一种美洲大蠊PCR鉴定引物及鉴定方法
文献发布时间:2023-06-19 10:10:17
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种美洲大蠊PCR鉴定引物及使用该引物鉴定美洲大蠊的方法。
背景技术
美洲大蠊(Periplanetaamericana)属昆虫纲,蜚蠊目,蜚蠊科,俗称蟑螂。在我国作为药用始见于《神农本草经》。性味:味咸、性寒;归经:肝、脾、肾经。现代药理学研究表明其提取物中含有多种糖蛋白、氨基酸和多肽等活性成分,具有增强机体免疫力、保护肝脏、促进组织修复和广泛的抗肿瘤等作用。目前美洲大蠊已开发成3种药品上市销售,分别为康复新液、肝龙胶囊、心脉隆注射液,用于皮肤黏膜损伤、肝炎和心衰治疗。
作为康复新液主要原料的美洲大蠊,其质量标准收载于湖南省中药材标准、云南省中药材标准以及四川省中药材标准。目前地方标准的定性采用薄层色谱鉴别方法。其中,湖南省中药材标准和云南省中药材标准以丙氨酸作为对照,四川省中药材标准以美洲大蠊对照药材为对照。试验表明(可提供研究图谱),混伪品与正品几乎无法区别,不能确定是否会采用蜚蠊目其他属种的昆虫替代美洲大蠊投料,故迫切需要寻找美洲大蠊专属性鉴别方法。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法是体外酶促合成特定基因或DNA片段的方法。其基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,主要由变性、退火、延伸三个基本反应构成一个周期,循环进行。DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受环境因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此,较之传统鉴定方法,PCR法进行物种鉴别更准确可靠,特别是在珍稀贵重药材的鉴定方面有独特优势。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种美洲大蠊PCR鉴定引物及使用该引物鉴定美洲大蠊的方法。
为了实现上述目的,本发明的一方面提供了一种美洲大蠊PCR鉴定引物,所述引物序列如下:
上游引物为:5'-AGAATATTAATTCGTGCTGAGCTCG-3';
下游引物为:5’-TGGGTATACTGTTCATCCTGTTCCG-3'。
本发明的另一方面提供了一种鉴定美洲大蠊的方法,包括以上述的上游引物和下游引物作为PCR引物通过PCR方法对鉴定物DNA样本进行扩增反应,如有290bp扩增条带,则该鉴定物为美洲大蠊。
在本发明的一个实施方案中,一种鉴定美洲大蠊的方法包括以下步骤:
1)提取待鉴定物的总DNA;
2)以步骤1)提取的总DNA为模板,以上述的上游引物和下游引物作为PCR引物通过PCR方法对鉴定物DNA样本进行扩增反应;
3)使用琼脂糖凝胶电泳检测步骤2)中得到的PCR扩增反应产物,如有290bp扩增条带,则该鉴定物为美洲大蠊。
上述步骤中PCR扩增反应的反应条件为:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环反应30次,最后72℃延伸10分钟,4℃保温。
本发明提供的技术方案达到了如下的有益效果:1)选择了区分力好、适合动物鉴别的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)序列进行PCR引物设计,并根据美洲大蠊与其他三种混伪蜚蠊科品种(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)COI基因的差异片段进一步设计筛选出特异性最佳的引物对,可以将美洲大蠊与其它蜚蠊科品种区分开来;2)该方法普遍适用于幼虫、成虫等不同生长期美洲大蠊的鉴别;3)本方法取材量少、无特殊组织要求,适合美洲大蠊药材及药材粉末的鉴别需求。4)此法专属性强,操作简单,成本低,易应用于美洲大蠊的质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明实施例2的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版,或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
一、引物设计
根据美洲大蠊COI基因序列,寻找美洲大蠊与其他三种混伪蜚蠊科品种(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)COI基因的差异片段进一步设计筛选出特异性最佳的引物,引物序列如下:
上游引物为:5'-AGAATATTAATTCGTGCTGAGCTCG-3';
下游引物为:5'-TGGGTATACTGTTCATCCTGTTCCG-3'。
二、DNA提取
取鉴定物待测样品0.5g,置乳钵中,加液氮适量,充分研磨使成粉末,取2~3mg置1.5ml离心管中,用动物基因快速抽提试剂盒提取DNA,加入裂解液96μl,混合酶4μl,涡旋混匀,在55℃水浴保温15分钟,再置95℃水浴保温5分钟,向上述样品中加入终止液100μl,涡旋混匀,离心(转速为每分钟12000转)10分钟,取上清液,作为供试品溶液,置零下20℃保存备用。另取美洲大蠊对照药材,同法制成对照药材模板DNA溶液。
三、PCR扩增反应
反应体系为在200μl离心管中进行,反应总体积为20μl,反应体系为10μl预混合试剂2×(含有2×普通Taq DNA聚合酶,2×PCR缓冲液,2×dNTP和2×上样缓冲液),鉴别引物(10μmol/L)各0.8μl,模板1μl,无菌双蒸水7.4μl。将离心管置PCR仪,PCR反应参数:95℃预变性3分钟,95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,共循环反应30次,最后72℃延伸10分钟,4℃保温。
四、电泳检测
照琼脂糖凝胶电泳法(中国药典2015年版四部通则0541),胶浓度为1.5%,胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed。供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为4μl,DNA分子量标记上样量为4μl(90ng/μl)。电泳结束后,取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。
实施例1
采用本发明提供的美洲大蠊PCR鉴定引物及其鉴定方法对美洲大蠊、德国小蠊、杜比亚和土鳖虫的DNA样本按照上述具体实验方法进行了美洲大蠊鉴定,其琼脂糖凝胶电泳图见图1。图1中从右到左依次为:M-DL500Marker;1-美洲大蠊对照药材;2-美洲大蠊;3-德国小蠊;4-杜比亚;5-土鳖虫;6-空白。
对图1电泳图分析,根据目的片段大小进行美洲大蠊的真伪判定。从美洲大蠊对照药材及美洲大蠊药材中提取的DNA(见图1中标记1和2)经PCR扩增后,在1.5%琼脂糖凝胶电泳胶板290bp处出现单一扩增条带。而从其他蜚蠊科,如:德国小蠊(见图1中标记3)、杜比亚(见图1中标记4)、土鳖虫(见图1中标记5)中提取的DNA经PCR扩增后,在1.5%琼脂糖凝胶电泳胶板290bp处未出现单一扩增条带。以上结果说明本方法可用于美洲大蠊药材真伪的鉴定。
实施例2
采用本发明提供的美洲大蠊PCR鉴定引物及其鉴定方法,对美洲大蠊对照药材和其余26批不同产地、不同生长周期的美洲大蠊以及3批混伪品(德国小蠊、杜比亚、土鳖虫)进行鉴别,其琼脂糖凝胶电泳图见图2。图2中M为DL500 Marker,其余编号及对应样品信息如下表所示:
结果表明,美洲大蠊对照药材、不同产地及不同生长周期的美洲大蠊均在290bp处出现单一扩增条带,而3种不同混伪品均未在290bp处出现单一扩增条带,说明本方法能稳定准确地鉴别不同产地、不同生长周期的美洲大蠊以及混伪品。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述,但在本发明的基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进,均落入本发明的保护范围内。
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