一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法

技术领域

本发明属于烟草工业技术领域，具体涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是一类烟碱的总称，仅存在于烟草及烟气中的一类N-亚硝胺基类化合物，目前已经分离鉴定出的TSNAs共有8种，研究较为深入的主要包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)，这些物质具有较强的致癌性，对人体健康危害极大。

早在1962年，国际上就首次报道了关于TSNAs的潜在致癌作用，会导致人类口腔、食道、胃、肺部、胰脏、肝脏等部位形成肿瘤，其中，NNN和NNK对啮齿动物具有强致癌性，NNK被国际癌症研究机构(IARC)确定为Ⅰ类致癌物(IARC GroupⅠ)，可使动物和人体组织中的DNA出现甲基化，引发肿瘤的可能性增大。烟叶TSNAs含量降低的实现，对提高烟草品质，减轻TSNAs对人体健康及生活环境带来的危害均具有重要意义。因此，降低烟草特有亚硝胺含量对提高烟草品质和安全性至关重要，已成为近年的研究热点。

研究表明，烟草特有亚硝胺(TSNAs)在成熟采收的鲜烟叶中含量极低，主要在烟叶的调制过程中产生和积累。前人已在多方面探索了降低烟叶中亚硝胺(TSNAs)的方法，其中多涉及烤烟和卷烟的工艺环节等，如在烘烤调制过程中改用热交换式烤房，以避免明火燃烧产生的气体与烟叶接触，从而在烘烤过程中降低烟叶中TSNAs含量；或者通过化学方法，在烟叶调制过程中加入VC、VE等亚硝酸盐抑制剂或其他可与亚硝酸盐的分解产物反应的物质，通过减少TSNAs合成的前体物来实现TSNAs含量的降低；还有通过物理技术，采用微波辐射技术或者在烟丝中加入负载金属氧化物的沸石等来实现卷烟中TSNAs含量的降低。以上方法在降低TSNAs的同时，常常伴随成本高、污染较大、降解效果有限等缺陷。

应用微生物来降低烟叶中的TSNAs具有成本低、生态相容性好、无二次污染等优点，因而通过接种菌种降低烟叶TSNAs是较为理想的途径。但目前关于微生物降低TSNAs报道还不多，作用方式均为喷施、喷洒或涂布，即在烟叶进行晾晒、烘烤、发酵等调制或制丝过程中通过喷洒含特殊菌株的发酵菌剂将菌株接种至烟叶或烟丝中，然后进行常规烟叶调制或制丝，对TSNAs的降低效果不明显，且研究多数集中在白肋烟、雪茄烟，鲜少有烤烟的报道。

发明内容

针对现有技术存在的微生物采用喷施、喷洒或涂布方式应用对烟草特有亚硝胺(TSNAs)的降低效果不明显的技术问题，本发明提供一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法。

本发明的技术方案：

一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，将烘烤后的烟叶磨成粉末，加入无机盐基础培养基中配制液态发酵体系用烟草培养基，在发酵开始时向所述烟草培养基中加入短小芽孢杆菌05-5402菌液，置于25-28℃条件下5-10天，进行烟叶的液态发酵，以降解烟叶中TSNAs；所述短小芽孢杆菌05-5402菌株的保藏编号为CGMCC No.7418。

该发酵方法包括如下步骤：

步骤一、烟叶粉碎：将烘烤后的烟叶磨成烟叶粉末，得到发酵原材料；

步骤二、菌液制备：将保藏状态的所述短小芽孢杆菌05-5402菌种经菌种活化得到含发酵菌剂的菌液，所述短小芽孢杆菌05-5402菌株的保藏编号为CGMCC No.7418；

步骤三、烟叶发酵：将所述烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中，制成烟草培养基，在发酵开始时向所述烟草培养基中加入用所述短小芽孢杆菌05-5402菌种配置的菌液，封口，进行烟叶的液态发酵，发酵温度25-28℃、发酵时间5-10天。

所述菌液的OD

所述菌液的接种量为所述烟草培养基总体积的1％。

按照烟叶粉末(g):无机盐培养基(g)＝1:9的比例配制液态发酵体系用所述烟草培养基。

所述菌种活化为将保藏状态的所述短小芽孢杆菌05-5402菌种接种于LB固体培养基上，28℃培养10～12h至长出单菌落，挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，28℃培养24～48h得到发酵菌剂，然后用无菌去离子水将所述发酵菌剂的OD值调至OD

所述LB液体培养基成分以g/L计：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；所述LB固体培养基在所述液体培养基的基础上按照15g/L的配比添加琼脂粉。

所述烟叶的液态发酵在恒温振荡培养箱中进行，发酵温度25-28℃、发酵时间5-10天，转速为160rpm/min。

所述无机盐基础培养基成分以g/L计：K

所述烘烤后的烟叶为烘烤后的硃砂烟烟叶。

本发明的有益效果：

本申请在使用特别筛选的短小芽孢杆菌05-5402(保藏编号为CGMCC No.7418)菌株的基础上，首次采用液态发酵方式用于降低烟叶TSNAs，极大提高了烟叶中TSNAs的去除效率。在发酵开始时按照一定的接种量向由烟叶粉末和无机盐基础培养基形成的液态发酵体系中加入用短小芽孢杆菌05-5402菌种配置的菌液。与向烟叶或烟丝中喷洒发酵菌剂的固态发酵方式不同，本申请将菌液加入含烟叶粉末的液态无机盐培养基中进行液态发酵，与常规培养基里含有足够菌株生长所需的营养物质不同，本申请采用的无机盐基础培养基只含有无机盐成分，没有外源添加碳源和氮源，因此本申请以液态模式发酵不外加任何碳源和氮源，仅以所述烟叶粉末的化学成分作为液态发酵体系中菌株的唯一营养源，以尽可能多的利用烟叶中的化合物，从而提高烟叶中TSNAs降解率。同时本申请基于05-5402菌株的自身繁衍特性，通过在液态发酵过程中调控发酵条件为25-28℃下发酵5-10天，给菌株提供了适于生存的环境，从而提高接种菌株的存活率及活跃度，实现短小芽孢杆菌05-5402对烟叶特有亚硝胺的高效定向降解，烟叶的TSNAs含量降低幅度可达13.99％～31.99％，显著降低了烟叶TSNAs对人体健康及生活环境带来的危害。另外该菌株使用成本低，菌液应用于烟叶的操作便捷，在发酵过程中即可以达到降低TSNAs的目的，能高效定向降解烟叶中TSNAs含量且抗逆性好。该方法具有环境友好、操作简便的优点，具有较高的推广应用价值。

控制菌液的OD

控制接种量为微生物领域常用的优选接种量，具体为所述菌液占所述烟叶培养基总体积的1％。

按照烟叶粉末(g):无机盐基础培养基(g)＝1:9的比例配制液态发酵体系用烟草培养基。

控制短小芽孢杆菌05-5402的菌种活化步骤和条件为：将保藏状态的所述短小芽孢杆菌05-5402菌种接种于LB固体培养基上，28℃培养10～12h至长出单菌落；挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，28℃培养24～48h得到发酵菌剂；然后通过向所述发酵菌剂中加入适量的无菌去离子水，测试菌液直到吸光值为2.0，得到OD

所述LB固体培养基成分以g/L计：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；所述LB固体培养基在上述液体培养基的基础上按照15g/L的配比添加琼脂粉。采用为微生物可生长的通用培养基—LB，确保菌株正常生长。

液态发酵体系置于恒温振荡培养箱中进行液态发酵，发酵温度25-28℃、发酵时间5-10天，转速为160rpm/min。振荡是为了让菌保持正常的繁殖速度，以使菌种在适宜温度和发酵时间下生长、繁殖，具有较高活性，提高烟叶中TSNAs降解率。

所述无机盐基础培养基成分以g/L计：K

所述烘烤后的烟叶为烘烤后的硃砂烟烟叶，也可用于其它烘烤后的烟叶。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，将烘烤后的烟叶磨成烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中，制成烟草培养基；在发酵开始时向所述烟草培养基中加入用短小芽孢杆菌05-5402菌种配置的菌液；以所述烟叶粉末作为液态发酵体系中菌株的唯一营养源，进行烟叶的液态发酵，发酵温度25-28℃、发酵时间5-10天。所述短小芽孢杆菌05-5402菌株的保藏编号为CGMCC No.7418。

该发酵方法，包括如下步骤：

步骤一、烟叶粉碎：将烘烤后的烟叶磨成烟叶粉末，得到发酵原材料。

为了挑选合适粒径，便于烟叶粉末充分与菌种接触，所述烟叶粉末过50目筛。

所述烘烤后的烟叶为常规烘烤后的烟叶，例如硃砂烟烟叶。所述常规烘烤后的硃砂烟烟叶为将采收的鲜烟叶采用烟杆绑烟叶烘烤，烘烤过程根据烟叶叶色的变化分为变黄、定色、干筋三个阶段，共计需调制时间7～10天。所述硃砂烟是一种优质烤烟品种，例如，云烟87改良品种—硃砂2号，其具有独特的糯米香、尼古丁含量较低。

步骤二、菌液制备：将保藏状态的所述短小芽孢杆菌05-5402菌种经菌种活化得到含发酵菌剂的菌液，所述短小芽孢杆菌05-5402菌株的保藏编号为CGMCC No.7418。

所述菌种活化为将保藏状态的所述短小芽孢杆菌05-5402菌种于LB固体培养基上划线，置于28℃恒温培养箱中培养10～12h至长出单菌落；挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中，置于28℃、150rpm/min恒温振荡培养箱中培养24～48h得到发酵菌剂，然后向发酵菌剂中加入适量的无菌去离子水，并测量菌液此时在600nm处的吸光值，调节吸光值为2.0，得到OD

所述LB液体培养基成分以g/L计：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；所述LB固体培养基在上述液体培养基的基础上按照15g/L的配比添加琼脂粉。

步骤三、烟叶发酵：将所述烟叶粉末加入到所述无机盐基础培养基中，制成烟草培养基，在发酵开始时向所述烟草培养基中加入用所述短小芽孢杆菌05-5402菌种配置的菌液，封口，进行烟叶的液态发酵，发酵温度25-28℃、发酵时间5-10天。

所述菌液从发酵一开始就施加于液态发酵体系中，从而以所述烟叶中化学物质作为所述菌株的唯一营养源生长、繁殖。

所述无机盐基础培养基成分以g/L计：K

按照烟叶粉末(g):无机盐基础培养基(g)＝1:9的比例配制液态发酵体系用烟草培养基。OD

在配制烟叶培养基时，还包括将所述烟草培养基置于120℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，得到无菌的烟叶培养基的步骤。确保发酵过程中只有加入的05-5402菌存在并发挥降解TSNAs的作用。

进行液态发酵时，将液态发酵体系置于25-28℃恒温振荡培养箱中，转速为160rpm/min，发酵时间5-10天。

实施例1

实施例1涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，将液态发酵体系于28℃发酵5天。

该液态发酵方法包括以下步骤：

步骤一、烟叶粉碎：将烘烤后的烟叶磨成烟叶粉末，然后过50目筛，得到发酵原材料。

所述烘烤后的烟叶为常规烘烤后的硃砂烟烟叶，种植于云南省玉溪市研和镇的硃砂烟，成熟后采摘中部烟叶，在试验基地烘烤后收集烟叶，研磨成粉末后用于发酵。烘烤过程根据烟叶叶色的变化分为变黄、定色、干筋三个阶段，共计需调制7～10天。

步骤二、菌液制备：将甘油管保存的经过分离、筛选及纯化工序获得的短小芽孢杆菌05-5402菌种于LB固体培养基上划线，然后置于28℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落；挑选一颗单菌落转接至5ml LB液体培养基中，置于28℃、150rpm/min恒温振荡培养箱中培养48h得到发酵菌剂，然后加入适量的无菌去离子水并测量菌液此时在600nm处的吸光值，调节吸光值为2.0，得到菌液。

所述短小芽孢杆菌05-5402菌株的保藏编号为CGMCC No.7418。

步骤三：烟叶发酵，发酵过程如下：

取5.00g烟叶粉末于三角瓶中，加入45ml无机盐基础培养基定容至50ml制成烟草培养基，将培养基置于120℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min，得到无菌的烟叶培养基；实验组在超净工作台中取500μl制好的菌液加入烟草培养基中，对照组加入500μl的无菌去离子水，用封口膜封住，置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养5天，以所述烟叶粉末作为所述菌株的唯一营养源，进行烟叶的液态发酵，测定菌株在烟叶TSNAs降解中的作用。

实验结束，将实验组和对照组的发酵液分别转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的速度离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分烘干。测定发酵完成的烟叶粉末中TSNAs的含量，如表1。

表1接种菌种后28℃液态发酵5天烟叶TSNAs含量

实施例2

实施例2涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于28℃发酵7天。

在实施例1的基础上，实施例2将接种了短小芽孢杆菌05-5402的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表2。

表2接种菌种后28℃液态发酵7天烟叶TSNAs含量

实施例3

实施例3涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于28℃发酵10天。

在实施例1的基础上，实施例3将接种了短小芽孢杆菌05-5402的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养10天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表3。

表3接种菌种后28℃液态发酵10天烟叶TSNAs含量

实施例4

实施例4涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于25℃发酵5天。

采用实施例1的方法，实施例4在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于25℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养5天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与对实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定调制完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表4。

表4接种菌种后25℃液态发酵5天烟叶TSNAs含量

实施例5

实施例5涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于25℃发酵7天。

采用实施例1的方法，实施例5在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于25℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与对实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定调制完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表5。

表5接种菌种后25℃液态发酵7天烟叶TSNAs含量

实施例6

实施例6涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于25℃发酵10天。

采用实施例1的方法，实施例6在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于25℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养10天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与对实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定调制完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表6。

表6接种菌种后25℃液态发酵10天烟叶TSNAs含量

对比例1

对比例1涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于28℃发酵14天。

在实施例1的基础上，将接种了短小芽孢杆菌05-5402的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表7。

表7接种菌种后28℃液态发酵14天烟叶TSNAs含量

对比例2

对比例2涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于28℃发酵21天。

在实施例1的基础上，将接种了短小芽孢杆菌05-5402的烟叶培养基置于28℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表8。

表8接种菌种后28℃液态发酵21天烟叶TSNAs含量

对比例3

对比例3涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于35℃发酵7天。

采用实施例1的方法，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养7天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定调制完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表9。

表9接种菌种后35℃液态发酵7天烟叶TSNAs含量

对比例4

对比例4涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于35℃发酵14天。

采用实施例1的方法，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养14天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表10。

表10接种菌种后35℃液态发酵14天烟叶TSNAs含量

对比例5

对比例5涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为液态发酵方式，控制液态发酵体系于35℃发酵21天。

采用实施例1的方法，在超净工作台中向灭菌后的烟叶培养基中加入500μl制好的菌液。不同在于封口后置于35℃恒温振荡培养箱中，以160rpm/min的转速振荡培养21天，作为实验组。对照组加入500μl的无菌去离子水，其它实验条件与实施例1相同。

实验结束，将发酵液转至无菌的50ml离心管中，在室温下以4500rpm/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀，再用无菌去离子水洗涤沉淀一次。将获得的烟叶碎末沉淀和菌体混合物置于55℃烘箱，彻底蒸发水分，测定发酵完成烟叶特有亚硝胺(TSNAs)的含量如表11。

表11接种菌种后35℃液态发酵21天烟叶TSNAs含量

对比例6

对比例6涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为固态发酵方式，控制固态发酵体系于28℃发酵7天，含水量50％。

与液态发酵方法中相同，用于固态发酵过程的烤烟是种植于云南省玉溪市研和镇的硃砂烟，成熟后采摘中部烟叶，在试验基地烘烤后收集烟叶，研磨成粉末后用于发酵。

固态发酵操作如下：

称取5g烟叶至发酵瓶中，加入适量的水调节整个发酵体系的含水量为50％，用封口膜封口后于115℃高压蒸汽灭菌锅灭菌20min，灭菌完成后待烟叶冷却至室温，加入2mlOD

表12接种菌种后50％含水量条件下28℃固态发酵7天烟叶TSNAs含量

对比例7

对比例7涉及一种利用短小芽孢杆菌05-5402降低烟叶TSNAs的发酵方法，为固态发酵方式，控制固态发酵体系于28℃发酵7天，含水量70％。

用于发酵过程的烤烟是种植于云南省玉溪市研和镇的硃砂烟，成熟后采摘中部烟叶，在试验基地烘烤后收集烟叶，研磨成粉末后用于发酵，固态发酵操作如下：

称取5g烟叶至发酵瓶中，加入适量的水调节整个发酵体系的含水量为70％，用封口膜封口后于115℃高压蒸汽灭菌锅灭菌20min，灭菌完成后待烟叶冷却至室温，加入2mlOD

表13接种菌种后70％含水量条件下28℃固态发酵7天烟叶TSNAs含量

实验结果：

从表1-表11的结果可知，利用短小芽孢杆菌05-5402在烟叶液态发酵过程中降低烟叶TSNAs的方法中，通过控制发酵条件为：发酵温度：25-28℃，发酵时间：5-10天，烟叶TSNAs含量降低幅度可达13.99％～31.99％。最佳的发酵条件是28℃发酵7天，TSNAs降解率为31.99％。反之，液态发酵条件控制不恰当则无明显降解效果，其中35℃下发酵7-21天的实验组烟叶TSNAs含量下降幅度低，甚至上升，28℃下发酵21天的实验组烟叶TSNAs含量下降幅度较低。从表2、表12和表13的结果可知，在同样的发酵温度和时间下，50％含水量条件下，05-5402固态发酵(对比例6)对TSNAs几乎没有降解效果；70％含水量条件下，05-5402固态发酵(对比例7)对TSNAs降解率为17％，而液态发酵模式中(实施例2)，TSNAs含量下降31.99％，表明同等条件下，液态发酵的降解效果更显著。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。