一种HPLC-MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种HPLC-MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法。

背景技术

瑞卢戈利(Relugolix)为促性腺激素释放激素(GnRH)拮抗剂，对下丘脑垂体GnRH受体有选择性的拮抗作用，阻断GnRH的作用。其由日本武田制药与日本ASKA制药公司联合开发，于2019年1月8日获日本PMDA批准上市，商品名为瑞卢戈利

治疗性药物监测及仿制药临床研究时需要测定受试者或患者的血药浓度以研究其药动学行为。为了加速瑞卢戈利的临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。目前，Liying Xing等(An Efficient UPLC-MS/MS Method Established toDetect RelugolixConcentration in Rat Plasma[J].ORIGINAL RESEARCH.2022(6)，13：874973.)开发了一种高效的UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中瑞卢戈利的浓度的方法，但该法分析灵敏度较低(定量范围为0.7-1000ng/mL)，且该法使用来他替尼作为内标物质，不利于样品分析的准确性。

基于现有技术中瑞卢戈利检测存在的问题，需要开发一种前处理操作简单，并兼顾灵敏度、准确度、分析速度的分析方法，以适用于临床研究大批量样本的准确分析。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种HPLC-MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种HPLC-MS/MS法检测血浆中瑞卢戈利的方法，包括以下步骤：

(1)预处理：在血浆样品中加入乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液，加水稀释后，得供试品；

(2)采用HPLC-MS/MS检测经过预处理的血浆样品，经内标定量法测定其中瑞卢戈利的含量，其中：

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱；

流动相A：含0.2％甲酸和5mM醋酸铵的水溶液，流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：0-0.5min：流动相B为45％；0.5-1.0min：流动相B为45％→85％；1.0-1.5min：流动相B为85％；1.5-1.6min：流动相B为85％→45％；1.6-2.0min：流动相B为45％；

柱温：35-45℃；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；喷射电压为5000V；离子源温度为500℃；

所述内标物质为瑞卢戈利-d6。

在一些实施方式中，向血浆样品中加入内标溶液，经处理得到含内标物质的供试品；所述内标溶液为瑞卢戈利-d6经甲醇溶解后，以乙腈-水(50∶50，v/v)稀释得到。在一些实施方式中，内标溶液的加入量为血浆样品的0.5-2倍，优选为等体积。

在一些实施方式中，步骤(1)中，所述血浆样品的体积为30-100μL，优选为40-60μL，例如50μL。在一些实施方式中，血浆样品中瑞卢戈利的含量为0.100-60.0ng/mL。

在一些实施方式中，步骤(1)中，供试品中内标物质的含量为1.00-4.00ng/mL，优选为2.00ng/mL。

在一些实施方式中，步骤(1)中，血浆样品与乙腈的体积比为1∶(1-5)，优选为1∶(3-5)，例如1∶4。

在一些实施方式中，步骤(1)中，离心后取的上清液，经加水稀释后，样品不易挥发，利于样品的保存和检测的准确度；加入的水量为上清液体积的0.5-2倍，优选加水的量与上清液等体积。

在一些实施方式中，步骤(2)中，柱温为40℃；流动相流速为0.5mL/min；进样量为5.00μL。

在一些实施方式中，步骤(2)的质谱条件中，气体1(Gas1)：50psi，气体2(Gas2)：50psi，气帘气体(Curtain Gas)：35psi，碰撞诱导解离：6psi，驻留时间：200ms。

在一些实施方式中，步骤(2)的质谱条件中，瑞卢戈利定量分析离子对：m/z624.3→548.2，碰撞能量(CE)：35eV，去簇电压(DP)：100V；瑞卢戈利-d6定量分析离子对：630.3→548.2，碰撞能量(CE)：35eV，去簇电压(DP)：100V。

有益效果：

1、本发明方法具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取、一步稀释即可进行分析，提取后样本易于保存；且该方法分析速度较快(分析时间仅为2min)，适合大批量临床研究样品分析。

2、临床研究中，检测方法的灵敏度的提高可以降低受试者的服药量，增加临床研究的安全性。本发明所述方法灵敏度较高，血浆用量低(血浆用量可以仅为50.0μL)，瑞卢戈利定量下限为0.100ng/mL，检测限经计算为0.00500ng/mL，柱上待测物的量按照稀释倍数12以及进样量5μL计算为0.00208pg。

3、本发明线性范围选择合理(线性范围为0.100-60.0ng/mL)，能够更准确地测定低含量的药物浓度。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明方法中瑞卢戈利产物离子扫描质谱图。

图2是本发明方法中瑞卢戈利-d6产物离子扫描质谱图。

图3是本发明方法中空白血浆样品中瑞卢戈利(左)和瑞卢戈利-d6(右)的MRM色谱图。

图4是本发明方法中定量下限样品中瑞卢戈利(左)和瑞卢戈利-d6(右)的MRM色谱图。

图5是本发明方法应用于临床研究中1名健康受试者单次口服40mg瑞卢戈利片后瑞卢戈利的药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立分析方法。

本发明方法中血浆用量可以仅为50.0μL，适合临床研究生物分析；本发明中预处理方法选用蛋白沉淀法，该方法对瑞卢戈利有较高的回收率，并且操作简单、提取时间短、无须耗时的浓缩步骤。配合96孔板使用，适合临床研究中高通量样品预处理。

本发明实施例中色谱分离采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，该色谱柱对待测物和内标均有较好的保留，且峰形尖锐。色谱分析中采用的流动相中加入了0.2％甲酸，利于正离子的质子化；加入的醋酸铵，作为改良剂可以改善峰形，提高积分准确度。该模式下仪器分析通量较高，色谱运行时间仅为2.0min，检测快速，适用于临床研究大批量样品分析。

缩写说明

实施例1

1材料

1.1仪器

色谱仪：LC-30AD快速液相色谱系统，日本岛津公司。

质谱仪：5500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI)加拿大Sciex公司。

数据处理采用软件：Analyst(version 1.6.3)，加拿大Sciex公司。

离心机：TGL-16RC型台式离心机，山东百欧医疗科技有限公司。

分析天平：BCE55I-10CN型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2对照品和试剂

瑞卢戈利(含量96.35％)购自PANPHY化学品公司。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司。甲酸(HPLC级)购自TCI公司。醋酸铵(HPLC级)购自ROE公司。蒸馏水屈臣氏公司制备。

2方法

2.1溶液及样品的配制

标准系列样品：精密称取各瑞卢戈利对照品适量，以甲醇分别溶解并定容，配制成瑞卢戈利约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品，瑞卢戈利浓度范围分别为0.100-60.0ng/mL。

质控样品：采用与标准系列样品相似方法配制4个浓度水平的瑞卢戈利混合质控样品。定量下限浓度为0.100ng/mL，低质控(low quality control，LQC)浓度为0.300ng/mL，次中质控(accessorial medium quality control，AMQC)浓度为2.50ng/mL，中质控(medium quality control，MQC)浓度为18.0ng/mL，高质控(high quality control，HQC)浓度为45.0ng/mL。

内标溶液：精密称取瑞卢戈利-d6对照品，以甲醇溶解并定容，配制成浓度约为0.100mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述内标贮备液适量，加乙腈：水(50：50，v/v)稀释，获得瑞卢戈利-d6浓度为2.00ng/mL的内标溶液。

2.2血浆样品处理

1)96孔板中加入50.0μL血浆样品，50.0μL内标溶液(瑞卢戈利-d6的浓度为90.0ng/mL)，200μL乙腈；

2)涡流混匀，离心10min(4℃，3900rpm)；

3)取150μL上清液到另一干净96孔板中；

4)加入150μL水，涡流混匀。

2.3色谱及质谱条件

色谱条件：

质谱条件：

瑞卢戈利产物离子、瑞卢戈利-d6产物离子的扫描质谱图见图1和图2。

2.4方法学验证

按照中国药典9012指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率、基质效应等。

选择性：

取六个来源不同的空白血浆及各自配制的定量下限样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于定量下限待测物峰面积的20％，小于内标峰面积的5％。

标准曲线：

以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W＝1/x

精密度和准确度：

方法验证每一分析批测定五个浓度质控样本各六样本。定量下限批内、批间精密度以相对标准差(RSD)计算小于20％方可接受，准确度以相对偏差计算(RE)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分批内、批间精密度需小于15％方可接受，准确度在-15％～15％之间方可接受。

稳定性：

考察各待测物在血浆样品中的稳定性时，将LQC和HQC置于不同温度及环境中，放置结束后进行六样本分析。共考察四种放置条件，分别为：室温放置23h，提取后进样器内放置92h，经历5次冷冻-解冻循环(从-80℃(设置温度)到室温)，-80℃(设置温度)放置90天。

回收率：

取空白血浆50.0μL，提取后(不加内标溶液)加入待测物溶液和内标溶液，使最终浓度与LQC、MQC和HQC相同，进样测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份，进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。

基质效应：

取六个不同来源正常空白血浆，分别配制低、高两个浓度质控血浆样品，每一浓度进行3样本分析。并以正常血浆配制的标准曲线测定。

2.5临床研究

应用上述建立的方法分析临床研究血浆样本中瑞卢戈利的浓度，用于瑞卢戈利人体药动学研究。临床研究经过医院伦理委员会批准，受试者在试验前均被告知试验风险，自愿签署知情同意书。30名健康受试者给予40mg瑞卢戈利片。于给药前(0h)、给药后72h内不同时间点，采集静脉血取血各4mL，置K

3结果与讨论

3.1方法学验证

选择性

如图3、图4所示，瑞卢戈利、瑞卢戈利-d6保留时间均约为1.23min，保留时间处无共流出干扰峰。

标准曲线

测定瑞卢戈利临床研究血浆样本中瑞卢戈利的线性范围分别为0.100-60.0ng/mL。待测物标准曲线典型直线回归方程分别为：

瑞卢戈利：y＝0.431x-0.00608；

检测限

定量下限样品中瑞卢戈利浓度为0.100ng/mL，信噪比分别为100。按照信噪比为5计算检测限分别为0.00500ng/mL。柱上待测物的量按照稀释倍数12以及进样量5μL计算为0.00208pg。

精密度和准确度

精密度、准确度结果均符合接受标准，结果见表1。

表1.测定人血浆中精密度和准确度

回收率

LQC、MQC和HQC浓度水平：瑞卢戈利的提取回收率分别为95.6％、96.0％和96.5％；瑞卢戈利-d6的回收率分别为100.3％。

基质效应

LQC、HQC浓度水平下每一来源每浓度QC样品测定值的CV％＜15.0％；每一来源每浓度QC样品测定平均值RE％不超过±15.0％，以上结果表明，基质效应不干扰待测物分析的准确性。

血浆稳定性考察

血浆稳定性试验结果见表2，结果表明在考察条件下瑞卢戈利均稳定。

表2.瑞卢戈利在人血浆中的稳定性(n＝6)

4人体药动学研究

将验证后的方法用于分析血浆中瑞卢戈利，以评价瑞卢戈利药动学特征。1名健康受试者单次口服40mg瑞卢戈利片，血浆药物浓度-时间曲线见图5，检测方法灵敏度可完整描绘瑞卢戈利的药动学特性，并且线性范围的选择与实际样本的浓度水平接近，测定准确性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。