一种延缓番茄果实成熟的方法

技术领域

本发明涉及果实成熟调控技术领域，尤其涉及表没食子儿茶素没食子酸酯在延缓番茄果实成熟中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科番茄属一年生或多年生草本植物，也是世界大宗蔬菜之一。番茄果实味美多汁，营养价值高，既可生食、煮食，也可加工成番茄酱等食品，深受消费者喜爱。

果实的成熟是一个复杂的过程，其直接影响果实商品性和市场竞争力。番茄是典型的呼吸跃变型果实，开始成熟时呼吸速率加快并合成大量乙烯，同时在乙烯响应因子ERF的调控下，果实内部发生大规模的转录调控从而影响成熟进程。研究番茄果实成熟机制进而调控果实成熟周期，不仅可以有效管理商品番茄的货架期，改善果实品质，还对调控其他呼吸跃变型果实的成熟周期，减少经济损失，保障周年均衡供应等有重要的借鉴作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)，化学名为(2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)色烷-3-基3,4,5-三羟基苯酸酯，分子式为C

EGCG是从茶树叶片中分离提取的儿茶素类单体，是绿茶主要的活性和水溶性成分，同时也是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9％-13％。EGCG结构中的酚羟基可为氧化还原反应提供氢原子，生成的自由基中含有稳定性较高的邻苯二酚结构；B环的邻二羟基儿茶酚结构和二氢吡喃的2,3-双键都可作为接受活性氧的位点，使得EGCG具有超强的抗氧化能力。体外实验表明，EGCG的抗氧化活性至少是维生素C的100倍，是维生素E的25倍(李光达等.基于免疫调节探讨茶多酚及表没食子儿茶素没食子酸酯的抗肿瘤机制.中国药房,2022,33(24):3067-3072)。药理学研究中表明，EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤等作用。

外源EGCG能提高拟南芥对灰霉病菌(Hong等.Epigallocatechin-3-gallatefunctions as a physiological regulator by modulatin g the jasmonic acidpathway.Physiologia Plantarum,2015,153:432–439)和番茄对烟草花叶病毒(Zhang等.Epigallocatechin-3-gallate enhances tomato resistance to tobacco mosaicvirus by modulating RBOH1-dependent H

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效延缓番茄果实成熟的方法，以延长番茄果实的货架期。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在延缓番茄果实成熟中的应用。

本发明研究发现将表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)外源应用于番茄果实能够明显延缓番茄果实成熟。试验结果显示，表没食子儿茶素没食子酸酯处理后的番茄果实在成熟过程中，其乙烯合成速率显著低于相同贮藏条件下对照处理的番茄果实，其果实外果皮硬度显著高于相同贮藏条件下对照处理的番茄果实。

进一步的，所述应用包括：将绿熟期的番茄果实于含有表没食子儿茶素没食子酸酯的水溶液中浸泡后，风干。

绿熟期到微熟期的番茄果实已充分长成，用于贮藏或长距离运输的番茄一般在这一时期采收。采收的果实直接浸泡于含有表没食子儿茶素没食子酸酯的水溶液中，使得表没食子儿茶素没食子酸酯附着于果实表面。

进一步的机理研究发现，番茄果实经表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液浸泡后，其外果皮中ACC氧化酶(Aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO)基因ACO1、ACC合成酶(Aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS)基因ACS2、纤维素酶(Cellulose，CEL)基因CEL2和细胞壁松弛蛋白(Expansin，EXP)基因EXP1的表达量显著降低。

机理研究表明，番茄果实外源浸泡EGCG可显著抑制乙烯合成过程中ACC氧化酶和ACC合成酶的表达，有效减少果实成熟过程中乙烯的生成；并同时抑制果实软化过程中细胞壁松弛蛋白和纤维素酶的表达，减缓果实外果皮的软化，从而延缓番茄果实的成熟，延长番茄果实的货架期。

本发明还提供了一种延缓番茄果实成熟的方法，包括：将采收后的番茄果实浸泡于含有表没食子儿茶素没食子酸酯和表面活性剂的水溶液中，浸泡完成后，将番茄果实取出风干；所述水溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.5～1.5mmol/L。

作为优选，浸泡时间为0.5～2h。

更为优选，所述水溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为1mmol/L，浸泡时间为1h。

作为优选，浸泡后于室温下风干。

表面活性剂可使水溶液制剂在果实表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强，有效减少制剂的损耗，提高制剂药效，减少制剂的用量，延长制剂的有效期。作为优选，所述表面活性剂为食品级单甘酯、食品级吐温80、食品级聚甘油酯或食品级司盘60中的一种或多种。其中食品级单甘酯表面活性剂价格更为低廉，且在提高本发明制剂的延展性、降低制剂表面张力方面的效果更显著，更易被果实吸收。

作为优选，所述水溶液中表面活性剂体积占比为1‰-1％。

本发明还提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备延缓番茄果实成熟的制剂中的应用。

以1L计，所述制剂的组成包括：表没食子儿茶素没食子酸酯229～688mg、表面活性剂0.001～0.01L、水为余量。

作为优选，以1L计，所述制剂的组成包括：表没食子儿茶素没食子酸酯458mg、表面活性剂0.001L、水为余量。

根据最终用途的不同可适当混合其他有机溶剂如乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液(pH 7.2)等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种利用表没食子儿茶素没食子酸酯延缓番茄果实成熟的方法，对于EGCG发掘了全新的用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明制剂中的有效成分为EGCG，其通过抑制番茄果实内乙烯合成基因的表达，减少果实成熟过程中乙烯的生成；同时抑制细胞壁修饰基因的表达，减缓番茄果实外果皮的软化，从而延缓番茄果实的成熟。

附图说明

图1为实施例1中绿熟期番茄果实成熟过程中不同浓度制剂处理和对照处理对番茄果实表型的影响。

图2为实施例1中绿熟期番茄果实成熟过程中不同浓度制剂处理和对照处理对番茄果实的乙烯合成的影响和外果皮硬度的影响；

其中，A：EGCG在番茄成熟过程中对番茄果实乙烯合成速率的影响；B：EGCG在番茄成熟过程中对番茄果实外果皮硬度的影响；小写字母a、b、c代表相同取样时间内不同番茄果实外果皮硬度数值之间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例2中绿熟期番茄果实成熟过程中制剂处理和对照处理对番茄果实基因表达的影响；

其中，A：番茄果实ACC氧化酶基因(ACO1)相对表达量；B：番茄果实ACC合成酶基因(ACS2)相对表达量；C：番茄果实外果皮中纤维素酶基因(CEL2)相对表达量；D：番茄果实外果皮细胞壁松弛蛋白基因(EXP1)相对表达量；*、***分别代表不同基因表达量数值之间在5％、0.1％水平上的差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种‘浙樱粉1号’。表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG(CAS号：989-51-5)；食品级单甘酯(CAS号：123-94-4)。

实施例1

1、制备制剂工作液

分别取表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG 229、458、688g溶于0.999L的水中搅拌使其充分溶解，向溶液中加入0.001L食品级单甘酯，搅拌均匀后获得不同浓度的制剂原液。

制剂工作液由0.1L不同浓度的制剂原液加至100L清水中混合均匀而得。

2、番茄果实的处理

将绿熟期的番茄果实浸没在制剂工作液中浸泡1h，后于室温处风干1h，以浸没在含等量食品级单甘酯的清水中的番茄果实作为对照。

经制剂工作液及对照处理后的番茄果实在相同的条件下(25℃，85％相对湿度，16h/8h的昼夜周期)贮藏，并在浸泡处理后0、4、8、12d取样。

3、果实乙烯合成速率的测定

将四个番茄果实密封在一个500mL的气密瓶中，在25℃下密封1h，后用注射器从顶部抽出1mL气体样品，并将其注入配有火焰电离检测器的气相色谱仪(6890N GC system；Agilent，Folsom，CA，USA)。此外，还记录了番茄果实的重量，以每克鲜重(FW)为基础计算乙烯生成量。

乙烯合成速率的计算方法为：乙烯释放速率nL g

4、果实外果皮硬度的测定

用TA-XT2i质构仪(Stable Micro Systems Ltd，Godalming，UK)测定番茄果皮的硬度，探头直径为5.0mm。侵彻深度为10mm，侵彻速度设定为1mms

5、结果分析

结果显示，本实验所用的不同浓度制剂工作液处理均能明显延缓番茄果实的成熟(图1)。制剂处理后的番茄果实在成熟过程中，其乙烯合成速率显著低于相同贮藏条件下对照处理的番茄果实(图2A)，制剂处理后的番茄果实在成熟过程中，其果实外果皮硬度显著高于相同贮藏条件下对照处理的番茄果实(图2B)，其中1mM浓度的制剂工作液效果最优。

实施例2

1、制备制剂工作液

取EGCG 458g溶于0.999L的水中搅拌使其充分溶解，向溶液中加入0.001L食品级单甘酯，搅拌均匀后获得不同浓度的制剂原液。

制剂工作液由0.1L不同浓度的制剂原液加至100L清水中混合均匀而得。

2、番茄果实的处理

将绿熟期的番茄果实浸没在制剂工作液中浸泡1h，后于室温处风干1h，以浸没在含等量食品级单甘酯的清水中的番茄果实作为对照。

经制剂工作液及对照处理后的番茄果实在相同的条件下(25℃，85％相对湿度，16h/8h的昼夜周期)贮藏，并在浸泡处理后0、4d取样。

将番茄果实外果皮切碎并于液氮中研磨成细粉，储存在-80℃，并进行下一步分析。

3、果实基因表达量的测定

利用qRT-PCR技术测定乙烯合成过程中的关键酶ACC氧化酶基因ACO1(Solyc07g049530)和ACC合成酶基因ACS2(Solyc01g095080)的相对表达量以及果实软化过程中关键基因纤维素酶基因CEL2(Solyc09g010210)和细胞壁松弛蛋白基因EXP1(Solyc06g051800)的相对表达量。

方法如下：

按照制造商的说明，使用RNA提取试剂盒(Omega Bio Tek，Norcross，GA，USA)从番茄果实粉末中提取总RNA。

使用HiScrip II Q RT SuperMix for qPCR Kit(Vazyme Biotech，南京，中国)将0.5μg总RNA反转录成cDNA。

qRT-PCR实验在Light

ACO1：F：5’-ACAAACAGACGGGACACGAA-3’；

R：5’-CTCTTTGGCTTGAAACTTGA-3’。

ACS2：F：5’-GAAAGAGTTGTTATGGCTGGTG-3’；

R：5’-GCTGGGTAGTATGGTGAAGGT-3’。

CEL2：F：5’-ACACATTGCCAAACGTCAGGT-3’；

R：5’-CCCCTATGGTGAATCCTTTGTG-3’。

EXP1：F：5’-TGGTTCCTTCTCATTGGCAATTTGG-3’；

R：5’-TTCAGTGAGGACTCGATTTCTTTTCC-3’。

PCR反应程序为95℃，3min；在95℃，30s，58℃，30s，72℃，1min条件下进行45个循环。

结果显示，制剂处理后的番茄果实在成熟过程中，乙烯合成过程中的关键酶ACC氧化酶基因ACO1和ACC合成酶基因ACS2的相对表达量显著低于对照组(图3A，B)，同时果实软化过程中关键基因纤维素酶基因CEL2和细胞壁松弛蛋白基因EXP1的相对表达量也显著低于对照组(图3C，D)。

由此可见，本发明制剂能有效延缓番茄果实的成熟。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联系到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。