎等生殖障碍。另外ZEN还会通过食物链进入人体，造成免疫损伤、肝脏损伤、具有遗传毒性、诱发癌症等危害。

在2020年调查数据结果显示，玉米及其加工副产物中DON、ZEN和AFB

研究表明玉米赤霉烯酮的生物降解主要来自以下两类：微生物降解和酶降解。迄今为止，众多能够脱除玉米赤霉烯酮的微生物被广泛报道。其中降解ZEN的细菌和真菌多集中于乳酸菌、芽孢杆菌、曲霉和酵母等。Zhao等从传统发酵食品中分离出植物乳杆菌Lp22、Lp39、Lp4分别降解了溶液中47.80%、38.06% 和 39.50% 的ZEN。Xu等研究发现解淀粉芽孢杆菌ZDS-1在1mg/L至100mg/L的浓度范围内可有效降解ZEN，并发现 ZDS-1不仅可以降解培养基中的ZEN还可以降解小麦中的ZEN。Pereyra等测试了11种已经能证明降解AFB1的芽孢杆菌降解ZEN的能力，结果发现72小时后所测试菌株能够降解浓度为400ng/mL的ZEN，降解率为96.9%。另外Sun等人从发酵大豆中分离出的食品级黑曲霉FS10在PDB培养基中能有效去除ZEN，菌丝体和培养滤液也可降低43.10%和68.16%的ZEN。

发明内容

本发明目的是为解决上述问题，而提供了蜜环菌在降解呕吐毒素方面的应用。

蜜环菌在降解呕吐毒素方面的应用。

蜜环菌Am-07-22，保藏编号为CCTCC NO：M 20221044。

降解呕吐毒素方法，将玉米皮或玉米黄粉，接种蜜环菌，发酵；

所述的玉米皮，采用固态发酵；

所述的玉米黄粉，采用液态发酵；

本发明提供了蜜环菌在降解呕吐毒素方面的应用；本发明还提供了蜜环菌Am-07-22，保藏编号为CCTCC NO：M 20221044；所述的真菌毒素为呕吐毒素或玉米赤霉烯酮。菌株Am-07-22在DON浓度为2 μg/mL时降解效果最好，降解率为64.05%；蜜环菌对于两种不同发酵原料中呕吐毒素的降解，对玉米皮采用固态发酵方式时降解效果好，而玉米黄粉采用液态发酵方式时降解效果好。

附图说明

图1 不同食用真菌对DON的降解效果（不同字母代表存在显著性差异

图2 各因素相互作用对DON降解率影响的响应面图；

图3 不同DON浓度对蜜环菌降解效果的影响（不同字母代表存在显著性差异

图4 蜜环菌不同组分对DON降解率的影响（不同字母代表存在显著性差异

图5 不同处理方式对DON降解率的影响（不同字母代表存在显著性差异

图6 蜜环菌不同培养时间对DON降解效果的影响；

图7 锰过氧化物酶显色反应试验结果；

图8 不同培养时间DON降解率和Mnp酶活的变化规律；

图9菌株Am-07-22降解ZEN的液相色谱图；

图10 ZEN初始浓度对Am-07-22降解ZEN的影响；A、降解率；B、降解量；

图11 不同条件对Am-07-22降解ZEN降解率的影响；A、时间；B、温度；C、pH值；D、接种量；

图12 菌株Am-07-22的不同组分对ZEN的降解率；

图13 菌株Am-07-22发酵上清液经不同处理后对ZEN的降解率；

图14 不同条件对Am-07-22发酵上清液对ZEN降解率的影响；A、不同发酵时间；B、不同pH值；C、不同金属离子；

图15 蜜环菌发酵玉米皮、玉米黄粉对DON降解率的影响（不同大写字母代表组内存在显著性差异，不同小写字母代表组间存在显著性差异 p<0.05）；

图16 蜜环菌固态发酵不同DON浓度玉米皮对DON降解率的影响（不同字母代表存在显著性差异 p<0.05）；

图17 蜜环菌液态发酵不同DON浓度玉米黄粉对DON降解率的影响（不同字母代表存在显著性差异 p<0.05）。

具体实施方式

蜜环菌Am-07-22(

实施例1 蜜环菌Am-07-22的筛选与鉴定

一、菌种的诱变方法

以实验室保存的蜜环菌Am-07（

二、诱变效果比较

经过紫外诱变处理后得到的蜜环菌Am-07-22菌种进行固态发酵，其对人参渣可溶性膳食纤维含量的影响如图1所示；利用其突变株对人参渣进行固态发酵后，人参渣中可溶性膳食纤维含量得到提高，人参渣中不可溶膳食纤维的持水力、持油力和水膨胀力等水合特性也得到提高，如图2所示。

三、Am-07-22菌株测序结果

将分离纯化好的菌液送去吉林省库美生物科技有限公司进行检测，由该公司进行菌液DNA基因组的提取，然后在核糖体DNA和ITS序列进行扩增，如下表，得到PCR的产物，最后进行测序。

用ITS4、ITS5真菌通用引物对送去检验的菌液DNA进行扩增，成功拼接为623bp的连接片段，拼接结果见序列表SEQ ID NO.1；将测出来的序列，使用MEGA7.1软件绘制出该菌株的建树图，如图3；图中显示Am-07-22菌株与Armillaria sp.序列相似性高，该菌株鉴定为蜜环菌，命名为蜜环菌Am-07-22。蜜环菌Am-07-22于2022年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号 CCTCC NO: M20221044。

实施例2 菌种培养

一、菌种活化

将Me-01、He-02-06以及Am-07-22菌种分别转接至斜面培养基，培养条件27℃，培养12d。

配制菌种液体活化培养基：

1）Am-07液体种子培养基：马铃薯100 g、蚕蛹粉2.5 g、葡萄糖5 g、蔗糖5 g、酵母浸粉10 g、磷酸二氢钾0.75 g、七水合硫酸镁0.375 g、维生素B

2）Me-01液体种子培养基：葡萄糖10 g、酵母浸粉5 g、磷酸二氢钾0.6 g、七水合硫酸镁0.375 g、七水合硫酸铁0.005 g，pH值自然，121℃灭菌20 min；

3）He-02液体种子培养基：葡萄糖10 g、酵母浸粉5 g、可溶性淀粉10 g、磷酸二氢钾1.5 g、七水合硫酸镁0.3 g，pH值自然，121℃灭菌20 min。以上均以500 mL计算。

二、制备发酵种子液

制备一级发酵种：在无菌环境中，从活化好的三种菌的斜面培养基中取8块菌体，接入到装有30 mL液体活化培养基的100 mL 三角瓶中，于27 ℃恒温进行摇床振荡培养，160 r/min培养6 d得制得一级发酵种；

制备二级发酵种子液：将一级发酵种打碎，以8%的添加量将菌种接入到装有200mL液体活化培养基的500 mL三角瓶中，于27 ℃恒温进行摇床振荡培养，160 r/min 培养6d得制得二级发酵种子液。

实施例3菌种降解呕吐毒素的实验

一、降解呕吐毒素的真菌筛选

1、菌株对DON降解

将长满均一菌球、生长状况良好的液体发酵种子液转接入基础筛选培养基中，分别向其中加入DON标准工作液，使得基础筛选培养基中DON含量为2μg/mL，对照组为未接入菌种的基础筛选培养基。每组三个重复，27℃，160 rpm下避光培养7天。

所述的基础筛选培养基：马铃薯100 g、蚕蛹粉2.5 g、葡萄糖5 g、蔗糖5 g、酵母浸粉10 g、磷酸二氢钾0.75 g、七水合硫酸镁0.375 g、维生素B1 0.005 g，以500mL计，pH值自然，121℃灭菌20 min

2、DON的提取及检测。

取培养后的发酵液，12000 rpm转速离心10 min，温度保持在4℃。取进行100倍稀释后，将上清液用一次性无菌过滤膜过滤置于1.5 mL EP管中，4℃下保存待测。待测样液按照呕吐毒素检测试剂盒提供的方法进行操作，用酶标仪于双波长450 nm处测定试验孔OD值。

3、DON降解率计算

发酵液中DON残留含量通过Ridasoft.win软件（4-Parameter）计算得出。菌种对DON的降解效果用降解率表示。DON降解率按照以下公式进行计算：

4、呕吐毒素ELISA检测试剂盒检测步骤

将所需试剂和所需数量的微孔板从4℃环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂须摇匀使用。

洗涤液：用超纯水将浓缩洗涤液（10×）按1:9体积比进行稀释。

加样本：样本50 μL/孔，加入呕吐毒素酶标物50 μL/孔，再加入呕吐毒素抗试剂50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜避光， 25℃环境中反应30 min。

洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，洗涤液250 μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。

显色：加入底物液A液50μL/孔，底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，置25℃避光环境反应15 min。

测定：加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔OD值。

5、结果

图1为三株食用真菌在基础筛选培养基中对DON的降解结果。从图中可以看到Me-01、He-02、Am-07-22三种食用真菌经发酵培养后对于培养基中加入的DON均有降解效果，它们对于降解DON的降解率分别为11.22%、32.57%、51.76%，其中菌株Am-07-22对于DON的降解能力明显高于Me-01和He-02，故选取菌株Am-07-22作为本试验的降解菌进行后续研究。

二、降解工艺条件优化

将前期筛选获得的最优降解菌株Am-07-22进行单因素试验，来确定真菌菌株降解呕吐毒素的最佳工艺条件，包括：接种量、培养基初始pH值、培养温度、培养时间。经各单因素试验筛选后，为响应面优化试验提供前期试验基础。

在单因素的试验基础上，最终选择接种量、培养基初始pH值、培养温度三个因素为自变量，以DON降解率作为响应值，设计三因素三水平响应面试验，试验设计及结果见表1，回归模型方差分析见表2。

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通过Design-Expert软件对数据进行回归分析，以A接种量，B初始pH值，C培养温度三个因素为自变量并以菌株Am-07降解呕吐毒素的降解率（Y）为响应值，得到二次回归模型的二次多项式回归方程如下：Y=64.65+5.98A+11.33B+3.04C-3.42AB+5.22AC+0.45BC-8.12A

由方差分析，我们可以分析得到模型的p值小于0.05为显著，失逆项p值均大于0.05为不显著，说明试验建模成立，且R

经过响应面试验优化后，呕吐毒素最优降解工艺条件为：接种量7.455%，培养基初始pH值5.789，培养温度27.458℃，此时呕吐毒素降解率为68.3457%。根据试验实际控制条件，将接种量调整为7.5%，培养基初始pH值5.8，培养温度27.5℃。在此条件下进行三次菌株Am-07-22发酵降解呕吐毒素的平行试验。最终菌株Am-07-22发酵降解呕吐毒素的降解率为66.27%，与响应面预测值相符，说明该优化条件可应用到下一步的降解工艺中。

三、菌株Am-07-22对不同浓度DON降解效果的研究

在基础筛选培养基中分别加入不同体积的DON标准工作溶液至终浓度为2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5 μg/mL，并按7.5%接菌量接种菌株Am-07-22发酵种子液，以不接种子液作为对照组，每组进行三个重复试验，在27.5℃培养温度，160 rpm转速条件下培养7 d。

不同DON浓度对于蜜环菌降解效果的影响结果如图3所示，DON降解率分别为64.05％、42.34％、17.32％、8.01％。随着毒素浓度的增加，DON降解率在不断下降。随着DON毒素浓度的增加，蜜环菌对DON降解效果不断下降，在高浓度（4、5 μg/mL）时，DON明显会对蜜环菌的生长产生抑制作用，导致菌体大量衰亡，而不能正常代谢产生能够降解DON的活性物质。因此确定在DON浓度为2μg/mL时，DON降解率最高，最高降解率为64.05％。

四、降解呕吐毒素的物质来源定位及活性物质定性

发酵液、上清液、菌悬液及胞内液的制备：参照付苗苗等方法将菌种接入液体培养基中于27.5℃、160 rpm培养7 d，得到发酵液；取发酵液5 mL于4℃、12000 rpm条件下离心10 min，上清液过无菌滤膜，获得无菌体上清液，4℃保存备用；下层菌体用缓冲液溶液冲洗3次后重新悬浮5 mL，振荡混匀，即为菌悬液；取适量的菌体细胞，在高压均质下使其破碎完全，离心后的清液即为胞内液。

活性物质来源定位：将所得的发酵液、上清液、菌悬液及胞内液各980 μL，向其中分别加入20 μL真菌毒素，使DON终浓度为2 μg/mL。将反应体系置于27℃、160 rpm全温振荡培养箱中培养48 h后取样，试验均设置3个重复。

结果：为了初步分析DON的降解机制分别比较了蜜环菌的发酵液、上清液、菌悬液、胞内液对于DON的降解效果，如图4所示，DON降解率分别为65.52%、60.46%、13.69%、16.67%，上清液对DON的降解效果略低于发酵液的降解效果，这可能是由于试验所取发酵液中含有部分菌丝，由此可推断蜜环菌降解DON的活性物质存在于上清液中，可能为蜜环菌发酵所产胞外活性物质作用于DON，而不是依赖于菌体的吸附作用或者发酵所产胞内物质。对降解菌株各组分降解真菌毒素，且这与王明清、唐彧等人的试验结论一致。

活性物质定性：参照付苗苗等将上清液分别做以下处理：

（1）热处理上清 ：95℃水浴处理上清液10 min后冷却至室温，用一次性无菌过滤膜过滤；100℃沸水浴处理上清液10 min后冷却至室温，用无菌过滤膜过滤。

（2）用蛋白酶K处理上清液：2 mL上清液中加入100 μL蛋白酶K（终浓度为0.1 mg/mL），55℃处理2h，用0.22 μm一次性无菌过滤膜过滤。

（3）用SDS处理上清液：2 mL上清液中加入100 μL SDS（终浓度为0.5 mg/mL），55℃处理2h，用0.22 μm一次性无菌过滤膜过滤。

（4）蛋白酶K、SDS处理上清液：2 mL上清液中加入100 μL蛋白酶K（终浓度为0.1mg/mL）和100 μL SDS（终浓度为0.5 mg/mL），55℃处理2 h，用0.22 μm一次性无菌过滤膜过滤。

取上述处理后所得的上清液各980 μL，向其中分别加入20 μL真菌毒素，使DON终浓度为2 μg/mL。将反应体系置于27℃、160 rpm全温振荡培养箱中培养48 h后取样，试验均设置3个重复。

结果：为进一步分析蜜环菌发酵降解DON的胞外活性物质的性质，对蜜环菌的上清液做了不同处理，上清液经热处理、蛋白酶K、SDS等六种方式处理后的降解率如图5所示，分别为61.92%、19.35%、24.97%、52.35%、8.67%、39.16%。热处理通常可以破坏大部分蛋白（酶）的空间结构，经95 ℃水浴和沸水浴处理的上清液对DON的降解效果大幅下降，说明参与降解的蛋白质或酶对热是不稳定的，短时间的热处理对其造成明显影响，易破坏其结构；SDS作为变性剂，破坏蛋白的空间结构，上清液经处理后的降解效果显著降低，因此进一步推断蜜环菌分泌的是一种蛋白类活性物质。

五、蜜环菌动态降解呕吐毒素的研究

菌株对DON降解：将长满均一菌球、生长状况良好的液体种子以接种量7.5%转接入培养基中，向其中加入DON标准工作液，使得培养基中DON含量分别为2 μg/mL，调整培养基pH值至5.8，对照组为未接入菌种的基础筛选培养基。每组三个重复，27.5℃，160 rpm下避光培养7天。发酵培养的菌株发酵液每12 h取样一次，每次取样均设置3个重复。

由图6可知，随着发酵培养时间的延长，DON降解率出现了先显著升高后平缓下降的变化趋势，在0-144 h，DON降解率呈上升趋势，在144 h达到最高值，最高DON降解率为63.83%，在144 h后DON降解率开始出现平缓下降，在156 h时DON降解率为62.86%，在168h时DON降解率为63.08%，因此，本研究确定蜜环菌发酵降解DON的最佳发酵时间为144 h。

菌株发酵产锰过氧化物酶的酶活测定：

（1）平板显色试验

参照杜海萍等方法。

基础培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，KH

RB亮蓝试验：向基础培养基中加入0.003%的RB亮蓝，观察培养基是否出来橙黄色轮环。

愈创木酚培养基：向基础培养基中加入0.1g·L

食用菌的胞外锰过氧化物酶能使愈创木酚的培养基产生红棕色轮环，过氧化物酶的产生能在RB亮蓝中出现橙黄色轮环。蜜环菌在RB亮蓝培养基中产生橙黄色轮环证明其中有过氧化物酶的产生，而在锰过氧化物酶（MnP）能将愈创木酚氧化成四邻甲氧基连酚，呈红棕色。平板显色反应试验结果显示，蜜环菌发酵过程中能够产胞外锰过氧化物酶。

（2）锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）酶活的测定

参照杜海萍等方法。粗酶液的制备：吸取2 mL发酵培养基中的发酵液，于10000 r/min，离心10 min，即得粗酶液，用于下列酶活性测定实验。

MnP酶活测定：反应体系为3.4 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(浓度为200 mmol/L、pH值4.5)、0.1 mL 6 mmol/L的MnSO

一个酶活单位(U)每分钟氧化1 μmol Mn

由图8可知，在本试验中的DON降解率与MnP酶活增长趋势基本一致，在随着蜜环菌发酵产MnP酶活性的增加，DON降解率也随着不断增加。MnP酶活在144 h前随着发酵培养时间的延长，酶活不断提高，最高值出现在第144 h，最高酶活为105.23 U/L，MnP酶活在144 h后开始下降；随着发酵时间的延长，DON降解率也在逐步提高，在第144h DON降解率最高，此时的降解率为63.83%，降解率在144h后开始平稳下降，156 h、168 h降解率分别为62.86%、63.08%；在36-60 h时，DON降解率和酶活性均出现了大幅度提高，DON降解率由15.23%升高至38.24%，MnP酶活由43.69 U/L升高至72.34U/L。通过Pearson相关性分析DON降解率与MnP酶活间的相关关系，结果表明，在0.01显著性水平上DON降解率与MnP酶活相关性显著，相关性为0.989，说明蜜环菌对DON的降解作用与锰过氧化物酶有关。

实施例4 蜜环菌Am-07-22菌种降解玉米赤霉烯酮的实验

玉米赤霉烯酮ZEN固体标准品购于青岛普瑞邦（Pribolab）生物工程有限公司，固体标准品用甲醇溶液稀释，配制成浓度为100μg/mL的ZEN标准储备液，于-20℃避光保存。

一、蜜环菌降解ZEN效果的测定

将制备好的蜜环菌Am-07-22二级发酵种子培养液打碎，接种至含有ZEN含量为5μg/mL的10mL液体培养基中，接种量为10%，然后将反应体系在27℃，160rpm/min的恒温摇床中振荡避光反应7d。取1mL上清液加入1mL甲醇溶液进行ZEN的提取，然后在10000rpm/min的条件下低温离心10min，再经过0.22μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱仪检测ZEN的含量，并计算ZEN的降解率。ZEN降解率计算公式如下：

结果：通过向培养基中添加5μg/mL的ZEN，并利用蜜环菌Am-07-22菌株进行发酵降解，由图9的高效液相色谱图可知蜜环菌Am-07-22对5μg/mL ZEN的降解效果良好，降解率可达73.83%。

二、ZEN浓度对蜜环菌Am-07-22降解的影响

将制备好的蜜环菌Am-07-22二级发酵种子培养液打碎，接种至含有ZEN浓度分别为2μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL的10mL液体培养基中，接种量为10%，每个菌种3个平行，然后将反应体系在27℃，160rpm/min的恒温摇床中振荡避光反应7d。提取ZEN后使用高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的含量，每组三个平行，并计算ZEN的降解率。

如图10A所示，蜜环菌Am-07-22对不同浓度的ZEN的降解率有所不同，当初始浓度为2μg/mL 时降解率可达97.32%，ZEN浓度为5μg/mL时具有73.83%的降解率，而当ZEN的浓度升至10μg/mL和 15μg/mL时，降解率则更低分别为49.47%和32.55%。由此可见降解率随着ZEN浓度的升高而下降。但从图10B中可以看出当初始浓度为2μg/mL 时对ZEN的降解量为19.46μg，初始浓度为5μg/mL时对ZEN的降解量为36.5μg，而在初始浓度为10μg/mL和15μg/mL时可降解ZEN的量则均超过了48.82μg，并且差异不显著，因此蜜环菌Am-07-22对ZEN的降解量逐渐升高且趋于稳定。在低浓度时，初始ZEN的含量本身较低，尽管降解率很高但最终的降解量依然较低，而在高浓度时初始ZEN的含量则较高，即使降解率有所下降，但降解量却不断增高，最后逐渐稳定达至降解上限。

三、培养时间、温度、pH和接种量对蜜环菌Am-07-22降解ZEN的影响

将打碎的蜜环菌Am-07-22二级种子液接种至含有ZEN浓度分别为5μg/mL的10mLpH分别为4、5、6、7、8、9的液体培养基中，接种量分别为2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%，然后将反应体系在18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃，160 rpm/min的恒温摇床中振荡避光反应1～12d。使用高效液相色谱仪检测玉米赤霉烯酮的含量，每组三个平行，并计算ZEN的降解率。

由图11A可知，蜜环菌Am-07-22对ZEN的降解率随着培养时间的延长而逐渐增大（P<0.05），从最开始的第1d降解率仅为21.37%上升至第7d的73.83%。而第8-12d的降解率升至80%左右，此时降解率的差异已不显著，表明第8-12d的降解率最高并已趋于稳定。

由图11B可知，在18℃～27℃的范围内蜜环菌Am-07-22对ZEN的降解率随温度的升高而增大（P<0.05），从18℃时39.92%的降解率升高至27℃时73.83%。而在27℃～33℃的条件下，降解率反而随温度升高而下降（P<0.05），其中在33℃时对ZEN降解率为45.52%。这表明过高或过低的温度对蜜环菌Am-07-22降解ZEN的影响较大，在不适宜的温度条件下蜜环菌的生长环境变差，因此对ZEN的降解率也会降低。

由图11C可知，在pH值 4.0～9.0范围内随着pH值的增大，蜜环菌Am-07-22对ZEN的降解率呈现先升高后降低的趋势（P<0.05），pH值为7.0时的降解率最高可达75.22%。而pH值为4.0及9.0时的降解率仅为45.89%和61.97%。这说明在过酸或过碱的环境下，降解效果均会受到影响。在强酸或强碱的培养条件下会影响ZEN的降解，在pH值为7.0-8.0的环境中降解效果最佳，降解率达到最高。这与Tan等的研究结果相近。

由图11D可知，随着蜜环菌Am-07-22菌液接种量的增加，对ZEN的降解率逐渐升高（P<0.05）。最终在接种量为10%至15%时趋于恒定，此时的降解率最高均高于73%。这表明了蜜环菌Am-07-22在此时的生长环境中已然达到最大的生长量，接种量的增加也不会表现出对ZEN降解率的升高。

四、蜜环菌Am-07-22降解ZEN活性成分的分布

将蜜环菌Am-07-22重新接种于液体种子培养基中，在27℃恒温摇床中以160rpm/min转速的条件下振荡培养6d。过滤收集所得到的菌丝体及发酵上清液，对降解ZEN的菌体种子发酵液活性成分进行定位，共分3组进行，以含有浓度为5μg/mL的ZEN作为对照组，每组取3个重复样品进行试验。

参考金博文的方法对不同组进行处理，A组（发酵上清液）：取过滤后的上层发酵液，在4℃，10000rpm/min的条件下低温离心10min，收集上清液1mL。B组（菌丝体组）：称取过滤后的下层菌丝体1g，用PBS缓冲液轻轻漂洗3-5次。C组（细胞破碎组）：称取过滤后的下层菌丝体1g，用PBS缓冲液轻轻漂洗3-5次，进行细胞超声破壁处理2h（200W，工作5s，间歇5s），然后在10000rpm/min的条件下低温离心10min，收集胞内液1mL。将制备后的实验组加入稀释后的ZEN储备液，体系中ZEN的浓度为5μg/mL，反应体系在27℃、160rpm条件下避光振荡培养7d。

从图12中可以看出蜜环菌Am-07-22不同组分对ZEN的降解效果差异较为明显（P<0.05）。其中发酵上清液对ZEN的降解率最高为47.42%，而Am-07-22菌体细胞的降解率为37.05%，破碎后的菌体细胞对ZEN的降解率最低仅为13.08%。由此可以推断，蜜环菌Am-07-22对ZEN的降解起主要作用的为发酵上清液，推测可能是某种胞外活性物质，而菌体细胞对ZEN也有一定程度的吸附作用。

五、蜜环菌Am-07-22降解ZEN活性物质性质的初步分析

参考景思源的处理方法对活性物质进行分析，分3组处理：1组（蛋白酶K组）：取5mL发酵上清液，加入250μL蛋白酶K（终浓度为0.1mg/mL），55℃处理2h。2组（SDS组）：取5mL发酵上清液，加入250μLSDS（终浓度为0.5mg/mL），55℃处理2h。3组（蛋白酶K+SDS组）：取5mL发酵上清液，加入250μL蛋白酶K（终浓度为0.1mg/mL）和250μLSDS（终浓度为0.5mg/mL），55℃处理2h。4组（100℃沸水浴组）：取5mL发酵上清液，在100℃条件下沸水浴处理20min。

将不同处理后的4组发酵上清液用0.22μm滤膜过滤后，向其中加入ZEN储备液,体系中ZEN的浓度为5μg/mL，反应体系在27℃、160rpm条件下避光振荡培养7d。结束后使用高效液相色谱仪检测ZEN含量并计算降解率。同时用初始浓度为5μg/mL ZEN的发酵上清液作为对照组。

由图13可知，通过对蜜环菌发酵上清液进行蛋白酶K、SDS、沸水浴等处理，发现以上几种处理方式对ZEN降解有不同影响（P<0.05）。蛋白酶K和SDS处理后的降解率分别为12.65%和22.89%，蛋白酶K+SDS共同处理的降解效果与蛋白酶单独处理的降解效果差异则不显著。而沸水浴后对ZEN的降解率仅为5.55%，降解能力明显下降。因此可以进一步推断出蜜环菌Am-07-22发酵上清液中对ZEN降解其主要作用的活性物质为胞外酶。

六、发酵时间、pH、金属离子对蜜环菌Am-07-22发酵上清液降解ZEN的影响

参考韦锦范的方法并加以改进，按照上述方法收集蜜环菌Am-07-22的发酵上清液，向其中加入浓度为5μg/mL ZEN标准溶液，于27℃，160rpm的条件下振荡反应。分别在反应时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d取样测定反应体系中ZEN含量的变化，并计算降解率。分析不同时间对蜜环菌Am-07-22发酵上清液降解ZEN的影响。另外再取发酵上清液分别调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10，以及向其中加入浓度为10mmol的Na

由图14A可知，随着发酵时间的延长蜜环菌Am-07-22发酵上清液对ZEN的降解率逐渐增大（P<0.05），从第1d 的21.69%降解率上升至第10d的62.50%降解率，而蜜环菌产漆酶的酶活力也随着发酵时间的延长逐渐升高，第1d的酶活仅为169.26U/L，而第10d的酶活则上升至521.11U/L，在这期间漆酶的酶活力不断升高（P<0.05），这与ZEN的降解率升高保持一致。

由图14B可以看出不同pH值对蜜环菌Am-07-22发酵上清液对ZEN的降解率影响较大。其中在pH为6-7时，ZEN的降解率最高为46.98%和51.84%。两者与不调节pH值的发酵上清液对照组没有显著性差异。而在酸性及碱性条件下，对ZEN的降解率较低（P<0.05），在pH值为3和10时的仅有8.29%和11.22%的降解率。表明了过酸或过碱的条件下，对发酵上清产生的酶破坏作用更强，导致无法有效地降解ZEN。

由图14C可知，不同金属离子对蜜环菌Am-07-22发酵上清液降解ZEN的影响效果不尽相同，其中Na

实施例5蜜环菌Am-07-22菌种降解真菌毒素的应用

1、人工侵染玉米皮、玉米黄粉：参照窦勇等试验方法，向供试原料（玉米皮、玉米黄粉）中分别加入无菌水稀释的50μg/mL的DON溶液，混合均匀，分别制备成毒素含量为5 μg/g、7.5 μg/g、10 μg/g、12.5 μg/g的玉米皮和玉米黄粉。

2、降解实验

蜜环菌固态、液态发酵玉米皮的降解试验：本试验的料液比为加入的固态料（玉米皮）的质量与培养基液体体积的比值；分别以1:2.5和1:5的料液比进行固态、液态发酵，培养基pH值5.8，于培养温度27.5℃进行发酵培养。同时设置不进行发酵的玉米皮为对照组。

蜜环菌固态、液态发酵玉米黄粉的降解试验：料液比为加入的固态料（玉米黄粉）的质量与培养基液体体积的比值；分别以1:1和1:2.5的料液比进行固态、液态发酵，培养基pH值5.8，于培养温度27.5℃进行发酵培养。同时设置不进行发酵的玉米黄粉为对照组。

结果：从不同发酵方式降解DON的结果来看，如图15，蜜环菌在发酵降解玉米皮中DON的应用研究中，固态发酵和液态发酵后DON降解率分别为89.48%、76.33%，其在降解玉米皮中DON时固态发酵方式效果更好；而蜜环菌在发酵降解玉米黄粉中DON的应用研究中，固态发酵和液态发酵后DON降解率分别为46.26%、74.68%，其液态发酵方式降解玉米黄粉中DON的效果更好。因此，本试验研究蜜环菌对于两种不同发酵原料中DON的降解效果，对玉米皮采用固态发酵方式、玉米黄粉采用液态发酵方式时降解效果好。玉米黄粉、玉米皮等玉米深加工副产物中富含蛋白、膳食纤维等生物活性组分，实验室前期研究证实食用真菌对这些活性组分具有高效生物转化能力，大大拓宽了这些加工副产物的应用范围。

蜜环菌固态发酵不同DON浓度玉米皮的降解试验：以料液比1:2.5向培养基中加入玉米皮，使培养基中DON浓度为2、3、4、5 μg/g，培养基pH值5.8，于培养温度27.5℃进行固态发酵培养。同时设置不进行发酵的玉米皮为对照组。

在蜜环菌固态发酵玉米皮的应用研究中，对于发酵不同浓度玉米皮对DON降解率的影响结果如图16，蜜环菌对含有不同毒素浓度的玉米皮的DON降解率为89.48%、85.24%、87.93%、73.35%。在DON浓度为2、3、4 μg/g时，蜜环菌发酵降解呕吐毒素的降解率趋于平稳，在DON浓度为2 μg/g时降解效果最好。但将DON浓度提高至5 μg/g时，DON降解率下降，降解效果下降，在较高浓度时，DON会对菌株Am-07-22的生长产生抑制作用，而不能正常代谢产生能够降解DON的活性物质。

蜜环菌液态发酵不同DON浓度玉米黄粉的降解试验：以料液比1:2.5向培养基中加入玉米黄粉，使培养基中DON浓度为2、3、4、5 μg/mL，培养基pH值5.8，于培养温度27.5℃，160 rpm条件下液态发酵培养。同时设置不进行发酵的玉米黄粉为对照组。

结果：在蜜环菌液体发酵玉米黄粉的应用研究中，对于发酵不同浓度玉米黄粉对DON降解率的影响结果如图17，蜜环菌对含有不同毒素浓度的玉米黄粉的DON降解率为74.68%、75.98%、57.75%、56.46%。随着毒素浓度的增加，DON降解率呈现下降趋势。在DON浓度为2、3μg/g和DON浓度为4、5μg/g时，蜜环菌发酵降解呕吐毒素的降解效果差异不显著，在DON浓度为3μg/g时降解效果最好。随着毒素浓度的升高，DON会抑制蜜环菌的生长产生，而不能正常代谢产生降解DON的活性物质使降解效果下降。