具有抗菌促修复功能的手性水凝胶敷料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种手性水凝胶敷料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有抗菌促修复功能的手性水凝胶敷料及其制备方法和应用，属于生物材料领域。

背景技术

功能性创面敷料具有良好的吸水性，可防止创面干燥、吸收伤口渗出液，又能将渗液部分保留于敷料中，可以有效提高治疗效果，缩短创面愈合时间，是现代医疗迫切需要的新型生物医学材料。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，诱导细胞增殖和组织修复以及抗菌作用,因而被广泛用于创面治疗。然而，壳聚糖机械强度低，抗菌效果不稳定，促创面愈合时间长等缺陷限制了它的临床应用。

专利文献CN108452370A中记载了一种复合型超分子水凝胶以壳聚糖为凝胶因子，采用“冷冻-解冻法”，在PBS缓冲溶液中与中药单体虫草素形成了乳白色复合型超分子水凝胶。该水凝胶成分均为生物相容性良好的天然产物，壳聚糖和虫草素的协同作用增强了本发明的抗菌性能。但其制备的水凝胶含有虫草素，对纯度有一定要求，且价格较为昂贵，此外该凝胶的机械强度较弱，使用起来不太方便，影响敷料效果的发挥。

药用植物黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血、解毒、抗菌和抗病毒等活性，研究表明黄芩黄酮是其中的主要药用成分。然而其不良的水溶性、空气中易被氧化及低的生物利用度，严重影响其疗效和临床应用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种具有抗菌促修复功能的手性水凝胶敷料及其制备方法和应用，具体可应用于组织工程中的皮肤敷料。本发明的手性水凝胶是一种具有抗炎抗菌功能的三组分混合凝胶，既能增强水凝胶的机械强度和抗菌性能，又能大幅度提升黄芩黄酮的稳定性、保存性能和生物利用度，还具有良好的生物相容性和降解性；该产品用于化脓部位可快速清除脓液，能有效抑制细菌对皮肤的侵蚀并进一步达到修复作用，同时保持长效抑菌修复效果。混合凝胶制备方法操作方便，具有实际应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种具有抗菌促修复功能的手性水凝胶敷料，包括天然产物功能化的壳聚糖、聚乙烯醇和手性超分子凝胶因子；所述天然产物功能化的壳聚糖通过含有黄芩黄酮的乙醇溶液与壳聚糖相互作用得到。

优选地，所述天然产物功能化的壳聚糖、聚乙烯醇和手性超分子的体积比例为5-10:5:0.1-0.3；更优选该比例为5:5:0.1。

优选地，所述聚乙烯醇(PVA)的浓度为10％(w/v)；所述壳聚糖的浓度为13.33mg/mL,粘度为400mpa·s。

优选地，所述天然产物功能化的壳聚糖的制备方法具体包括：

称取黄芩根，碾碎后加入有机溶剂，超声处理，过滤后收集滤液，然后减压浓缩，所得浓缩液加入壳聚糖的醋酸溶液中，搅拌反应，即得。

优选地，所述黄芩根和有机溶剂的混合固液比为10g：40mL；所述有机溶剂为乙醇；所得浓缩液中的黄芩提取物中含有较高浓度的黄芩黄酮；

所述壳聚糖的醋酸溶液中，壳聚糖的质量体积浓度为2％(w/v)，采用的溶剂为体积浓度2％的醋酸水溶液(v/v)；

所述搅拌反应的温度为85℃、12-16h。

优选地，所述手性超分子凝胶因子为1,4-苯甲酰胺二苯丙酰胺一缩二乙醇，为如下式所示的LB3或DB3的结构中的至少一种：

优选地，所述1,4-苯甲酰胺二苯丙酰胺一缩二乙醇的制备方法包括以下步骤：

S1、将1-羟基苯并三唑(HOBT)充分溶解至Boc-苯丙氨酸(L型或D型)的二氯甲烷溶液，再加入二甘醇胺，完全溶解后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，搅拌反应，得粗产物Boc-苯丙酰胺一缩二乙醇；

S2、将步骤S1的粗产物依次通过饱和的柠檬酸溶液、碳酸氢钠溶液和饱和食盐水萃取，有机相干燥除水后减压浓缩，随后重结晶，得产物Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺；

S3、将三氟乙酸加入Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺的二氯甲烷溶液中反应，再加入甲醇终止反应后，减压干燥得氨基苯丙酰胺一缩二乙醇；

S4、在氨基苯丙酰胺一缩二乙醇的二氯甲烷溶液中加入三乙胺，随后加入1,4-苯二甲酰氯，搅拌反应，减压抽滤，洗涤，即得1,4-苯甲酰胺二苯丙酰胺一缩二乙醇。

优选地，步骤S1中，所述Boc-苯丙氨酸为Boc-L-苯丙氨酸或Boc-D-苯丙氨酸，

由此对应合成的终产物为LB3或DB3；

所述1-羟基苯并三唑、Boc-苯丙氨酸、二甘醇胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1:1.1:2；

所述将1-羟基苯并三唑充分溶解至Boc-苯丙氨酸的二氯甲烷溶液后需要冷却至0℃然后再进行后续的操作；

所述搅拌反应的时间为12-16h，搅拌速度为30r/min。

优选地，步骤S2中，所述饱和柠檬酸溶液、碳酸氢钠溶液和食盐水的体积与反应液体积相同，且各萃取三遍；

所述重结晶采用的良性溶剂为乙酸乙酯、不良性溶剂为石油醚；结晶析出后，需冷冻过夜，静置析晶，然后减压抽滤烘干。

优选地，步骤S3中，所述Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺、二氯甲烷、三氟乙酸和甲醇的比例为1:1.85:1.11:18.5(n:v:v:v)；所述反应温度为0℃，反应时间为90min；

步骤S4中，所述氨基苯丙酰胺一缩二乙醇与1,4-苯二甲酰氯的摩尔比为2.08:1；

所述搅拌反应具体为：先在0℃下反应1h，然后升至室温反应12-16h；

所述洗涤的步骤依次采用二氯甲烷、乙醇和水进行洗涤。

本发明还提供了一种具有抗菌促修复功能的手性水凝胶辅料的制备方法，包括以下步骤：

将天然产物功能化的壳聚糖以一定比例与聚乙烯醇共组装后，再与一定浓度的手性超分子凝胶因子共组装，所得产物经循环冷冻-复溶后获得具有抗菌促修复功能的手性水凝胶辅料；所得辅料呈果冻状；

所述聚乙烯醇、天然产物功能化的壳聚糖、手性超分子凝胶因子的体积比为5-10:5:0.1-0.3；

所述手性超分子凝胶因子的浓度为50mg/mL；

所述循环冷冻-复溶所采用的循环次数为5次，该处理后不需要进行灭菌处理。

本发明还提供了一种具有抗菌促修复功能的手性水凝胶辅料在制备组织工程皮肤敷料中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的抗菌促修复功能的手性水凝胶敷料是一种具有一定机械强度的三组分手性水凝胶，手性因素在伤口愈合中起到相当大的促进作用；三组分手性水凝胶具有抗炎、抗氧化和抗菌功能，应用于皮肤敷料，可显著提高其抗菌能力和促进皮肤修复能力，其中LB3所在体系可使感染伤口四天愈合(图2C)，不含有B3的实验组需要7天以上(图1)。

2、本发明的手性水凝胶制备方法操作方便，材料来源广泛且价格低廉，易于大批量生产。

3、本发明还为解决壳聚糖抗菌能力差、机械强度较弱的问题提供了一种可行的解决思路，通过黄芩提取物与壳聚糖反应形成天然产物功能化的壳聚糖，可提高壳聚糖促进伤口愈合的速度，如图1所示，可以看到在7天时，PVA+CSF(天然产物功能化的壳聚糖和PVA共同作用组)的伤口愈合程度比PVA+CS(非天然产物功能化的壳聚糖和PVA共同作用组)快。此外，PVA不具有黏性，壳聚糖具有黏性但机械强度较弱，在2％的状态下甚至具有流动性，不利于材料在伤口处贴附。因此，将PVA与天然产物功能化的壳聚糖作用后，所得生物材料既具备生物活性又有一定的机械强度和黏性(图2D)。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例中不同处理组应用于伤口的愈合情况；

图2A为三组分手性超分子水凝胶敷料采用的原料示意图，包括黄芩提取物、壳聚糖、聚乙烯醇和B3；

图2B为黄芩提取物中黄芩黄酮的紫外吸收-浓度图，经绘制标准曲线计算可知黄芩黄酮的浓度为1.1769mg/mL；

图2C为手性超分子水凝胶敷料应用于伤口4天后的愈合情况图；

图2D为制备的三组分手性超分子水凝胶敷料的外观图，具有一定的机械强度和黏性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本实施例提供了一种制备天然产物功能化的壳聚糖的方法，包括如下步骤：

(a)称取10g黄芩根，碾碎后加入40mL乙醇，超声处理1h，过滤收集滤液，滤渣继续进行上述操作，重复四次，测定提取液的紫外吸收，计算黄芩黄酮的浓度。图2B为黄芩提取物中黄芩黄酮的紫外吸收-浓度图，经绘制标准曲线计算可知合并后的滤液中黄芩黄酮的浓度为1.1769mg/mL；

(b)合并滤液后，减压浓缩至50mL，温度设置为40-50℃。

(c)将减压浓缩后的黄芩提取液逐滴加入至0.5％(w/v)的壳聚糖溶液(5％的醋酸水溶液为溶剂,v/v,100mL)中，85℃反应12-16h。

以上所述原料均可从公开的市售渠道获得。所采用的壳聚糖结构式如下所示：

(a)取HOBT、Boc-苯丙氨酸、二甘醇胺和EDCI，所述HOBT、Boc-苯丙氨酸、二甘醇胺和EDCI的摩尔比为1:1:1.1:2；所述原料均可从公开的市售渠道获得；

(b)于冰浴下，将1-羟基苯并三唑(HOBT)加入至Boc-苯丙氨酸的二氯甲烷溶液中，充分搅拌，冷却至0℃然后加入二甘醇胺，完全溶解后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，撤走冰浴，室温搅拌速度为30r/min下继续反应12-16h，得粗产物Boc-苯丙酰胺一缩二乙醇。

(c)将含有Boc-苯丙酰胺一缩二乙醇的反应液中依次用饱和的柠檬酸溶液、碳酸氢钠溶液和饱和食盐水(饱和柠檬酸溶液、碳酸氢钠溶液和食盐水的体积与反应液体积相同)萃取，均萃取三次，搜集有机相，无水硫酸钠干燥除水后减压浓缩，随后将产品溶于少量乙酸乙酯(良性溶剂)中，加热促溶，完全溶解后加入石油醚(不良性溶剂)进行重结晶，晶体析出后至于-20℃过夜，抽滤得产物Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺。

(d)将Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺用二氯甲烷溶解，随后加入三氟乙酸，冰浴(0℃)下反应90min，加入甲醇终止反应，减压干燥得氨基苯丙酰胺一缩二乙醇；Boc-苯丙酰胺一缩二乙酰胺、二氯甲烷、三氟乙酸和甲醇的比例为1:1.85:1.11:18.5(n:v:v:v)。

(c)在氨基苯丙酰胺一缩二乙醇的二氯甲烷溶液中加入几滴三乙胺，冰浴下加入1,4-苯二甲酰氯，0℃下反应1h后撤去冰浴，室温搅拌反应14-16h，得1,4-苯甲酰胺二苯丙酰胺一缩二乙醇即B3。反应结束后，依次用二氯甲烷、乙醇和水洗涤，烘干可得终产物；所述氨基苯丙酰胺一缩二乙醇与1,4-苯二甲酰氯的摩尔比为2.08:1。

当步骤(a)中采用的Boc-苯丙氨酸为Boc-L-苯丙氨酸时，则制备得到的为LB3所示的化合物结构；当采用的Boc-苯丙氨酸为Boc-D-苯丙氨酸时，则制备得到的为DB3所示的化合物结构。

三组分手性超分子水凝胶敷料采用的原料示意图如图2A所示，具体步骤如下：

(a)取实施例1制备的天然产物功能化的壳聚糖(表1中的a组分，壳聚糖的浓度为13.33mg/mL,粘度为400mpa·s)5mL或10mL与5mL聚乙烯醇(表1中的b组分，浓度为10％(w/v))混合。

(b)随后将高浓度的B3加入至混合液中，快速搅拌；所述高浓度的B3为DMSO与实施例2制备的LB3和/或DB3配制的高浓储备液，浓度为50mg/mL，所用体积如表1所示。

(c)将上述三组分混合液倒入培养皿中，铺展均匀后进行冷冻-复溶循环操作，若干次后取出，冰箱中冷藏备用；冷冻-复溶循环的次数5次。

具体按表1所示的具体参数制得了12个三组分手性水凝胶敷料样品，所得样品的外观图如图2D所示，可明显看出其具有一定的机械强度和粘度。

表1

通过打孔的方式取实施例3制备的凝胶样品，贴于小鼠损伤部位，固定后，观察小鼠的伤口愈合情况。结果如图2C所示，含LB3的敷料组(实施例3所示的样品1)在四天时小鼠的伤口已经基本愈合，远快于DB3组(实施例3所示的样品2，其14天时基本愈合)和D/LB3组(实施例3所示的样品3其10天时基本愈合)，且具有统计学差异。

同时采用前述相同的方法对实施例3制备的样品4-12的伤口愈合情况进行了测试，样品4-6与样品1-3相比，仅功能化壳聚糖的量不一样。在7天时，样品4、样品7和样品10处理组小鼠伤口基本愈合；样品5、样品8和样品11需要14天才基本愈合，样品6、样品9和样品12需要10天基本愈合。

对比例1

本对比例采用与实施例3中样品1基本相同的制备方法，区别仅在于：本对比例中采用壳聚糖代替天然产物功能化的壳聚糖，即不对壳聚糖进行天然产物功能化的处理。

采用实施例4相同的方法对对比例1制备的样品的伤口愈合情况进行了测试，对比例1制备的敷料(图1所示的PVA+CS)在处理7天时，伤口仍未愈合，14天时尚有少量脓液，远达不到基本愈合的程度。感染组在14天时也并未完全愈合，尚有少量脓液。

对比例2

本对比例采用与实施例3中样品1基本相同的制备方法，区别仅在于：本对比例中不添加手性凝胶因子LB3。

采用实施例4相同的方法对对比例2制备的样品的伤口愈合情况进行了测试，对比例2制备的敷料(图1所示的PVA+CSF)在处理7天时，伤口未愈合，14天时与空白组的伤口愈合程度相当，伤口面积进一步减小，但尚未达到基本愈合程度。

此外，对于实施例中所述的样品1-3处理组，小鼠的抓挠行为及伤口处的脓液量比样品4-12组稍多，而少于PVA+CS组，可能是由于黄芩提取物的作用。

由此，本制备方法得到的敷料既弥补了壳聚糖机械强度差，PVA没有黏性的缺点，又具备手性因素，此外，天然产物提取物的加入可能具有消炎止痒功效，上述组分共同作用加快伤口愈合。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。