月季甾醇合成基因RhHYDRA1及其在调控植物乙烯敏感性中的应用

技术领域

本申请涉及生物基因工程技术领域，具体涉及月季甾醇合成基因RhHYDRA1及其在调控植物乙烯敏感性中的应用。

背景技术

乙烯是一种能够响应外界刺激的植物激素，参与调控植物的生长发育以及物质代谢等。有研究表明乙烯可以诱导微管组织的重建，从而诱导植物下胚轴的伸长(Ma et al.,2018a)。乙烯可以通过调节植物细胞的伸展来影响植物器官的生长，乙烯通过剂量效应来调控黄瓜果实的伸长(Xin et al.,2019)；植物的花器官同样受到乙烯的影响，对切花月季‘萨曼莎’的研究表明，乙烯可以通过抑制花瓣远轴面亚表皮细胞的伸张来使花器官变小(Ma et al.,2008；Pei et al.,2013)。

乙烯还可以和多种内源激素协调作用共同调控植物对环境的适应性，如乙烯和茉莉素可以协同调控植物的生长发育和其对病原菌的抵抗能力。有研究发现，EIN3和EIL1能够与茉莉素一同调控根的发育以及植物对病原菌的抗性(Zhu et al.,2011)。乙烯和生长素可以协同调控植物根的生长，乙烯可以促进生长素的合成和运输。已有研究鉴定出位于IR1/AFB2下游特异调控根部乙烯反应的一个新因子MHZ2/SOR1，研究发现SOR1参与生长素介导的乙烯反应信号转导机制(Chen et al.,2018)。与此同时，大量的植物生理学试验证明了乙烯和赤霉素(GA)能够共同参与植株节间伸长的过程。AP2/ERF转录因子OsEATB介导的乙烯和GA之间的相互作用很有可能是导致水稻节间伸长差异的原因。乙烯负调控OsEATB的表达,而OsEATB在节间伸长过程中能够下调GA生物合成中贝壳杉烯合酶A基因的表达，因此其间接降低水稻内源GA水平，最终起到抑制乙烯诱导GA响应的作用(Qi et al.,2011)。但乙烯与甾醇两者间是如果调控月季对乙烯敏感性的响应仍然未有报道。

月季(Rosa hybrida)属于蔷薇科蔷薇属，有花中皇后之美称，是重要的园艺作物。月季花朵的开放、衰老进程均受到植物激素乙烯的调节，故乙烯信号转导途径的相关研究对于其抗衰抗逆等具有重要意义。申请人从乙烯转录组数据库中筛选得到的候选基因RhARGOS-LIKE(RhARL)，研究发现RhARL受乙烯剧烈诱导表达且ARGOS基因家族在拟南芥、玉米中被证实可作为负调节子参与调控植株乙烯敏感性，进一步并筛选出其互作蛋白RhHYD1，但RhHYD1作为在乙烯信号转导途径中的功能尚未明确。

发明内容

为了实现本发明的目的，本发明在第一方面提供了月季甾醇合成基因RhHYDRA1(有时称为RhHYD1)。

在一些优选的实施方式中，月季甾醇合成基因RhHYDRA1包含引物RhHYD-3’Xbal-F中除了酶切位点序列之外的序列，所述引物RhHYD-3’Xbal-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一些优选的实施方式中，月季甾醇合成基因RhHYDRA1包含引物RhHYD-3’KnpI-R中除了酶切位点序列之外的序列，所述引物RhHYD-3’KnpI-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在另一些优选的实施方式中，月季甾醇合成基因RhHYDRA1包含如下引物序列或者可以通过如下引物序列检测到：(i)引物TRV1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；(ii)引物TRV1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；(iii)引物TRV2-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明在第二方面提供了月季甾醇合成基因RhHYDRA1在调控植物对乙烯的敏感性中的应用。

在一些优选的实施方式中，通过抑制植物中的RhHYDRA1的表达来降低植物对乙烯的敏感性。

在另一些优选的实施方式中，所述抑制通过RhHYDRA1的沉默表达来实现。

在另一些优选的实施方式中，所述沉默表达通过选择RhHYDRA1基因上的长度为496bp的特异序列作为沉默片段来构建载体，所述沉默片段包含如下引物序列中的至少一个：(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物RhHYD-3’Xbal-F；(2)核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的引物RhHYD-3’KnpI-R。

在另一些优选的实施方式中，通过在植物中过表达RhHYDRA1来提高植物对乙烯的敏感性。

在另一些优选的实施方式中，通过在植物中过表达RhHYDRA1来提高植物对乙烯的敏感性，并由此促进植物下胚轴的生长。

在另一些优选的实施方式中，通过在植物中过表达RhHYDRA1来提高植物对乙烯的敏感性，并由此促进植物花朵的开放和/或果实的成熟。

本发明在第三方面提供了甾醇或甾醇剥夺剂在调节植物对乙烯的敏感性中的应用。

本发明在第四方面提供了月季甾醇合成基因RhHYDRA1在调节植物的与该RhHYDRA1与RhARL互作有关的生物活动中的应用。

在另一些优选的实施方式中，本发明第一至四方面中所述的植物为蔷薇科植物尤其是月季；和/或所述植物为十字花科植物尤其是拟南芥。

本发明具有如下技术效果：

通过调节月季甾醇合成基因RhHYDRA1的表达，例如通过过表达RhHYDRA1或者通过抑制表达RhHYDRA1，可以调节植物对乙烯的敏感性。在过表达的情况下，可以通过促进植物对乙烯的敏感性，从而促进植物下胚轴的生长，从而增加以下胚轴作为收获器官的植物的产量；另外，可以通过促进植物对乙烯的敏感性，从而促进乙烯对植物产生的有利的影响，例如促进花朵的开放或果实的成熟等。在抑制过表达的情况下，可以通过降低植物或植物器官对乙烯的敏感性，从而降低乙烯对植物产生的不利影响，例如，可以通过抑制对乙烯的敏感，延长果实的贮藏期或鲜切花的观赏寿命或保鲜时间等。

附图说明

图1显示RhHYD1(有时也称为RhHYDRA1)和RhARL的LCI互作试验，采用烟草叶片的荧光强度检测，其中，L：荧光信号弱，H：荧光信号强。

图2显示乙烯处理下RhHYD1和RhARL的LCI互作试验。

图3显示拟南芥RhHYD1过表达株系的ACC处理试验。其中，(A)表示RhHYD1过表达拟南芥株系半定量检测；(B)RhHYD1过表达拟南芥株系对ACC敏感性增强；(C)表示ACC处理下拟南芥RhHYD1过表达株系和对照株系的下胚轴长度统计(N＝30)；(D)表示ACC处理下拟南芥RhHYD1过表达株系和对照株系的根长统计(N＝30)。星号表示经t检验过表达株系与WT相比存在统计学差异(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图4显示月季花朵不同开放阶段RhHYD1基因沉默表达量检测。其中，S1表示第一阶段，花蕾尚未打开，为乙烯处理初始状态；S2表示第二阶段，为S1和S3的中间阶段；S3表示第三阶段，花朵开放程度和乙烯处理后状态类似；Eth表示10ppm乙烯处理24h后花朵状态。

图5显示乙烯处理后RhHYDA1植株花瓣开放统计图。其中，(A)用5ppm乙烯对TRV2和TRV2-RhHYD1植株进行处理；(B)15株基因沉默组和8株对照组的最外层花瓣展开角度统计；(C)将开放角度分为0°-30°和30°-60°两组对23株月季苗分类。

图6显示拟南芥植株ACC处理后甾醇含量变化。其中，(A)左图为菜油甾醇(campesterol)标准曲线，右图为ACC处理后菜油甾醇含量变化；(B)左图为β-谷甾醇(beita-sitosterol)标准曲线，右图为ACC处理后β-谷甾醇含量变化；(C)左图为豆甾醇(stigomasterol)标准曲线，右图为ACC处理后豆甾醇含量变化。(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图7显示月季植株甾醇剥夺剂处理实验。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料与方法

试验材料

月季组培苗生长条件。扩繁培养基：4.4g/l MS，30g/l蔗糖，1.0mg/l 6-BA，0.05mg/l NAA，1.0mg/l GA3，pH 5.85～5.95，6.8g/l琼脂粉。月季组培苗在扩繁培养基上培养30d后，将生长一致，健壮的组培苗转移至生根培养基上，剩余的幼苗继续放置在新的扩繁培养基上培养。生根培养基：4.4g/l MS，30g/l蔗糖，0.1mg/l NAA，pH 5.85～5.95，7.5g/l琼脂粉。

将RhHYD1过表达拟南芥株系种子、Col-0型拟南芥株系种子、ein2突变拟南芥株系种子用10％NaClO进行表面消毒5～6min，然后用灭菌水洗5～6次，播种在含有ACC培养基(2.2g/l MS，30g/l蔗糖，pH 5.8，7g/l琼脂，10μmol ACC)上。将MS板放置于4℃冰箱2d。春化后，将种子转移到培养室中。7d后，将幼苗转移至含有基质(蛭石/营养土＝1：1)的小钵中。生长条件：22±2℃，50％空气湿度，16h/8h光周期。

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)

为了构建沉默载体，为明确RhHYD1的功能，根据RhHYD1蛋白序列比对的结果，选择RhHYD1基因上的特异序列496bp作为沉默片段构建载体。根据pTRV2载体上的多克隆酶切位点，结合RhHYD1沉默片段酶切位点分析，确定XbaI和KpnI为酶切位点。通过PCR扩增带有XbaI和KpnI酶切位点的RhHYD1基因沉默片段，将沉默片段连入pTRV2沉默载体。PCR引物列于表1中。将pTRV1，pTRV2，pTRV2-RhHYD1，转化农杆菌GV3101。挑取单克隆，至含有7.5ml抗性LB培养液的50ml离心管，28℃，200rpm摇菌，过夜培养，PCR检测目的片段。按1:50或1:100稀释倍数，将摇好菌液加入含有100ml新鲜LB培养液(50μg/l Kan，25μg/l Rif)的500ml三角瓶中。并加入1ml 1M MES，40μl 50mM乙酰丁香酮。5000rpm室温离心10min，集菌；侵染液(100ml水，1ml 1M MES，1ml 1M MgCl，400μl 50mM乙酰丁香酮，调pH至5.6)重悬，调OD600＝1.0，将含有pTRV1和pTRV2、pTRV1和pTRV2-RhHYD1的重悬菌液等比混合，暗处静置3～6h。将整个小植株浸没在含有pTRV1和pTRV2或pTRV2-目的片段(OD600＝1.0)的侵染缓冲液中，并在–0.8kg/cm下进行两次真空，每次5min。用蒸馏水清洗小植株，然后移植到含有蛭石：营养土＝1：1(v/v)的小盆中，23℃，相对湿度60～70％，16h/8h光周期下生长。用塑料薄膜覆盖小盆以保持湿度7～10d。生长1个月后，取幼嫩叶片提取RNA，检测沉默效率。检测引物详见表2。

半定量RT-PCR分析

月季花瓣总RNA提取采用热硼酸盐法提取，按照实验室前期方法(Ma et al.,2006)。拟南芥总RNA使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取。用HiScript II Q RT SuperMixfor qPCR(Cat.R123-01,Vazyme)反转录试剂盒，以1μg总RNA为模板合成第一链cDNA。使用StepOne Real-Time PCR System(Applied Biosystems)，用KAPA SYBR FAST UniversalqRT-PCR试剂盒(Kapa Biosystems)进行qRT-PCR反应(含有1μl cDNA模板的20μl体积)。用月季RhUBI基因(GenBank登录号JK622648)和拟南芥AtActin2(GenBank登录号NM_112764)作内参基因。半定量引物列于表2。

植物甾醇含量的测定

7d大的拟南芥Col-0植株，包括对照组和ACC处理组，液氮取样后进行冷冻干燥。称10mg冻干样本，快速研磨后加入离心管中。向离心管中倒入10mL三氯甲烷:甲醇(1:1)溶液并涡旋充分混匀，混匀后55℃条件下超声萃取30min。随后5000rpm条件下离心5min，将上清液转移到新的离心管中氮吹干燥，沉淀重复上述步骤。在干燥好的离心管中加入2Ml 2moL/L盐酸-甲醇溶液，混合均匀，在80℃条件下酸化1h。随后加入4mL 4moL/L氢氧化钾-甲醇溶液，混合均匀，在80℃条件下皂化1h。接着向皂化溶液中加入10mL正己烷，涡旋以充分混合，55℃条件下超声萃取30min，随后在5000rpm条件下离心5min，将上清液加入到新的离心管中。重复上述步骤的操作3次。随后在5000rpm条件下离心5min，取上清液至于新的离心管中，合并萃取液。用超纯水洗涤3遍萃取液(加水慢摇晃10下，静置分层后弃去下层水相)直至pH为中性，然后通过滤纸上盛有无水硫酸钠的漏斗过滤至新的容器中。转移萃取液氮吹干燥，至体积为1mL左右，转移至2mL离心管中，并对离心管进行润洗。12000rpm条件下离心5min，将上清液转移到新离心管中，氮气吹干。随后加入100uL硅烷化试剂，65℃条件下衍生化1h，将衍生化试剂氮吹干燥后加入1mL色谱级正己烷，混合充分。将溶液过有机相滤膜，至液相小瓶中即可用气质分析。随后进行标准曲线绘制和样品测量。

甾醇剥夺剂处理试验

选取月季组培苗生根后放入蛭石和泥炭土1:2(V:V)的培养基中栽培，待其长出花蕾且花蕾松动却未打开时将其剪下，分别置于装有5ml 10mM甲基-β-环糊精(MβCD，Methyl-β-cyclodextrin)溶液和5ml H2O的50ml离心管中作为试验组和对照组。将两组共同置于密闭玻璃缸中，加入10ppm浓度乙烯气体，处理12h后进行开箱观察，拍照记录。

萤火虫荧光素酶片段互补试验

设计带有XhaⅠ和SacⅠ酶切位点的特异性引物，将需要验证互作的目的基因RhHYD1和RhARL基因片段分别构建在pCAMBIA-NLuc和pCAMBIA-CLuc的载体上。构建载体所需引物见表1。随后将构建好的载体质粒其转入农杆菌GV3101中。材料：烟草幼苗长至4～6叶，用于侵染。用1ml一次性注射器去掉针头后吸取菌液，从烟草背后靠近主叶脉处进行注射，直至菌液浸透叶片。注射后的烟草在23℃培养室中培养3d，16h/8h光周期。随后将烟草取出将叶片背面朝下贴在A4纸上，喷洒含有0.01mM荧光素底物的Luciferin侵染液，黑暗条件下静置6min，随后将其平放在曝光暗室中，拍照记录。

结果与分析

乙烯对RhHYD1和RhARL互作的影响

申请人在之前的研究中对候选基因RhARL进行了功能验证，并筛选出其互作蛋白RhHYD1，为了验证RhHYD1和RhARL的互作效应并探索乙烯是否能够影响二者的互作效应，发明人采用了萤火虫荧光素酶互补成像法来检测。分别将RhHYD1和RhARL两个基因构建到pCAMBIA-NLuc和pCAMBIA-CLuc载体上，注射烟草后进行LUC荧光拍照。发明人首先验证了RhHYD1和RhARL二者之间的互作。LUC图像结果显示，空载的NLuc和CLuc以及RhARL单一基因插入CLuc载体的农杆菌共渗均不能产生LUC荧光，而RhARL、RhHYD1两基因分别插入NLuc和CLuc载体后的农杆菌共渗出现了LUC互补荧光，且互换两基因插入的载体后依然出现荧光，这证实了二者之间确实存在互作关系(图1)。经过13次生物学重复实验，结果稳定并一致，由于RhHYD1、RhARL分别插入到NLuc和CLuc载体的组合互作亮度明显大于另一种组合，因此发明人选取该组合用于后续乙烯处理实验。

为了探索乙烯是否能够影响二者的互作效应，发明人设计了乙烯处理实验。将RhHYD1单一基因构入到pCAMBIA-NLuc载体上作为对照。LUC图像结果显示RhHYD1和RhARL分别构入pCAMBIA-NLuc和pCAMBIA-CLuc载体上后能够出现LUC荧光，而乙烯处理后LUC荧光的亮度减弱(图2)。该实验经过7次生物学重复，实验结果趋势一致，这说明经过乙烯处理后，RhHYD1和RhARL两者的互作强度减弱。

过表达拟南芥株系的乙烯敏感性

为了进一步探索RhHYD1基因是否参与调控乙烯信号转导途径，发明人首先通过半定量方法检测了阳性植株中RhHYD1基因的表达水平，且通过潮霉素抗性筛选最终确定三个纯合T2代株系用于后续表型观察(图3-A)。发明人分别以拟南芥哥伦比亚野生型株系WT和乙烯不敏感突变体ein2株系作为正负对照，通过10μM ACC处理检测RhHYD1过表达纯合株系的乙烯敏感性。结果如图3-B、3-C显示，ein2经ACC处理后下胚轴长度无显著差异，为完全不敏感类型，而RhHYD1过表达株系L1-7处理前下胚轴长度显著长于WT，处理后显著短于WT；其根长在处理前与WT无显著差异而处理后显著低于WT，故该株系乙烯敏感性增强。株系L4-6下胚轴长度在处理前同样显著长于WT，处理后二者没有差异；其根长在处理前显著长于WT，处理后无差异，因此该株系乙烯敏感性增强。株系L5-4虽在处理前与WT相比无显著差异，但其在ACC处理后下胚轴长度显著低于WT；其根长在处理前与WT无差异而处理后显著低于WT，故该株系乙烯敏感性同样有所增强。综上所述，RhHYD1过表达株系的乙烯敏感性增强。

VIGS-RhHYD1瞬时沉默月季植株的乙烯敏感性

为进一步探索RhHYD1基因在月季花中的功能表型，发明人以‘萨曼莎’组培苗为材料，利用VIGS技术瞬时沉默该基因，待植株出现花蕾后对其进行乙烯处理观察统计表型。通过对月季花朵不同开放阶段的RhHYD1基因表达量检测发现其表达量一致且不受乙烯处理的影响(图4)。

S1表示第一阶段，花蕾尚未打开，为乙烯处理初始状态；S2表示第二阶段，为S1和S3的中间阶段；S3表示第三阶段，花朵开放程度和乙烯处理后状态类似；Eth表示10ppm乙烯处理24h后花朵状态

经半定量检测确认瞬时沉默成功后的植株用于后续乙烯敏感性试验的调查。按照图5A中标准选取对照组TRV2和试验组TRV2-RhHYD1萼片舒展但花蕾尚未打开的植株。经5ppm乙烯处理24h后花朵均出现明显的乙烯响应表型，如图5A中示意图中图例所示花瓣展开并出现一定程度向内折卷，对其展开角度进行测量发现试验组TRV2-RhHYD1花瓣展开角度平均值小于30°而对照组TRV2花瓣展开角度平均值大于40°(图5B)。将其分类后发现对照组所有统计花朵花瓣展开角度均大于30°且小于60°，而试验组超过一半的花朵花瓣展开角度处于30°以下(图5C)。结果表明RhHYD1基因沉默后的月季苗在乙烯处理24h后开放程度明显弱于对照组，这说明RhHYD1基因沉默能够降低月季花中乙烯诱导的花朵开放程度即月季花朵开放对乙烯的敏感程度降低了。

乙烯处理后拟南芥植株内源甾醇含量变化

为了进一步探索乙烯对植物甾醇含量的影响，发明人利用GC-MS对AAC处理前后的哥伦比亚野生型拟南芥植株进行了甾醇含量测定。结果如图6所示，ACC处理后野生型拟南芥植株中菜油甾醇的平均含量为0.4209mg/g干重，β-谷甾醇的平均含量为1.7745mg/g干重，均显著低于ACC处理前；而植株中豆甾醇的含量均值为0.2122mg/g干重，较ACC处理前无显著差异。有趣的是，相比于对照组，野生型拟南芥经ACC处理后内源甾醇含量变化趋势类似于hyd突变体相比于WT的变化趋势。该结果与过表达RhHYD1后植株乙烯敏感性增强的表型相符，发明人推测乙烯/ACC处理后该基因功能可能通过与RhARL互作而受到抑制。

甾醇剥夺剂对月季植株乙烯敏感性的影响

为探索植物甾醇含量的变化对植物乙烯敏感性的影响，发明人将月季植株在长出花苞后剪下分别插入水和甾醇剥夺剂MβCD溶液中，密封后注入10ppm乙烯气体。乙烯处理12h后花朵均有所展开，但较为对照组，插入MβCD溶液中的月季花朵展开程度要明显偏低。实验结果表明插入MβCD溶液中的切花在同样浓度和时间的乙烯处理下抑制了花瓣的展开程度。

讨论

首先，为探索RhHYD1对植物乙烯敏感性的影响，发明人先在拟南芥中过表达了RhHYD1，通过ACC处理实验发现处理后的拟南RhHYD1过表达纯合株系出现了典型的乙烯三重反应，根部和下胚轴长度均有显著缩短，且通过与野生型WT对比发现其缩短趋势更为显著即拟南芥RhHYD1过表达植株的乙敏感性得到增强。这显示RhHYD1可能通过积累乙烯或调节乙烯受体ETR1的活性来间接影响植物的乙烯信号传递。

随后，为了进一步验证RhHYD1在月季植株中的功能作用，发明人构建了VIGS-RhHYD1载体，利用农杆菌转化法转入到月季组培苗中。实验发现基因沉默后的月季植株花朵的开放程度远不如对照组的月季植株开放程度，这说明RhHYD1的沉默使月季植株对于乙烯诱导的开花现象减弱，即RhHYD1基因沉默降低了月季的乙烯敏感性。在拟南芥和月季植株中的实验共同证实了RhHYD1与植物乙烯的信号传导有关并且属于乙烯的正调节因子。乙烯受体的相互作用对乙烯信号转导中起着重要作用。单个受体基因的表达模式是不同的并可以相互重叠，并且在不同的植物组织中乙烯受体复合物表达模式也存在差异，这表明受体的相互作用和信号传导是一个非常复杂的调节过程.

本申请通过萤火虫荧光素酶片段互补图像技术验证并证实了ARGOS LIKE基因RhARL与RhHYD1之间存在互作关系，且不同组合方式影响了二者的互作强度，这可能是由于影响了融合蛋白的空间结构而造成的。而通过后续的乙烯处理实验发现在10ppm乙烯处理下的RhHYD1和RhARL之间的互作强度明显减弱，这说明乙烯在一定程度上抑制了两者的互作。由此发明人推测RhARL通过与RhHYD1互作来实现对植株乙烯敏感性的影响。

表1构建载体引物序列

表2拟南芥过表达和月季基因沉默基因表达量检测引物

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

为方便参考，将全文引用到的文献集中列于此处。

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