具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液及其制备方法

技术领域

本发明涉及电子雾化液的制备技术领域，更具体的说，本发明涉及一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液及其制备方法。

背景技术

抑郁症是一种突然发生的精神疾病，会影响状态情绪，其特征是持续感到悲伤和对曾经是愉快的的事情失去兴趣。根据世界卫生组织的数据，抑郁症影响着全球多达2.6亿人，预计到2030年将成为导致残疾的主要原因。长期压力是认知障碍和情绪障碍的因素之一，如抑郁和焦虑。

目前对抑郁症的治疗主要是用抗抑郁药物，治疗目标是症状缓解和功能恢复，然而，实验和临床证据表明，抗抑郁药物的疗效并不理想。事实上，约30-40％的患者在一个疗程后完全缓解，而30％的患者仍有残留症状，复发风险增加，在临床显著缓解后影响社会功能。目前抑郁症的治疗主要依靠化学合成药物。但这种方法普遍存在抗抑郁药谱窄、起效慢、副作用大等缺点。单胺氧化酶活性和神经递质水平之间的关系被证实与神经和精神疾病相关，单胺氧化酶已成为神经药理学中极具价值的治疗靶点。单胺氧化酶-A抑制剂目前被用来治疗焦虑症和抑郁症，自20世纪50年代第一个单胺氧化酶抑制剂依普罗尼嗪被用作抗抑郁药治疗，因为三种主要单胺类物质(如去甲肾上腺素、多巴胺和血清素)的水平在大脑中受到调节。单胺类递质失衡假说是被广泛认可的抑郁症发病机制，在抑郁症患者中，脑内去甲肾上腺素和5-羟色胺水平的降低以及诱导表达MAO-A是抑郁症最重要的致病因素。此外，抑郁症与单胺氧化酶-A功能多态性基因和5-羟色胺基因信号通路有关。在抑郁症情况下，脑内单胺氧化酶A的水平增加。因此传统抗抑郁药物抑制单胺氧化酶A使5-HT信号通路活性降低而发挥治疗效应。单胺氧化酶-A的抑制剂已被发现有抗抑郁的特性，在抑郁症治疗中的应用已有50多年的历史，由于单胺氧化酶-A主要代谢5-HT和NE，因此这种酶的抑制剂主要用于治疗抑郁症。研究表明，单胺氧化酶抑制剂抑制神经递质的脱氨或代谢。单胺氧化酶抑制剂也由其选择性决定：有些抑制剂选择性地抑制MAO-A(如吗氯贝胺)，有些选择性地抑制MAO-B(如帕吉林和塞来吉林)，有些是非选择性的(如苯乙嗪和曲尼环丙烷)，可同时抑制MAO-A和MAO-B。早期的单胺氧化酶抑制剂不可逆地抑制单胺氧化酶，当它们与单胺氧化酶相互作用时，会使酶永久性地失活。之后研发的单胺氧化酶抑制剂，如吗氯贝胺是可逆的，意味着当抑制剂与酶分离时，MAO酶活性可被再次恢复。尽管MAO-A抑制剂是治疗心理疾病的一种治疗机制，但当过量服用MAO-A抑制剂或与其他药物、膳食补充剂或植物药联合使用时，可能会出现一些不良反应，如肝毒性、镇静、认知障碍、运动失调、攻击性、性功能障碍、药物耐受性和依赖性等。同时，肝脏中过度的MAO-A抑制会阻碍饮食中酪胺的代谢，最终导致高血压危机。因此，有必要去寻找替代传统MAO-A抑制剂的天然无毒抑制剂。

电子烟，主要用于取代烟草型的香烟而使用，电子烟可将存储的电子烟雾化液或称电子烟烟油进行加热蒸发成气溶胶供用户吸食。目前市面上的含尼古丁或不含尼古丁的电子烟，因其雾化液不含有抗抑郁的有效成分，雾化后的电子烟烟雾中也不产生含有抗抑郁的有效成分，因此现有的电子烟没有抗抑郁作用、或者说对抑郁症状没有改善作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液及其制备方法，以可可提取物和茶多酚为主要添加剂进行雾化液的配制，使该电子烟雾化液能够抑制单胺氧化酶的活性，具有抗抑郁的作用，适用于患有轻度抑郁、焦虑症的人群，减轻他们的症状。

本发明的技术解决方案是，一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液，其配制组分按重量份包括：可可提取物2～10份，茶多酚0.02～0.2份，椒样薄荷油0.1～2份，迷迭香油0.1～1份，乙醇5～15份，微分子水10～30份，甘油15～30份，丙二醇30～50份。

优选地，还包括烟碱0.1～0.5份。

优选地，所述可可提取物4～8份，所述茶多酚0.02～0.06份，所述椒样薄荷油0.1～0.5份，所述迷迭香油0.4～0.8份，所述乙醇8～12份，所述微分子水15～25份，所述甘油20～30份，所述丙二醇35～40份。

优选地，所述可可提取物5份，所述茶多酚0.04份，所述椒样薄荷油0.1份，所述迷迭香油0.6份，所述乙醇10份，所述微分子水20份，所述甘油25.6份，所述丙二醇37.76份。

本发明的另一技术解决方案是，具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液的制备方法，包括以下步骤：

S1.按所述配制组分的重量份配比称取各组分；

S2.将所述各组分依次添加到离心管中，以200rad/min的搅拌速率充分搅拌及混合均匀；

S3.在温度为40℃的条件下浸泡480分钟；

S4.加热升温至60℃，保持20分钟后降至室温；

S5.过滤杂质后即得。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明以可可提取物和茶多酚为添加剂制备的以抗抑郁为主要作用的电子烟雾化液，解决了以目前市面上的电子烟雾化液没有抗抑郁作用，对抑郁症状没有改善作用的缺陷，具有对抗抑郁、在一定程度上解除焦虑、紧张、烦躁等症状的作用，还可增加记忆、改善思维。

附图说明

图1是本发明制备方法的流程图；

图2是实验各组药物对MAO活性的检测结果；

图3是实验斑马鱼仔鱼活动轨迹结果；

图4是实验各组药物对斑马鱼行为学的检测结果。

具体实施方式

可可提取物(富含类黄酮)，包括黑巧克力，对健康有益，已观察到可可提取物可以减少焦虑和抑郁症状。可可提取物(-)-表儿茶素(Epi)，一种最丰富的黄酮类化合物之一，可以提高认知功能，参与促进空间记忆和学习过程，缓解焦虑。另一方面，该提取物被认为是一种潜在的运动模拟分子，而运动已被用作抑郁症的辅助治疗。有人使用慢性轻度应激小鼠模型分析了可可提取物(-)-表儿茶素(Epi)治疗对抑郁样行为的影响，他们通过进行蔗糖偏好测试，进行了行为分析，以表明抑郁行为和野外行为作为焦虑测试。研究者还使用HPLC评估血清中潜在的黄嘌呤代谢物水平。采用免疫印迹法测定骨骼肌中PGC-1α-PPARδ/α-KATs信号通路中的蛋白水平。研究的结果证明，可可提取物(Epi)对应激诱导的抑郁有很好的抵抗作用，这种作用是通过调节肾嘌呤氨酸转氨酶(KATs)的反应来实现的。研究者认为，黑巧克力的消费与情绪状态有关，特别是与快乐和积极的幸福。这种效应被归因于可可衍生产品的高类黄酮含量，特别是可可植物中含有最丰富的黄烷醇，该物质影响了认知功能并发挥了抗抑郁作用。此外，可可对健康还有许多益处，它可能有可能用于预防/治疗过敏、癌症、氧化损伤、炎症、焦虑、高血糖和胰岛素抵抗。

茶多酚(TP)是从茶叶中提取的天然化合物，具有许多有益特性，例如降低患癌症和心脏病的风险，以及作为天然食品工业的抗氧化剂。已发现茶多酚可以穿透血脑屏障，从而改善大脑功能。相关机制涉及单胺能反应和抗氧化防御的变化。关于抗抑郁样作用，茶多酚在强迫游泳试验(FST)和悬尾试验(TST)中表现出抗抑郁样活性。这些机制涉及通过降低血清皮质酮和促肾上腺皮质激素(ACTH)水平来抑制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活动过度。有研究者采用慢性不可预知轻度应激(CUMS)抑郁症动物模型观察茶多酚对抑郁症的作用，研究者证实了茶多酚对CUMS诱导的小鼠抑郁模型具有保护作用。这种保护作用可能是通过同时改变单胺和氧化过程来实现的，这表明在CUMS期间这两个系统之间存在相互联系的可能性。茶多酚给药可有效逆转海马、前额叶皮层和血清中NE和5-HT浓度的变化，提高SOD和CAT活性及GSH水平，降低海马和脑组织MDA水平前额叶皮层，抑制脂质过氧化。一些临床研究报道了重度抑郁症患者5-HT和NE水平的变化，慢性应激会导致CUMS引起的抑郁症小鼠神经递质浓度发生变化，主要表现为5-HT和NE水平显着降低，在此研究中，与正常对照组相比，CUMS小鼠的血清5-HT和NE水平降低。给予茶多酚可以显着逆转这些参数。茶多酚给药剂量为25mg/kg和50mg/kg显著增加海马、前额叶皮层和血清中的5-HT和NE水平。研究还发现，在脑组织中连续5周每天暴露于应激源后，CUMS还显着降低了SOD和CAT的活性。在之前的研究中已经报道了慢性应激导致的SOD和CAT活性的类似下降。此外，CUMS组脑组织中脂质过氧化标志物(MDA)水平的显着升高和GSH水平的降低也与之前的报道一致，茶多酚给药剂量为25mg/kg和50mg/kg从第3周开始连续3周每日灌胃小鼠，可增加SOD和CAT的活性，增加GSH水平，抑制脂质过氧化，减少MDA的产生。这些研究结果证明了茶多酚具有抗抑郁作用【Yi Liu,et.al.Genguang Jia,Antidepressant-like effects of tea polyphenols onmouse model of chronic unpredictable mild stress.Pharmacol BiochemBehav.2013Mar；104:27-32.】。

斑马鱼(Danio rerio)是一种脊椎动物模型，广泛用于生物医学研究，包括神经毒理学研究。斑马鱼表现出与人类相似的整体神经系统和神经递质系统，包括谷氨酸能、胆碱能、5-羟色胺能、多巴胺能、肾上腺素能、GABA和组胺。成熟的斑马鱼中枢神经系统(CNS)发育良好且更为复杂，可用于模拟复杂的脑部疾病，包括焦虑和抑郁。有几种实验测定可以测量成年斑马鱼的行为学习变化，例如旋转逃逸测试、咬伤测试、新型水箱测试、位置偏好测试、T迷宫、加迷宫和Y迷宫测定。大多数用于评估动物模型中学习和记忆的工具都涉及视觉刺激，包括颜色偏好。斑马鱼可以辨别颜色并表现出自发的接近或回避行为。一些研究支持基于颜色的学习和记忆范式或涉及斑马鱼厌恶、焦虑或恐惧的实验。斑马鱼偏爱蓝色和绿色，避免黄色和红色。斑马鱼的视觉系统包括具有对红、绿、蓝和紫外线敏感的视锥细胞的视网膜；此外，斑马鱼是昼夜活动的动物，这使它们成为发展对视觉信号的认知反应研究的理想模型，此外，利血平具有降低血压、减慢心率的作用，最初是一种良好的降压和镇静剂。然而，先前的研究表明，急性利血平应用会导致抑郁症。

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

本发明通过以斑马鱼为模型，建立了采用利血平建立抑郁症的模型，观察了在不含尼古丁的电子烟雾化液中，以可可提取物与茶多酚为主要添加剂的电子烟雾化液的抗抑郁作用，发现了这种电子烟雾化液有非常明显的抗抑郁作用，可以作为一种具有抗抑郁作用的电子烟雾化液。

本发明一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液的方案是，其配制组分按重量份包括：可可提取物2～10份，茶多酚0.02～0.2份，椒样薄荷油0.1～2份，迷迭香油0.1～1份，乙醇5～15份，微分子水10～30份，甘油15～30份，丙二醇30～50份。

本发明一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液的另一方案是，其配制组分按重量份包括：可可提取物4～8份，茶多酚0.02～0.06份，椒样薄荷油0.1～0.5份，迷迭香油0.4～0.8份，乙醇8～12份，微分子水15～25份，甘油20～30份，丙二醇35～40份。

本发明一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液的另一方案是，其配制组分按重量份包括：可可提取物2～10份，茶多酚0.02～0.2份，椒样薄荷油0.1～2份，迷迭香油0.1～1份，乙醇5～15份，微分子水10～30份，甘油15～30份，丙二醇30～50份，烟碱0.1～0.5份。

如图1所示，本发明的具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液的制备方法，包括以下步骤：

S1.按前述配制组分的重量份配比称取各组分；

S2.将所述各组分依次添加到离心管中，以200rad/min的搅拌速率充分搅拌及混合均匀，获得混合物；

S3.将上述混合物在温度为40℃的条件下浸泡480分钟；

S4.将上述混合物加热升温至60℃，保持20分钟后降至室温；

S5.将上述混合物过滤杂质后即得可可茶多酚电子烟雾化液。

本发明具体的实施例如下：

实施例一

一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液，其配制组分按重量份为：可可提取物5份，茶多酚0.04份，椒样薄荷油0.1份，迷迭香油0.6份，乙醇10份，微分子水20份，甘油25.6份，丙二醇37.76份，上述每份重量为100克，其配制方法是将上述原料依次称取后添加到离心管中，充分搅拌混合均匀，搅拌速率控制在200rad/min，在温度为40℃的条件下浸泡480min，并升温至60℃加热20min后降至室温，过滤杂质，即得。

实施例二

一种具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液，其配制组分按重量份为：可可提取物5份，茶多酚0.04份，椒样薄荷油0.1份，迷迭香油0.6份，乙醇10份，微分子水20份，甘油25.6份，丙二醇37.76份，烟碱0.02份，上述每份重量为100克，其配制方法是将上述原料依次称取后添加到离心管中，充分搅拌混合均匀，搅拌速率控制在200rad/min，在温度为40℃的条件下浸泡480min，并升温至60℃加热20min后降至室温，过滤杂质，即得。

本发明具有抗抑郁作用的可可茶多酚电子烟雾化液，其配方通过斑马鱼模型加以验证，主要的实验方法与结果如下：

实验可可茶多酚电子烟雾化液抗抑郁功效评价

一、样品安全浓度测试

1材料方法

1.1实验生物

实验所用斑马鱼亲鱼为引种自国家斑马鱼资源中心的AB系，饲养在28.5℃恒温水浴和光/暗周期为14/10h循环水养殖系统中。本实验选用6hpf的胚胎作为样品安全浓度测试用鱼。

1.2受试物

1.3仪器设备

解剖镜，斑马鱼养殖系统(上海海圣生物实验设备有限公司)，24孔板、各种规格吸头、巴氏吸管等，恒温培养箱。

1.4实验方法

1.4.1斑马鱼胚胎收集：挑选出健壮的性成熟斑马鱼，在28℃恒温环境中，按照雌、雄2:3的比例在前一天晚上放入带孵化器的玻璃缸中，雌、雄用隔板分开，玻璃缸用黑布遮光。第二天，除去黑布，抽出隔板，以灯光照射。斑马鱼受光照的刺激雌鱼产卵，雄鱼排精。待其产卵完成后，去除未受精的胚胎并将受精胚胎上的异物去除，收集胚胎，在6孔细胞培养板、28℃恒温环境下孵化。

1.4.2安全浓度测试试验：预实验确定各药品对仔鱼致死的初步范围，即在能够使仔鱼全存活和全死亡临近的两个浓度范围，保证致死浓度的有效性。按一定比例设置0％、0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％6个浓度梯度。每个浓度设3个重复，每个重复10粒胚胎。使用巴士吸管随机挑选发育正常的受精卵平均放入有样品溶液的24孔板中，试验在28℃的恒温箱内进行，光周期的设定为12h:12h，定时观察并记录发育过程中的毒理学终点。观察记录胚胎的死亡率，每天至少两次在解剖显微镜下观察胚胎发育情况，在观察过程将肉眼看到白色或倒置显微镜下观察为黑色的卵被判断为死亡个体，从培养板中及时挑出。观察时尽可能在室温28℃时进行，动作迅速，完毕后放回恒温箱中。本试验选定的毒理学终点为胚胎发育96h的死亡率。

1.5数据统计

根据实验结果计算半数致死浓度(LC50)，LC50是指在动物急性毒性实验中，使受试动物半数死亡的毒性浓度。采用Spearmam-Karber法(又称平均法它是根据对数剂量与致死百分数呈S形曲线，由S形曲线包括的面积推导出致死百分率为50％相当的剂量)来进行计算。最后根据LC50的结果，计算出LC50/10，LC50/5和LC50/3，即在半数致死浓度下设置3个安全浓度来进行后续功效学实验。

2.实验结果

2.1 96h的LC50和安全浓度确定

LC50和安全浓度的计算结果见下表：

LC50计算过程

根据上表的计算结果，可可提取物茶多酚电子烟油样品96h急性毒性试验LC50为0.69％。

根据可可提取物茶多酚电子烟油样品96h急性毒性试验LC50为0.24％，其的安全浓度LC50/10，LC50/5和LC50/3见下表：

样品急性毒性LC50及安全浓度(％)

注：LC50：指能引起一群受试对象50％个体死亡所需的浓度

结论：可可提取物茶多酚电子烟油在斑马鱼急性毒性实验中，其有效96h的LC50为0.69％；其的安全浓度LC50/10为0.069％，LC50/5为0.138％和LC50/3为0.23％。

本研究的后续功效评价采用LC50的1/10，1/5，1/3作为测试浓度，对可可提取物茶多酚电子烟油进行进一步的功效评价。

二、可可提取物茶多酚电子烟油样品对单胺氧化酶活性影响

1材料方法

1.1实验生物

实验所用斑马鱼亲鱼为引种自国家斑马鱼资源中心的AB系，本章节评价选用5dpf的仔鱼作为实验用鱼。

1.2受试物和主要试剂

(1)Reserpine(4mg/L)：(Sigma|Lot：83580)

工作液配制：用万分之一天平，称量2mg的Reserpine，加入DMSO体积100μl，充分溶解，再加入500ml超纯水，工作液浓度4mg/L，DMSO浓度0.2‰。

(2)Toloxatone(托洛沙酮)(200μM)：(MCE|Lot：HY-14196)

工作液配制：用万分之一天平，称量50mg的Toloxatone，加入DMSO体积965.11μl，浓度250mM，稀释1250倍，工作液浓度200μM，DMSO浓度0.8‰。

(3)单胺氧化酶(MAO)活性检测试剂盒：(Solarbio|Lot：BC0015)；

(4)BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天|Lot：P0012S)

(5)受试物主要内容：

微分子水、可可提取物、乙醇、椒样薄荷油、迷迭香油、茶多酚、甘油、丙二醇。按微分子水20％、可可提取物5％、乙醇10％、椒样薄荷油0.1％、迷迭香油0.6％、茶多酚0.04％、甘油25.6％、丙二醇37.76％制备10g样品。其中微分子水2g、可可提取物0.5g、乙醇1g、椒样薄荷油0.01g、迷迭香油0.006g、茶多酚0.004g、甘油2.56、丙二醇3.776g，总量10g。取1个离心管，称取微分子水、可可提取物，涡旋混合。称取丙二醇，以60℃超声30min。以9200rpm、26℃离心15min，取上清液。另取1个离心管，称取乙醇、椒样薄荷油、迷迭香油、茶多酚，涡旋混合。两离心管混合，之后加入甘油。

配制工作液方法：低浓度组：用移液枪抽吸69μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.069％。

中浓度组：用移液枪抽吸138μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.138％。

高浓度组：用移液枪抽吸230μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.23％。

1.3仪器设备

(1)全波长酶标仪(型号：Multiskan GO|厂家：赛默飞)

(2)超净工作台(型号：SW-CJ-1FD|厂家：苏州安泰空气技术有限公司)

(3)低温离心机(型号：sorvall Legend Micro 21R|厂家：赛默飞)

(4)恒温培养箱(型号：HSW-435(450L)|厂家：嘉兴市中新医疗器械有限公司)

(5)斑马鱼养殖系统(型号：5层双排|厂家：上海海圣生物实验设备有限公司)

(6)超纯水系统(型号：Milli-Q|厂家：默克密理博)

(7)分析天平(万分之一)(型号：ME204E|厂家：梅特勒-托利多)

1.4实验方法

1.4.1药物处理给药设计

在受精后5h到第5天培养水中添加亚甲基蓝进行孵化(亚甲基蓝抑制培养水霉菌生长)，在第5天到第6天期间培养水中添加亚甲基蓝、Reserpine、可可提取物气雾剂等进行共给药功效评价。

1.4.2实验组设置；

实验组设置，根据检测需要MAO检测。每个浓度组两组重复，每组30尾，共60尾仔鱼，实验容器选择6孔板，每孔添加工作液10ml，功效评价实验组设置如下：

空白组

模型组：Reserpine(4mg/L)

阳性药组：Reserpine(4mg/L)+Toloxatone(200μM)

低浓度实验组：Reserpine(4mg/L)+样品浓度0.069％

中浓度实验组：Reserpine(4mg/L)+样品浓度0.138％

高浓度实验组：Reserpine(4mg/L)+样品浓度0.23％

所有实验组仔鱼均正常，没有出现死亡和发育畸形，但给药过程中，实验组仔鱼多浮于水面，轻微晃动会下沉，活动正常。

1.4.3MAO酶标检测

参照《单胺氧化酶(MAO)活性检测试剂盒：(Solarbio|Lot：BC0015)》的方法进行检测。

在测试终点取样，每个实验组60尾仔鱼，按照试剂盒说明书提取蛋白，进行MAO测试前需先进行蛋白定量，参照说明书《BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天|Lot：P0012S)》。通过测定360nm处光吸收下降的速率，计算MAO活性。

1.5数据分析

利用SPSS进行数据处理，比较各实验组间的差异显著性(*0.01＜P≤0.05，**P≤0.01)。各测试组暴露完成后至少90％鱼胚胎存活，否则对应测试组结果无效。

2结果

2.1可可提取物气雾剂对斑马鱼蛋白浓度及单胺氧化酶活性的影响

可可提取物气雾剂对斑马鱼蛋白浓度及单胺氧化酶活性的影响见图2及下表:

可可提取物气雾剂对斑马鱼蛋白浓度的影响

(注：*0.01＜P≤0.05，**P≤0.01))

注：抑酶率1是以空白组的酶活性为标准，假设该组的酶活性为100％，超过这个数字，就是促进酶的活性；抑酶率2是以Reserpine组的酶活性为标准，因为后面各组均加入了Reserpine，我们假设该组的酶活性为100％，后面各组的结果与它相比，表现出低于它的抑酶作用。

MAO催化单胺类底物脱氨生成醛，进一步氧化生成酸，底物在360nm处有特征吸收峰，利用酶标仪测定360nm处光吸收下降的速率，计算MAO活性。模型组可显著升高斑马鱼体内MAO量，阳性药组(Toloxatone2)可显著降低模型组MAO含量。如图2所示，与模型组相比，样品的3个浓度组均能显著降低MAO含量。

研究表明，利血平可显著提升MAO表达量，本研究结果与之一致。本研究选用的阳性药(Toxoxatone)是MAO特异抑制剂，本研究中与模型组相比，阳性药组MAO量显著降低，与预期结果一致。可可提取物气雾剂能够显著降低MAO量，并且随着浓度的减少，该效果也变得更加明显。

三、样品抗抑郁功效行为学影响

1材料方法

1.1实验生物

实验所用斑马鱼亲鱼为引种自国家斑马鱼资源中心的AB系，本章节评价选用5dpf的仔鱼作为实验用鱼。

1.2受试物和主要试剂

(1)Reserpine(4mg/L)：(Sigma|Lot：83580)

工作液配制：用万分之一天平，称量2mg的Reserpine，加入DMSO体积100μl，充分溶解，再加入500ml超纯水，工作液浓度4mg/L，DMSO浓度0.2‰。

(2)Toloxatone(200μM)：(MCE|Lot：HY-14196)

阳性药对照；工作液配制：用万分之一天平，称量50mg的Toloxatone，加入DMSO体积965.11μl，浓度250mM，稀释1250倍，工作浓度200μM，DMSO浓度0.8‰。

(3)受试物主要内容：

微分子水、可可提取物、乙醇、椒样薄荷油、迷迭香油、茶多酚、甘油、丙二醇。按微分子水20％、可可提取物5％、乙醇10％、椒样薄荷油0.1％、迷迭香油0.6％、茶多酚0.04％、甘油25.6％、丙二醇37.76％制备制备10g样品。其中微分子水2g、可可提取物0.5g、乙醇1g、椒样薄荷油0.01g、迷迭香油0.006g、茶多酚0.004g、甘油2.56、丙二醇3.776g，总量10g。取1个离心管，称取微分子水、可可提取物，涡旋混合。称取丙二醇，以60℃超声30min。以9200rpm、26℃离心15min，取上清液。另取1个离心管，称取乙醇、椒样薄荷油、迷迭香油、茶多酚，涡旋混合。两离心管混合，之后加入甘油。

工作液制备方法：低浓度组：用移液枪抽吸69μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.069％。

中浓度组：用移液枪抽吸138μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.138％。

高浓度组：用移液枪抽吸230μl受试物溶于100ml超纯水中备用，工作液浓度为0.23％。

1.3仪器设备

(1)斑马鱼行为学跟踪系统(型号：Zeblab|厂家：Viewpoint)

(2)超净工作台(型号：SW-CJ-1FD|厂家：苏州安泰空气技术有限公司)

(3)低温离心机(型号：sorvall Legend Micro 21R|厂家：赛默飞)

(4)恒温培养箱(型号：HSW-435(450L)|厂家：嘉兴市中新医疗器械有限公司)

(5)斑马鱼养殖系统(型号：5层双排|厂家：上海海圣生物实验设备有限公司)

(6)超纯水系统(型号：Milli-Q|厂家：默克密理博)

(7)分析天平(万分之一)(型号：ME204E|厂家：梅特勒-托利多)

1.4实验方法

在MAO检测的同时，在实验结束时，对给药24h活体仔鱼，进行行为学监测，实验组设置与MAO活性检测的实验组相一致。用移液管将斑马鱼仔鱼转移到96孔板，每个组16孔重复，使用自动视频跟踪系统(Videotrack)记录斑马鱼仔鱼的运动轨迹和距离。轨迹记录参数设置为light 5min+black 5min，阈值为0(所有运动均统计)，单位为mm，light 5min用于稳定仔鱼，分析black 5min的轨迹和运动距离。根据斑马鱼行为学轨迹和运动距离，判断斑马鱼的抑郁程度，以正常对照组为标准，按照游动距离来判断抑郁程度，游动距离长低抑郁，游动距离短高抑郁。试验结果如下((*0.01＜P≤0.05，**P≤0.01))：

2实验结果

2.1.1各组对照组和给药组的斑马鱼的运动轨迹和运动距离结果见图3、图4及下表：

表：斑马鱼仔鱼活动距离结果

注：与正常对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；与模型组比较，#0.01＜P≤0.05，##P≤0.01，###P≤0.001。抗抑郁率1是以正常对照组的活动为标准，假设该组的鱼的活动距离为100％，超过这个数字，就是有抑郁的活性，在“抗抑郁率”的表中，该数据应该是负值；抗抑郁率2是以Reserpine组的酶活性为标准，应为后面各组均加入了Reserpine，我们只能假设该组的酶活性为100％，后面各组的结果与它相比，高于它就是有抗抑郁作用。

根据上表和图3、图4的结果可见，利血平模型组斑马鱼的活动轨迹及活动距离均比对照组低，模型组可显著抑制斑马鱼活跃度(P<0.05)(详见附图)，根据图中斑马鱼活动轨迹数据可以看出，模型组的斑马鱼活动轨迹以及距离明显要少于其他组。阳性药组与模型组相比，可显著提升斑马鱼活跃度(P<0.05)。可可提取物茶多酚电子烟油样品3个浓度中均能显著提升斑马鱼活跃度(P<0.05)。行为学数据与MAO定量数据基本一致。附图2、图3、图4中所述“气雾剂”、“可可气雾剂”，均为“可可茶多酚电子烟雾化液”。

本发明技术方案配制的可可茶多酚电子烟雾化液，具有抑制单胺氧化酶的活性及抗抑郁症的作用，安全性高，可以作为抗抑郁症的电子烟雾化液。

以上所描述的仅为本发明的较佳实施例，上述具体实施例不是对本发明的限制。在本发明的技术思想范畴内，可以出现各种变形及修改，凡本领域的普通技术人员根据以上描述所做的润饰、修改或等同替换，均属于本发明所保护的范围。