一种明胶微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种明胶微球的制备方法，通过该制备方法制得的微球，以及利用该微球作为细胞培养微载体的应用。

背景技术

近年来，随着生物材料在疾病的诊断、治疗以及生物体组织器官的修复等领域表现出广泛的应用前景，其研究也越来越来受到人们的重视。以生物材料合成的微载体作为细胞培养载体、药物递送载体、包埋剂、吸附剂等方面的应用被不断报道。其中，固体微球是一类获得了广泛应用的微载体。在微载体细胞培养技术中，贴壁细胞在悬浮于生物反应器培养液内的固体微球表面上贴壁生长，为细胞提供极高的表面积与体积比，因此成为一种极具吸引力的新型替代技术。

明胶作为哺乳动物体内含量最多的一种蛋白质-胶原的水解产物，良好的保留了胶原的蛋白特性，同时免疫原性大大降低。明胶被FDA认证为一种安全的材料，其在药物、食品等工业中的应用具有长久的历史。作为生物医用材料，明胶具有结构和生物学上的优势：①明胶具有温度可逆性，可通过喷雾干燥或冷冻干燥的方法得到多孔的材料；②明胶分子中含有大量的、不同种类的官能团，可通过化学修饰的方法对其性能进行调控；③明胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，因其含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)生物活性短肽，可以提供大量的细胞识别位点，有利于细胞的黏附和生长。明胶来源广泛、价格便宜，因此以明胶为材料制成的产品应用非常广泛。

以明胶制备作为微载体的微球可以提高微球的生物相容性，改善微载体对细胞的黏附效果。然而，受明胶溶解/溶胀现象的影响，仅以明胶为材料制备的微球结构稳定性差，容易破碎，无法为细胞的黏附、增殖提供稳定的生长环境。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，例如，仅以明胶为材料制备的微球存在结构稳定性差、易破碎的问题。为此，本发明提供了一种明胶微球的制备方法，仅以明胶类物质为原料即制得了结构稳定性好的固体微球，解决了明胶微球易破碎、稳定性差的问题。明胶微球的成分单一，在水中可长时间不溶解，适于细胞的黏附和生长，可有效提高细胞培养效率。明胶微球在胶原酶等作用下可快速降解，有利于实现培养细胞的快速回收。

本发明首先提供了一种明胶微球的制备方法，包括如下步骤：

将明胶类物质溶解于溶剂中，得到明胶溶液；

对所述明胶溶液进行喷雾干燥或喷雾冻干处理，得到明胶微球前体；

将所述明胶微球前体以及催化剂或交联剂加入到不良溶剂或不良溶剂的水溶液中，对所述明胶微球前体进行交联处理，然后经洗涤、过滤处理，所得截留物即为明胶微球。

根据本发明的制备方法，其中，

所述喷雾干燥处理的温度为30-200℃，

所述喷雾冻干处理的温度为-20℃～-196℃。

根据本发明的制备方法，其中，所述制备方法还包括如下步骤：

在保护剂存在下对所述截留物进行二次冻干处理，得到明胶微球；

可选地，所述二次冻干处理的温度为-20℃～-196℃；

可选地，所述二次冻干处理为真空冷冻干燥处理。

根据本发明的制备方法，其中，所述保护剂为赋形剂溶液或水；可选地，所述赋形剂选自乳糖、葡聚糖、明胶、甘露醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、葡萄糖、山梨醇、肌醇、牛血清蛋白、谷氨酸钠、赖氨酸和明胶。

根据本发明的制备方法，其中，所述明胶类物质选自明胶和明胶衍生物；可选地，所述明胶衍生物选自琥珀酰明胶和聚明胶肽中。

根据本发明的制备方法，其中，所述明胶溶液的质量浓度为0.01-0.2g/mL，优选0.08-0.16g/mL；可选的，所述明胶溶液是将明胶类物质加入水中，然后在50℃～80℃的温度下溶解得到。

根据本发明的制备方法，其中，所述明胶类物质在双冻力检测条件下的凝冻强度为150-250g/cm

根据本发明的制备方法，其中，所述明胶类物质来源于猪皮、牛皮、鱼皮、猪骨、牛骨、羊骨和鸡骨中的一种或几种。

根据本发明的制备方法，其中，所述不良溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、甘油和二恶烷中的一种或多种。

根据本发明的制备方法，其中，所述催化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-N,N-二甲基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)二环己基碳二亚胺(DCC)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，和二异丙基碳二亚胺(DIC)；

所述交联剂选自二氯亚砜、戊二醛、氯甲酸乙酯、异丁酯、甲醛、氨基树脂、异氰酸酯、氮丙啶、酪氨酸，和京尼平。

本发明还提供了一种明胶微球，其中，所述明胶微球通过根据本发明所述的方法制备得到。

根据本发明的明胶微球，其中，所述明胶微球的粒径为50-500μm。

根据本发明的明胶微球作为生物医用材料的应用。

根据本发明的应用，其中，所述生物医用材料为细胞培养的微载体；

可选地，所述细胞选自293细胞、HEK293细胞、HEK-293T细胞、293T细胞、293TN细胞、293FT细胞、AAV-293细胞、HUVEC细胞、ECV-304细胞、L929细胞、WB-F344细胞、L-02细胞、THP-1细胞、D407细胞、Vero细胞、CHO细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或IPS细胞。

本发明提供的制备方法，将喷雾干燥或喷雾冷冻工艺与化学交联工艺相结合，制备了仅以明胶类物质为原料的明胶微球。且明胶微球的结构稳定性好、在水中长时间不溶解，对细胞的黏附性好，以明胶微球作为培养细胞的微载体，能够平面静态培养细胞，也可以通过转瓶、生物反应器等三维动态培养细胞。

进一步的，本发明的制备方法采用喷雾冷冻干燥方法适用于工业化生产，有利于细胞的大规模培养，能够实现大规模的细胞培养。同时，明胶微球成分单一、制备过程中所用交联剂或催化剂可被去除，因此负载细胞的明胶微球的生物相容性好，负载细胞的明胶微球在膝关节病症、肌腱损伤等领域有极大的应用前景；且明胶微球在果胶酶的存在下可快速降解，能够提高细胞回收的效率。

进一步的，本发明的制备方法步骤简单易行，原料成本低，适合大规模的工业化生产。

附图说明

图1示出了实施例1中明胶微球的扫描电镜照片，图1-A为400μm标尺下的扫描电镜照片，图1-B为1mm下的扫描电镜照片。

图2示出了实施例4中明胶微球的明场显微镜照片，图2-A为200μm标尺下的明场显微镜照片，图2-B为100μm标尺下的明场显微镜照片。

图3示出了实施例16中明胶微球三维动态培养的明场显微镜照片。

图4示出了实施例16中明胶微球三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。

图5示出了实施例17中明胶微球三维动态培养的明场显微镜照片。

图6示出了实施例17中明胶微球三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。

图7示出了实施例20中明胶微球胶原酶加胰酶裂解0、3.5、5、6.5、8分钟后的4倍显微镜照片。

具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等化妆品领域能够使用的任何可行的水。

本发明的第一方面提供了一种明胶微球的制备方法，包括如下步骤：

将明胶类物质溶解于溶剂中，得到明胶溶液；

对所述明胶溶液进行喷雾干燥或喷雾冻干处理，得到明胶微球前体；

将所述明胶微球前体与催化剂或交联剂，加入到不良溶剂或不良溶剂的水溶液中，对所述明胶微球前体进行交联处理，然后经洗涤、过滤处理，所得截留物即为明胶微球。

<明胶溶液>

在本发明中，将明胶类物质溶解于溶剂中，得到明胶溶液。具体的，明胶溶液的质量浓度为0.01-0.2g/mL，优选0.08-0.16g/mL。例如，明胶溶液的质量浓度为0.02g/mL、0.04g/mL、0.06g/mL、0.08g/mL、0.1g/mL、0.12g/mL、0.14g/mL、0.16g/mL、0.18g/mL等。当明胶溶液的浓度为0.01-0.2g/mL时，经交联、固化后，适合得到粒径为50-500μm的明胶微球。

在一些具体的实施方案中，明胶类物质选自明胶和明胶衍生物。其中，明胶衍生物选自琥珀酰明胶和聚明胶肽。上述的明胶、明胶衍生物均是生物医用材料，具有良好的生物相容性及细胞黏附性。

在一些具体的实施方案中，为获得均一、稳定的明胶溶液，将所述明胶溶液是将明胶类物质加入水中，然后在50～80℃的温度下溶解得到明胶溶液。

在一些具体的实施方案中，为进一步提高制备明胶微球的机械强度，选择在双冻力检测条件下的凝冻强度为150-250g/cm

进一步的，明胶类物质来源于猪皮、牛皮、鱼皮、猪骨、牛骨、羊骨和鸡骨中的一种或几种。明胶类物质作为一种天然生物材料，其来源丰富、价格低廉、生物相容性好，适合作为固体微球的制备材料。

<明胶微球前体>

在本发明中，对所述明胶溶液进行喷雾干燥或喷雾冻干处理，得到明胶微球前体。喷雾干燥或喷雾冻干的方式适合大规模制备微球，且得到的微球尺寸较为均一。

在一些具体的实施方案中，对明胶溶液进行喷雾干燥处理。具体的，是将明胶溶液通过喷雾设备分散为液滴，然后在30-200℃的温度范围内进行干燥，得到明胶微球前体。喷雾干燥可瞬间完成，处理效率高，可实现明胶微球的连续化生产。

在一些具体的实施方案中，对明胶溶液进行喷雾冻干处理，具体的，是将明胶溶液通过喷雾设备分散为液滴，然后将液滴冷冻为冰球，所述冰球经一次冻干处理，得到所述明胶微球前体。进一步的，一次冻干处理为冷冻干燥处理。喷雾冻干处理明胶溶液在低温和真空条件下进行，适于保持明胶微球的理化性能，实现对细胞的高黏附效率。进一步的，喷雾冻干处理的温度为-20℃～-196℃。

对于喷雾设备，本发明不作特别限定，可以是将明胶溶液均匀分散为液滴的任何设备，例如单流体喷雾设备、二流体喷雾设备、多流体喷雾设备、超声雾化装置或超临界流体喷雾设备等。

<明胶微球>

在本发明中，将所述明胶微球前体与催化剂或交联剂加入到不良溶剂或不良溶剂的水溶液中，对所述明胶微球前体进行交联处理，然后经洗涤、过滤处理，所得截留物即为明胶微球。由于明胶本身具有较强的可溶性，对于未经交联处理的明胶微球，无法在细胞培养的过程中保持其固体微球形态。通过进一步的交联处理，可以提高明胶微球的机械强度，使明胶微球长时间不溶解，并且不易发生破碎，从而长期、有效支持细胞的生长、增殖。明胶微球在不良溶剂中进行交联，能够有效避免明胶微球的溶解，提高细胞培养效率。交联处理后通过洗涤、过滤处理，可以去除残留的催化剂或交联剂，降低明胶微球的毒性。

在一些优选的实施方案中，将所述明胶微球前体加入到不良溶剂或不良溶剂的水溶液中，然后向其中加入催化剂或交联剂。

在一些具体的实施方案中，所述明胶微球前体进行交联处理，然后经洗涤、过滤处理后，在保护剂存在下对截留物进行二次冻干处理，得到明胶微球，二次冻干处理可使制备的明胶微球能够长期保存、运输。进一步的，二次冻干处理为真空冷冻干燥处理，二次冻干处理的温度为-20℃～-196℃。

对于不良溶剂，可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、甘油和二恶烷中的一种或多种，或者是其他对于明胶的溶解度低的溶剂。

对于保护剂，可以是赋形剂溶液或水。其中，所述赋形剂包括乳糖、葡聚糖、明胶、甘露醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、葡萄糖、山梨醇、肌醇、牛血清蛋白、谷氨酸钠、赖氨酸和明胶中的一种或多种。所述赋形剂溶液可以是赋形剂溶于水得到，本发明对赋形剂溶液的溶剂不作特别限定。

对于催化剂，可以是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-N,N-二甲基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)二环己基碳二亚胺(DCC)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，和二异丙基碳二亚胺(DIC)中的一种或多种。此外，催化剂还可以本领域常用其他能够催化明胶微球自交联的物质。

对于交联剂，二氯亚砜、戊二醛、氯甲酸乙酯、异丁酯、甲醛、氨基树脂、异氰酸酯、氮丙啶、酪氨酸，和京尼平中的一种或多种，此外，交联剂还可以是本领域常用其他能够促进明胶微球发生交联的物质。

本发明提供的交联微球的制备方法，原料成本低、制备步骤简单易行，能够得到成分单一、结构稳定性好、细胞黏附性好的明胶微球。

本发明的第二方面提供了一种明胶微球，由第一方面所提供的明胶微球的制备方法制得。

明胶微球仅以明胶为原料，其成分单一，不含有残留的毒性物质，具有高的生物相容性，可以粘附细胞作为细胞培养的载体，提高细胞活性和生长效率。明胶微球兼具良好的结构稳定性和可生物降解性，能够用于细胞的三维动态培养，为细胞提供更接近体内的微环境。此外，明胶微球还可作为吸附剂或药物递送载体，在生物医用领域具有广泛的应用前景。

作为优选，交联微球的粒径为50～500μm；交联微球具有联通外表孔隙，所述孔隙的孔径为1-30μm。交联微球所具有的孔隙可以增加细胞粘附的表面积，增加细胞培养的数量。

本发明的第三方面提供了第二方面所述的明胶微球作为生物医用材料的应用。具体的，生物医用材料为细胞培养的微载体。

明胶微球使用的材料全部属于生物医用辅料，因此负载细胞的交联微球生物相容性良好，可以生物降解，负载细胞的明胶微球在膝关节病症、肌腱损伤等领域有极大的应用前景。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

(1)将10g明胶(250冻力，牛皮来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷出的液滴在液氮中冷冻至-196℃，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC、NHS催化明胶自交联，水洗，过滤。将截留物加入到水中，并在-196℃冷冻，然后真空冷冻干燥，得到明胶微球。

图1A和图1B分别示出了标尺为400μm和1mm下的明胶微球的扫描电镜照片，明胶微球的粒径均一、结构完整性好。

(1)将3g明胶(240冻力，牛骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.03g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入到冷冻至-80℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到无水甲醇中洗涤，加入HOBt催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。将截留物加入到乳糖水溶液中，并在-196℃冷冻，然后真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将20g明胶(210冻力，牛皮来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.2g/mL的明胶溶液。(2)将明胶溶液置于超声雾化设备的雾化器中，喷入到冷冻至-50℃的喷冷塔中，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到丙酮中，加入交联剂氨基树脂交联，水洗，过滤。将截留物加入到葡萄糖水溶液中，并在-30℃冷冻，然后真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将15g明胶(250冻力，牛骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.15g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体雾化设备的雾化器中，喷入到冷冻至-80℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC、NHS催化明胶自交联，水洗，过滤。将截留物加入到水中，并在-196℃冷冻，然后真空冷冻干燥，得到明胶微球。

图2A和图2B分别示出了标尺为200μm和100μm下的明胶微球的明场显微镜照片，明胶微球的粒径均一、结构完整性好。

(1)将10g明胶(230冻力，鱼皮来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入到冷冻至-40℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入二氯亚砜交联，水洗，过滤。将截留物加入到葡聚糖水溶液中-40℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将10g明胶(250冻力，猪皮来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于单流体喷雾设备的雾化器中，并喷入到液氮(-196℃)中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC和NHS催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。将截留物加入到水中-80℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将10g明胶(220冻力，猪骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入到冷冻至-30℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到丙酮中，加入京尼平交联，水洗，过滤，得到明胶微球。

(1)将15g明胶(240冻力，牛骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.15g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于多流体喷雾设备的雾化器中，喷入冷冻至-60℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC和NHS催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。得到明胶微球。

(1)将10g明胶(250冻力，牛皮来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于多流体喷雾设备的雾化器中，喷入冷冻至-80℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到80％的乙醇水溶液中，加入DMTMM催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。将截留物加入到甘露醇与乳糖水溶液中-70℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将10g明胶(220冻力，猪骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入冷冻至-40℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC活化，15min后过滤，加入NHS，水洗除掉催化剂NHS，过滤。将截留物加入到赖氨酸水溶液中-20℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将12g明胶(250冻力，牛骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.12g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入冷冻至-60℃的喷冷塔中，收集冰球，真空冷冻干燥，得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到丙酮中，加入DCC、DMAP催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。将截留物加入到血清白蛋白溶液中-50℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

(1)将10g明胶(220冻力，猪骨来源)加入到100mL水中加热溶解，得到0.1g/mL的明胶溶液。

(2)将明胶溶液置于二流体喷雾设备的雾化器中，喷入温度为150℃的喷雾干燥塔中，在收集器中得到明胶微球前体。

(3)将明胶微球前体加入到乙醇中，加入EDC和NHS催化明胶自交联，水洗除掉催化剂，过滤。将截留物加入到乙醇溶液中-60℃真空冷冻干燥，得到明胶微球。

[利用明胶微球为微载体的二维静态细胞培养]

将实施例1-12中制得的明胶微球进行高压灭菌，然后用PBS漂洗。将灭菌后的交联球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种293T细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用荧光素双醋酸酯(FDA)染色，观察细胞在明胶微球上的黏附和增殖情况。

将实施例1-12中制得的明胶微球进行高压灭菌，然后用PBS漂洗。将灭菌后的交联球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种骨髓间充质干细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用荧光素双醋酸酯染色(FDA)染色，观察细胞在明胶微球上的黏附和增殖情况。

将实施例1-12中制得的明胶微球进行高压灭菌，然后用PBS漂洗。将灭菌后的交联球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种脂肪干细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用FDA染色，观察细胞在明胶微球上的黏附和增殖情况。

[利用明胶微球为微载体的三维动态细胞培养]

将实施例1中的明胶微球用PBS漂洗三遍，置于转瓶中，加入细胞培养基，放入二氧化碳培养箱中，搅拌使微球能够均匀地悬浮于培养基中。12h后，接种脂肪干细胞，继续培养，于第1、3、5天分别取样，用FDA染色，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。培养到第9天时，加入胶原酶I和胰酶使明胶微球完全裂解，收取细胞。

图3显示了明胶微球三维动态培养细胞的明场显微镜照片，图4显示了明胶微球三维动态培养的的活细胞染色的荧光照片。由图3和图4可知，细胞在明胶微球上黏附后的增殖结果明显，说明细胞黏附明胶微球后可稳定的生长、增殖。

将实施例4中的明胶微球用PBS漂洗三遍，置于转瓶中，加入细胞培养基，放入二氧化碳培养箱中，于37℃条件下过夜预培养，搅拌使微球能够均匀地悬浮于培养基中。12h后，接种脂肪干细胞，继续培养，于第1、3、5天分别取样，用FDA染色，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。培养到第9天时，加入胶原酶I和胰酶使明胶微球完全裂解，收取细胞。

图5显示了明胶微球三维动态培养细胞的明场显微镜照片，图6显示了明胶微球三维动态培养的的活细胞染色的荧光照片。由图5和图6可知，细胞在明胶微球上黏附后的增殖结果明显，说明明胶微球用于作为细胞培养的微载体其结构稳定性高、细胞黏附性好，明胶微球在培养溶液中不会发生溶解、破碎，细胞黏附明胶微球后可稳定的生长、增殖。

将实施例1-12中的明胶微球用PBS漂洗三遍，置于转瓶中，加入细胞培养基，放入二氧化碳培养箱中，于37℃条件下过夜预培养，搅拌使微球能够均匀地悬浮于培养基中。12h后，接种骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞，继续培养，于第1、3、5天分别取样，用FDA染色，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。培养到第9天时，加入胶原酶I和胰酶使明胶微球完全裂解，收取细胞。

使用移液器将实施例13-18中用于培养细胞的微球从孔板和转瓶中吸出来，转移至离心管中，静置，待微球全部沉降到底部，去掉上清培养基，然后用PBS悬浮，洗涤。从冰箱中取出FDA，复温摇匀，FDA尽量避光，从转瓶中取一部分微球至孔板中，用PBS漂洗后加入FDA染色液，避光染色，弃染色液，加入PBS漂洗后用倒置荧光显微镜观察拍照。

将实施例16-18中的转瓶从培养箱中取出，用移液枪吸取混合均匀的微球悬液至离心管中，加入PBS漂洗。离心使微球沉降，弃去上清液，加入胶原酶I和胰酶，混匀后置于培养箱中，消化至无肉眼可见的微球。加入台盼蓝染液染色，吹打均匀后，取裂解液于血球计数板计数。计数完成后，得到微球悬液的细胞数，再乘以对应的培养体积，即可得到转瓶中微球上粘附的细胞总数。

图7显示加入胶原酶I和胰酶裂解0、3.5、5、6.5、8分钟后的显微镜照片，由图7可知，明胶微球在可短时间内裂解，实现细胞的快速回收。

将实施例16-19中的转瓶从培养箱中取出，用移液枪吸取混合均匀的微球悬液至离心管中，吸取部分微球悬液用于染色。剩余悬液加入CCK-8试剂，并以同样体积的空白微球做对照，加入等量CCK-8试剂。孔板中微球溶液弃去上清，加入PBS漂洗，接着加入FDA工作液避光染色，PBS漂洗后复染碘化丙啶(PI)，避光染色。染色结束后，弃去染色液，PBS漂洗后显微镜观察拍照。从CCK-8孵育完成的离心管中取出部分置于孔板中，设三组复孔，使用酶标仪读取450nm OD值，并计算对应标曲及细胞数。计数完成后，得到微球悬液的细胞数，再乘以对应的培养体积，即可得到转瓶中微球上粘附的细胞总数。

收集实施例13-18中的负载细胞的明胶微球，用0.9％的生理盐水清洗三遍，取0.3mL微球与0.1mL 5％的透明质酸钠及人血白蛋白溶液共混，使用注射器将混悬液注射进入有关节炎症的关节腔，并于注射后2周、4周、6周、8周、12周、16周使用MicroCT观察软骨修复情况。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。