一株重组大肠杆菌及其高效合成胆红素的应用

技术领域

本发明涉及一株重组大肠杆菌及其高效合成胆红素的应用，属于生物催化工程领域。

背景技术

胆红素(Bilirubin,CAS No.635-65-4)是胆汁中的主要色素，由于胆红素在体内(尤其是新生儿体内)的过度积累容易引发多种疾病，如胆红素在大脑中枢神经系统中的沉积导致新生儿罹患胆红素脑病，对听觉、运动和精神功能造成损害；以及血浆中游离胆红素浓度过高易引起黄疸等。因此胆红素在很长一段时间内被认为是一种代谢废物。

然而近年来随着对胆色素的深入研究，其有益的生理学作用逐渐被发现并报道。胆红素具有抗氧化作用，在生理上可防止脂肪、蛋白质等生物大分子被氧化，清除氧自由基；血清中适当浓度的胆红素可防止心血管疾病和代谢疾病；在减少中枢神经系统中的神经元损伤方面发挥关键作用；此外，由于其显著的抗炎、抗氧化和抗病毒作用，胆红素也已被应用于新冠感染全身并发症的治疗中。2022年，全球胆红素市场规模达到100.65亿元，中国胆红素市场规模达31.99亿元，2028年全球胆红素预测市场规模将会达到141.37亿元，达到5.36％的年均复合增长率。

基于胆红素的重要作用和潜在的市场价值，已有其生产方法的开发和相应的报道。传统的制备方法是从猪、牛等家畜的胆汁中提取，近年来的研究进展主要集中在提取和纯化工艺的开发，该方法受限于猪胆汁的资源，提取率低、产量难以满足市场需求。随着合成生物学的发展，生物催化作为一种绿色制造方法，近几年在高附加值的生物有机分子合成中引起了广泛的关注。生物催化具有天然的优势，比如反应条件温和，对环境友好，反应几乎无副产物生成以及立体选择性高等。

真核生物通常具有完整的胆红素合成途径，该途径的关键代谢中间体是血红素，血红素经过血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO，EC 1.14.14.18)催化开环氧化形成中间产物胆绿素，再经过胆绿素还原酶(Biliverdin reductase,BVR,E.C.1.3.1.24)催化的加氢还原形成胆红素，反应式如图9所示。

目前有关生物法合成胆红素及其关键中间体的研究存在少量报道，如闫思翰等构建Clostridium tetani来源的血红素加氧酶和谷氨酸脱氢酶辅酶再生系统并进行膜表面展示，以E.coli全细胞为催化剂，胆绿素产量达到76.3mg/L；Jianfeng Mei等以胆绿素为底物，以E.coli为宿主表达蓝藻来源的胆绿素还原酶作为全细胞催化剂，胆红素产量达到325mg/L。目前的研究报道显示，由血红素加氧酶催化的血红素转化速率，远低于由胆绿素还原酶催化的胆绿素转化速率，导致难以利用低成本的血红素为底物进行两步生物催化。

发明内容

血红素加氧酶缺少辅酶结合的结构域，无法直接从NADPH中获取电子和还原力。电子传递至底物血红素的过程需要氧化还原伴侣蛋白的参与，伴侣蛋白中包含FAD、FMN或Fe-S簇，并通过构象重排将电子从NADPH转移至血红素分子上。因此，在催化体系中引入伴侣蛋白可能有助于改善血红素加氧酶的催化效率，使得以血红素为底物，经过两步生物级联反应催化合成胆红素的路线具有更高的可行性和良好的研究前景。

本发明基于胆红素合成代谢途径筛选了一系列不同来源的血红素加氧酶(HOs)和胆绿素还原酶(BVRs)，以模式菌株Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主，对所有的蛋白序列经过密码子优化；为了提高蛋白的可溶性表达量，在野生型酶的基础上构建了截短突变体，实现了在同等浓度的全细胞催化剂中具有催化活性的蛋白含量显著提高。通过高效液相色谱测定产物的生成，进一步筛选到了最优的HO和BVR。由于血红素加氧酶产生催化功能需要多种伴侣蛋白：细胞色素P450还原酶(CPR)、铁氧还蛋白(Fd)和铁氧还蛋白还原酶(FNR)中的至少一种辅助电子传递，因此，同样基于酶活力筛选了最优的伴侣蛋白，并分别构建了用于催化血红素转化为中间产物胆绿素，以及胆绿素转化为终产物胆红素的两种工程菌株。为了进一步降低生产成本，在所有工程菌株中额外表达了NADP

本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了来源于Saccharomyces cerevisiae的血红素加氧酶、来源于Mus musculus的胆绿素还原酶、来源于Azospirillum palustre的NADP

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET28a(+)或pETDuet-1为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述不同来源的血红素加氧酶，分别来源于Homosapiens(HsHO，NP_002124.1)，Rattus norvegicus(RnHO，AAA41346.1)，Glycine max(GmHO，NP_001304379.2)，Arabidopsis thaliana(AtHO，ABE65721.1)，Plasmodiumfalciparum(PfHO，CZT98369.1)，Saccharomyces cerevisiae(ScHO，GHM92019.1)，Synechocystis sp.PCC 6803(SynHO，BAA18219.1)，Clostridium tetani(CtHO，WP_035111656.1)，Corynebacterium glutamicum(CgHO，BAV23840.1)。

优选的，血红素加氧酶是ScHO(GHM92019.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或血红素加氧酶是依次删除其C端289-318位氨基酸得到的血红素加氧酶ScHO(GHM92019.1)。

SEQ ID NO.1:

atggaagatagcagcaacaccatcatcccgtccccgaccgatgttggcgccctggcgaaccgtatcaacttccagacccgcgatgcgcacaacaaaatcaacaccttcatgggtatcaaaatggcgatcgcaatgcgtcacggcttcatctaccgccagggcatcctggcgtactactacgttttcgacgcgatcgaacaggaaatcgatcgtctgctgaacgatccggtgaccgaagaagaattgcagacctccaccatcctgaaacagttctggctggaggacttccgccgtagcacccagatctacaaagatctgaaactgctgtacagcaacaccttcaaatccaccgaaagcctgaacgagttcctggcgaccttccagaaaccgccgctgctgcaacagttcatcaacaacatccatgaaaacatccacaaagaaccgtgcaccatcctgtcctactgccacgttctgtacctggccctgttcgcgggcggcaaactgatccgttccaacctgtaccgtcgcctgggtctgttcccgaacttcgaaaaactgtctcagaaagaactggttaaaaaaggcaccaacttcttcaccttctccgacctgggcccgaccgaagaaacccgcctgaaatgggaatataaaaagaactacgaactggcaacccgtaccgaactgaccgaagcgcagaaactgcaaatcatctccgttgcggaaggtatcttcgactggaactttaacatcgtggcggaaatcggcgaactgaaccgtcgtgaactgatgggcaaattctctttcaaatgcatcacctacctgtacgaagaatggatgttcaacaaagatagcgcgacccgccgtgcgctgcacaccgttatgctgctgatgctgagcatcatcgcgatctgggttctgtacttcctggtgaaaaaatctttcctgagcatcgtttaa

在本发明的一种实施方式中，所述不同来源的胆绿素还原酶分别来源于Homosapiens(HsBVR，NP_000703.2)，Rattus norvegicus(RnBVR，NP_446302.2)，Mus musculus(MmBVR，XP_030102511.1)，Bos taurus(BtBVR，NP_001091040.1)，Sus scrofa(SsBVR，XP_003134937.1)，Cavia porcellus(CpBVR，XP_003470146.1)，Rhinopithecus bieti(RbBVR，XP_017750420.1)，Felis catus(FcBVR，XP_023105956.1)，Mycobacterium tuberculosis(MtBVR，WP_003899157.1)，Synechocystis sp.PCC 6803(SynBVR，BAA16797.1)。

优选的，胆绿素还原酶是MmBVR(XP_030102511.1)，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2:

atgagcaccgaaccgaaacgtaaattcggcgttgttgttgttggtgttggtcgcgcgggcagcgttcgtatccgtgatctgaaagatccgcactctagcgcgttcctgaa

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在本发明的一种实施方式中，所述伴侣蛋白有两种不同类型，分别适配不同来源的血红素加氧酶。

所述第一种类型由单个蛋白组成，所述蛋白为细胞色素P450还原酶，所述细胞色素P450还原酶分别来源于Homo sapiens(HsCPR，NP_001382342.1)，Rattus norvegicus(RnCPR，NP_113764.1)，Candida albicans(CaCPR，XP_720425.2)，Saccharomycescerevisiae(ScCPR，NP011908.1)。

优选的是ScCPR(NP_011908.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或依次删除ScCPR(NP_011908.1)N端1-24位氨基酸的细胞色素P450还原酶。

SEQ ID NO.3:

atgccgttcggcatcgataacaccgatttcaccgttctggcgggtctggttctggcagtgctgctgtacgtgaaacgtaacagcatcaaagaactgctgatgagcgatgacggtgacatcaccgcggttagcagcggcaaccgcgacatcgcgcaggttgttactgaaaacaacaaaaactacctggtgctgtacgcgtcccagaccggcaccgctgaagattacgctaaaaaattcagcaaagaactggttgcgaaattcaacctgaacgtgatgtgcgctgacgttgaaaactacgatttcgaaagcctgaacgacgtgccggttatcgtgagcattttcatctccacctacggtgaaggcgatttcccggacggcgcggtgaacttcgaggactttatttgcaacgcggaagctggcgcgctgagcaacctgcgttacaacatgtttggtctgggtaacagcacctacgaatttttcaacggcgctgcgaaaaaggcggaaaaacacttgtccgctgccggtgcgattcgtctgggtaaactgggcgaagcggatgatggcgcgggcacgaccgatgaagattacatggcgtggaaagatagcatcctggaagtgctgaaagatgaactgcacctggatgaacaggaagcgaaattcacttcccagttccagtataccgtgctgaacgaaattacggatagcatgagcctgggtgaaccgtcggcgcattacctgccgagccatcagctgaaccgtaacgcggatggtattcagctgggcccgtttgatctgagccagccgtacatcgcgccaattgttaaatctcgtgaactgttctcttccaacgatcgtaactgtatccattctgagttcgacctgtctggctctaacattaaatactctaccggcgaccacttggcagtgtggccgtctaacccgctggaaaaagttgaacagttcctgtctattttcaacctggacccggaaactatcttcgatctgaaaccgctggacccgactgttaaagttccgttcccgactccgaccaccatcggcgcagcgatcaaacactacctggaaattaccggcccggttagccgtcagctgttttccagcttaatccagttcgctccgaacgcggatgttaaagaaaaactgaccctgctgagcaaagataaagaccagtttgcggttgaaatcaccagcaaatatttcaacatcgctgacgcgctgaaatacctgagcgatggagctaaatgggataccgttccgatgcagttcctggtggaatctgtgccgcagatgaccccgcgttattactctatctcctcctcctctctgtccgaaaaacagactgttcacgtgaccagcatcgtggagaactttccgaacccggaactgccggacgctccgccggttgttggcgttaccaccaacctgctgcgtaacatccagctggcgcagaataacgtgaacattgcggaaaccaacctgccggttcattacgatctgaacggcccgcgtaaactgttcgctaactacaaactgccggttcacgttcgtcgtagcaacttccgcctgccgtctaatccgagcacgccggtgatcatgatcggcccaggcaccggcgttgcgccattccgtggtttcatccgcgaacgtgtggcgttcctggaatctcagaaaaaaggtggtaacaacgtgtctctgggtaaacacatcctgttctacggcagccgcaacaccgatgacttcctgtatcaggatgaatggccggaatacgcgaaaaaactggacggctccttcgaaatggttgttgcacactcccgtctgccgaacaccaaaaaagtttacgtgcaggataaactgaaagactacgaggaccaggtttttgaaatgattaacaacggcgcattcatctatgtttgtggtgatgcaaaaggcatggctaaaggcgtgagcaccgcgctggttggtatcctgtcccgtggcaaaagcatcaccaccgatgaagcgaccgaactgatcaaaatgctgaaaaccagcggtcgctaccaggaagatgtgtggtaa

所述第二种类型由两个蛋白组成，所述蛋白为铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶：

所述铁氧还蛋白分别来源于Glycine max(GmFd，XP_014619795.1)，Pseudomonasputida(PpFd，PDB code 1PDX)，Arabidopsis thaliana(AtFd，NP_176291.1)。

优选的是AtFd(NP_176291.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

SEQ ID NO.4:

atggcgtctaccgcgctgagcagcgcgatcgttggcaccagcttcatccgtcgtagcccggcgccgatcagcctgcgtagcctgccgagcgcgaacacccagagc

ctgttcggcctgaaaagcggcaccgcgcgtggcggtcgtgttaccgcgatggcgacctacaaagttaaattcatcaccccggaaggtgaactggaagttgaatgcga

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所述铁氧还蛋白还原酶分别来源于Pisum sativum(PsFNR，XP_050906496.1)，Arabidopsis thaliana(AtFNR，CAB52472.1)，Pseudomonas putida(PpFNR，PDB code1Q1R)，Zea mays(ZmFNR，NP_001336742.1)。

优选的是AtFNR(CAB52472.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5:

atggcggcggcgatcagcgcggcggttagcctgccgtcctccaaaagctctagcctgctgaccaaaatctccagcgtgagcccgcagcgtatcttcctgaaaaaga

gcaccgtgtgctaccgccgtgttgtgtccgttaaagcgcaggttaccactgataccaccgaagcgccgccggtgaaagttgtgaaagaaagcaaaaaacaggaaga

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在本发明的一种实施方式中，所述蛋白的截短突变体是指在野生型ScHO的基础上，依次删除C端289-318位氨基酸，形成截短突变体ScHOΔ10-ScHOΔ30；以及在野生型ScCPR的基础上，依次删除N端1-24位氨基酸，形成截短突变体ScCPRΔ8-ScCPRΔ24。

在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶是来源于Azospirillum palustre(WP_098736599.1)的NADP

SEQ ID NO.6：

Atggcgaaaatcgtttgcgttctgtacgatgatccggttaccggctacccgaccagctacgcgcgtgacgacctgccgaaaatcgacggttacgcgggcggccagaccctgccgaccccgaaagcgattgacttccagccgggcaccctgctgggctccgttagcggcgaactgggtctgcgccgttatctggaatccctgggtcacgaactggttgtgaccagcgacaaagacggcccggattcccgtctggaaaaagaactggcggatgcggaaatcgttatctctcagccgttctggcctgcttacctgaccgcagaacgcatcgctaaagctccgaaactgaaactggcgctgaccgctggcatcggttccgatcacgttgatctgcaggcggcgatggatcgcggcgttaccgttgctgaagttacctatagcaacagcatctccgttgcggaacatgtcgtgatgatgatcctgggcctggttcgtaactacctgccatctcacgactgggttcgcaaaggtggttggaacatcgcggattgtgtggcacgctcttacgatgtggaaggcatgcatgttggcaccgtgggtgctggtcgtattggcctggcggtgctgcgtcgtctgaaaccgttcgatatgcacctgcactacacccagcgtcaccgtctgccggaaagcgtagaagcagaactgaacctgacctggcacgcgacccgcgaagaaatgttcgaagtgtgcgatgtcgtgaccctgaacgcaccgctgcacccggaaaccgaacacatgattaacgaagaaaccctgaaacgtttcaaacgtggtgcgtatctggtgaataccgctcgtggcaaactgtgcgaccgcgatgctatcgcacgcgccctggaatctggtcgtctggccggttacgctggtgatgtttggttcccgcaaccggctccgcaggatcacccgtggcgtaccatgccgcaccacggcatgactccgcacatcagcggtacttctctgtctgcgcagacccgttacgcggcgggtactcgtgaaatcctggaatgctggtttgaaggccgtccgatccgcgacgaatacctgatcgtggatggcggccgtctggcgggcgtgggcgcgtcttcttactctgcgggtaacgcgactggtggcagcgaagaagcggaacgtttcaaagcggcggttccggcataa。

在本发明的一种实施方式中，所述高效液相检测方法是指检测血红素加氧酶催化的产物胆绿素的含量，或检测胆绿素还原酶催化的产物胆红素的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述血红素加氧酶的酶活力是以血红素为底物进行反应，经HPLC检测其产物胆绿素峰面积衡量的。所述血红素加氧酶的筛选是通过比较酶活力进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述胆绿素还原酶的酶活力是以胆绿素为底物进行反应，经HPLC检测其产物胆红素峰面积衡量的。所述胆绿素还原酶的筛选是通过比较酶活力进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述伴侣蛋白的筛选是以优选的血红素加氧酶为催化剂，以血红素为底物进行反应，额外添加一种或多种伴侣蛋白，经HPLC检测其产物胆绿素峰面积并计算相应的酶活力，根据酶活力与对照组的增加量衡量的。

本发明还提供了编码上述血红素加氧酶、胆绿素还原酶、甲酸脱氢酶和伴侣蛋白的碱基序列。

本发明还提供了一种或多种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET28a或pETDuet-1为表达载体。

本发明还提供了一种或多种表达上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建是通过PCR扩增血红素加氧酶(HOs)、胆绿素还原酶(BVRs)、伴侣蛋白(CPRs，Fds，FNRs)或甲酸脱氢酶(ApFDH)，克隆到质粒pET28a，构建重组质粒pET28a-HOs，pET28a-CPRs，pET28a-BVRs，pET28a-FNRs，pET28a-Fds，pET28a-ApFDH，构建重组大肠杆菌全细胞催化剂。

在本发明的另一种实施方式中，所述重组菌的构建是通过PCR扩增优选的血红素加氧酶截短突变体(ScHOΔ30)，优选的胆绿素还原酶(MmBVR)，优选的伴侣蛋白或其截突变体(ScCPRΔ24，AtFNR，AtFd)以及甲酸脱氢酶(ApFDH)，克隆到质粒pETDuet-1，构建重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30/ScCPRΔ24/MmBVR/ApFDH，以及pETDuet-1-ScHOΔ30/AtFNR/AtFd/MmBVR/ApFDH构建重组大肠杆菌全细胞催化剂。

本发明提供了一种提高大肠杆菌胆红素合成能力的方法，所述方法为，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主细胞，表达了来源于Saccharomyces cerevisiae的血红素加氧酶、来源于Mus musculus的胆绿素还原酶、来源于Azospirillum palustre的NADP

在本发明的一种实施方式中，所述血红素加氧酶为NCBI登录号为GHM92019.1的血红素加氧酶或依次删除其C端289-318位氨基酸得到的血红素加氧酶；所述胆绿素还原酶的NCBI登录号为XP_030102511.1，所述细胞色素P450还原酶为NCBI登录号为NP_011908.1的细胞色素P450还原酶或依次删除其N端1-24位氨基酸的细胞色素P450还原酶，所述铁氧还蛋白的NCBI登录号为NP_176291.1，所述铁氧还蛋白还原酶的NCBI登录号为CAB52472.1。

本发明还提供了一种全细胞催化合成胆红素的方法，所述方法为，以血红素为底物，在通气条件下，采用上述重组细胞裂解液或上述重组大肠杆菌全细胞催化转化合成胆红素。

在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化体系包含但不限于血红素1mM(合651mg/L)，通气量10vvm，血红素预溶于总反应体积50％的NaOH溶液(100mM)中，完全溶解后用HCl调节pH至7.5，用50mM的甲酸铵溶液(pH 7.5)补齐反应体积，反应时间为2h，反应温度35℃。

在本发明的一种实施方式中，所述是全细胞催化剂的获得，是将重组菌培养后诱导其表达血红素加氧酶，胆绿素还原酶，伴侣蛋白和甲酸脱氢酶，进一步收集重组菌菌体得到。

在本发明的一种实施方式中，所述是全细胞催化剂的获得，是将共表达血红素加氧酶，胆绿素还原酶，伴侣蛋白和甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌按1％接种量到100mL LB培养基中，37℃培养，当OD

在本发明的一种实施方式中，所述全细胞催化的反应条件为：搅拌转速200r/min，温度35℃，pH 7.5，通气量10vvm，反应时间1～4h。

在本发明的一种实施方式中，血红素的添加量为：0.5～4mM(合325～2604mg/L)，所述催化剂的添加量：10～40g/L。

本发明提供了上述重组大肠杆菌或上述方法在制备胆红素或含有胆红素的产品中应用。

有益效果

(1)本发明成功筛选到了高活力的血红素加氧酶和胆绿素还原酶，同时筛选到恰当的伴侣蛋白进一步提高血红素加氧酶的催化效率。此外，对血红素加氧酶和伴侣蛋白进行截短突变，显著提高可溶性表达水平。大肠杆菌内共表达上述基因，同时偶联高活力甲酸脱氢酶，成功实现了在单个细胞中重构完整的血红素降解级联反应，同时无需外源添加NADPH，利用细胞内源性辅酶即可达到高催化活力，催化过程中无中间产物胆绿素的积累。以血红素为底物，经过多酶一锅级联催化，胆红素最终产量可达415.5mg/L。

(2)此全细胞转化体系的建立，解决了传统的生物组织提取法生产胆红素的过程中步骤繁琐、得率低、废水排放大等问题，具有良好的原子经济性，实现了以血红素为底物，高效绿色合成胆红素，根据目前所有数据资料显示本发明中的胆红素产量为生物法合成的最高水平。

附图说明

图1：所有待筛选基因的蛋白表达情况。

图2：基于蛋白凝胶的蛋白表达量定量分析。

图3：胆绿素和胆红素的HPLC谱图和标准曲线；其中，a，胆绿素的色谱图；b，胆绿素的标准曲线；c，胆红素的色谱图；d，胆红素的标准曲线。

图4：野生型ScHO(a)和ScCPR(c)的结构模型(疏水性肽段标记为红色)，以及基于PortScale的ScHO(b)和ScCPR(d)氨基酸序列疏水性分析。

图5：ScHO与截短突变体RnHOΔ30蛋白表达量的对比；其中，(a)，以及ScCPR与截短突变体ScCPRΔ24蛋白表达量的对比(b)。

图6：重组大肠杆菌E.coli-ScHOΔ30/ScCPRΔ24/MmBVR/ApFDH在不同底物浓度下的反应进程曲线。

图7：血红素的标准曲线。

图8：重组大肠杆菌E.coli-ScHOΔ30/ScCPRΔ24/MmBVR/ApFDH在2L规模下的反应进程曲线。

图9：胆红素反应式。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的核酸胶的制备：

50×TAE缓冲液:准确称量Tris 242g和Na

下述实施例中所涉及的凝胶电泳：

将凝胶放入装有1×TAE缓冲液的电泳槽，电泳条件设置为160V、15min，电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外灯下观察条带。消化模板：取50μL电泳检测为阳性的PCR产物，加入1μL的内切酶DpnⅠ以及5μL对应的Buffer，去除甲基化的模板DNA，反应条件为37℃，3h。反应结束后在65℃下保温10min使DpnⅠ失活。

下述实施例中所涉及的产物纯化：

按

下述实施例中所涉及的同源重组：

按

下述实施例中所涉及的重组质粒的转化：

将同源重组的反应液全部加入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，混匀，冰浴放置30min；置于42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴冷却5min，加入600μL LB培养基，37℃、200rpm培养1h；吸取50μL涂布于含有对应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养12h；挑取单菌落进行测序验证，保藏导入了正确重组质粒的菌株。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

SDS-PAGE凝胶电泳：

准备BBI免封闭SDS-PAGE变性丙烯酰胺彩色凝胶快速制备试剂盒，并按说明书制备蛋白胶。样品准备：取含有目的蛋白的湿菌体，用PB buffer(pH 7.4，50mM)配制20g/L细胞悬浮液，置于冰浴上超声破碎(450W，工作1s，暂停4s，共10min)。12,000×g、4℃离心1min，分离上清与沉淀。取20μL上清，与8μL Loading buffer混合，沸水浴加热10min，12,000×g离心5min，备用。

电泳。蛋白胶上样量：样品10μL，Marker 3μL；电泳条件：160V，60min；电泳缓冲液(g/L)：甘氨酸14.4，SDS1，Tris 3。

染色：蛋白胶于染色液(考马斯亮蓝R250 1g，甲醇450mL，乙酸100mL，水450mL)中浸泡15min，水洗2次。脱色：于脱色液(乙醇10％，乙酸10％，水80％)中浸泡并轻微摇晃，更换新鲜的脱色液直至条带清晰可见。

胆绿素和胆红素检测

流动相：A(25mM乙酸铵，乙酸调节pH至3.5)；B(乙腈：甲醇：异丙醇＝8：1：1)；A:B＝5:95；柱温：35℃，色谱柱：C18，进样量：5μL，运行时间10min，检测波长400nm。胆绿素和胆红素的色谱图，以及相应的标准曲线如说明书附图3所示。

下述实施例中所涉及的基因挖掘获得的待筛选蛋白如表1所示。

表1基因挖掘获得的待筛选蛋白

实施例1：基因合成与表达

具体步骤如下：

(1)重组载体的构建

在NCBI数据库中筛选获取具有催化潜力的血红素加氧酶、胆绿素还原酶和伴侣蛋白的氨基酸序列，其对应的NCBI编号或GenBank号如表1所示。

此外，经过序列和结构比对获得了高活力的NADP

(2)重组菌株的构建

选择Escherichia coli BL21(DE3)作为表达宿主，将上述步骤(1)得到的重组质粒分别导入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中并涂布至含有硫酸卡那霉素(Kan)的LB固体培养基平板上，挑取阳性转化子进行菌种保藏，获得对应的工程菌株。

(3)蛋白的表达

分别将得到的工程菌株接种至含有Kan的LB液体培养基试管中，37℃、200rpm培养8-10h获得种子液。以1％的接种量将种子液接种至含有Kan的LB液体培养基摇瓶中(100mL装液/500mL容积)，37℃、200rpm培养至OD

将得到的发酵液低温离心，离心条件为8,000×g，10min，4℃，离心后弃上清，沉淀用生理盐水清洗两次，获得含有目的蛋白的湿菌体；得到的湿菌体在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下进行超声破碎，获得细胞裂解液即为本发明实施例中需要添加的催化剂。

将得到的细胞裂解液通过SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白的可溶性表达。蛋白表达情况如图1所示，结果显示：所有合成的基因在大肠杆菌中都成功实现异源表达，并呈现出不同的表达水平。

实施例2：血红素加氧酶的筛选

具体步骤如下：

首先对实施例1得到的不同表达量的蛋白表达进行定量分析；使用Image J根据蛋白胶条带大小和深浅形成谱图，对相应峰进行积分，并选择E.coli基因组中表达恒定的一个蛋白条带作为内参，对积分结果归一化，确定不同来源蛋白的相对表达量，并计算粗酶液的实际添加量，确保每种蛋白的终浓度相同。基于Image J的蛋白胶分析结果(以ScCPR的蛋白胶图为例)如图2所示，每种蛋白的相对表达量如表2所示。

表2不同来源的蛋白相对表达量

按照实施例1的方法，制备得到的含血红素加氧酶的细胞裂解液，根据表2所示的蛋白相对表达量计算细胞的实际用量，使每种血红素加氧酶的实际浓度相等。例，CgHO的相对表达量为100％，SynHO的相对表达量为49.1％，则当含CgHO的细胞裂解液的浓度为10g/L时，需要含SynHO的细胞裂解液的浓度达到20.4g/L，才能使两种细胞中的血红素加氧酶数量相等。

具体步骤如下：

(1)细胞裂解液的制备

血红素加氧酶的裂解液的制备：分别称取相应质量的实施例1步骤(3)制备得到的湿菌体E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-HO，在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下进行超声破碎，获得血红素加氧酶的裂解液，以该裂解液为催化剂进行血红素的转化反应。

氧化还原伴侣蛋白的混合裂解液的制备：按照实施例1的方法，将步骤(3)制备得到的含有目的蛋白的E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-CPR、E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Fd、E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-FNR共11种湿菌体等比例混合，每种细胞占比9.09％，在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下，破碎得到混合裂解液。

转化条件：1mL反应体系，血红素加氧酶粗酶液以表达量最高的CgHO为基准添加其细胞裂解液10g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，氧化还原伴侣蛋白的混合裂解液40g/L(所述裂解液的添加量为：按照1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例分别称取全细胞进行混合，全细胞总的添加量为10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度；不同来源的血红素加氧酶催化产生的胆绿素浓度如表3所示。

表3不同来源血红素加氧酶催化产生的胆绿素浓度

根据检测结果，优选的血红素加氧酶是ScHO，GmHO，SynHO和CgHO；更优选的是ScHO。

实施例3：伴侣蛋白的筛选

在实施例2筛选血红素加氧酶的过程中，所用的伴侣蛋白是表1所示所有伴侣蛋白的混合裂解液(包括细胞色素P450还原酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶)。为了进一步筛选最优的伴侣蛋白，以ScHO作为催化血红素转化为胆绿素的催化剂，分别单独添加不同来源的伴侣蛋白进行转化实验。伴侣蛋白存在两种类型，第一类是由单独的细胞色素P450还原酶组成的具有完整电子传递功能的伴侣蛋白；第二类是由铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶组成的具有完整电子传递功能的伴侣蛋白组合。因此，转化实验按以下两种反应体系进行。

体系1：

1mL反应体系，血红素加氧酶ScHO细胞裂解液10g/L(按照实施例2的方法制备，所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，细胞色素P450还原酶以表达量最高的RnCPR为基准，添加的细胞裂解液为20g/L(按照实施例2的方法制备，区别在于仅添加E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-CPR，所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，8,000×g反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。

体系2：

铁氧还蛋白还原酶裂解液的制备：分别称取相应质量的实施例1步骤(3)制备得到的湿菌体E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-FNR，在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下进行超声破碎，获得铁氧还蛋白还原酶的裂解液。

铁氧还蛋白混合裂解液的制备：分别称取相应质量的实施例1步骤(3)制备得到的湿菌体E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-Fd，共3种湿菌体(Glycine max,Pseudomonasputida,Arabidopsis thaliana来源的Fd)按等比例混合，每种菌体占比33.3％，在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下进行超声破碎，获得铁氧还蛋白的混合裂解液。

1mL反应体系，血红素加氧酶ScHO的细胞裂解液10g/L(按照实施例2的方法制备，所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，氧还蛋白还原酶以表达量最高的PpFNR为基准添加相应的细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，铁氧还蛋白的混合裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：按照1:1:1的比例分别称取表达Glycine max Pseudomonas putidaArabidopsis thaliana来源的Fd全细胞进行混合，全细胞总的添加量为20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。

伴侣蛋白的筛选结果如表4所示。

表4添加不同来源伴侣蛋白催化产生的胆绿素浓度

根据检测结果，优选的组合是ScHO+ScCPR，ScHO+AtFNR+Fd混合裂解液。

以优选的ScHO+AtFNR+Fd裂解液作为催化剂，进一步筛选铁氧还蛋白，反应体系如下：

1mL反应体系：

血红素加氧酶ScHO的细胞裂解液10g/L(按照实施例2的方法制备，所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，氧还蛋白还原酶AtFNR的细胞裂解液添加20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，铁氧还蛋白以表达量最高的GmFd为基准添加对应的细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。

铁氧还蛋白的筛选结果如表5所示。

表5添加不同来源铁氧还蛋白催化产生的胆绿素浓度

根据检测结果，优选的组合是ScHO+AtFNR+AtFd。

根据本实施例所有筛选结果，优选的组合是ScHO+ScCPR，以及ScHO+AtFNR+AtFd。其中更优选的组合是ScHO+ScCPR。

实施例4：胆绿素还原酶的筛选

具体步骤如下：

1mL反应体系，胆绿素还原酶细胞裂解液以表达量最高的RbBVR为基准添加1g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞1g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，胆绿素盐酸盐0.5mM，NADPH 1mM，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL的DMSO和二氯甲烷混合液(体积比5:1)，12,000×g离心1min，取上清液，按实施例2所述HPLC方法检测胆红素浓度。胆绿素还原酶的筛选结果如表6所示。

胆绿素还原酶裂解液的制备：分别称取相应质量的实施例1步骤(3)制备得到的湿菌体E coli BL21(DE3)/pET28a(+)-BVR，在400W，0℃，工作2s，间歇4s，总时间10min的超声条件下进行超声破碎，获得胆绿素还原酶的裂解液。

表6不同来源胆绿素还原酶催化产生的胆红素浓度

根据检测结果，优选的胆绿素还原酶是MmBVR。

实施例5：截短突变体的构建

从说明书图1可以看出，优选的ScHO和ScCPR的蛋白可溶性表达量不高，导致发酵收获的细胞中的有效催化成分过低。这两个蛋白在天然宿主中属于结合在线粒体内膜上的膜蛋白，不利于在胞质中可溶性表达。因此，通过PortScale在线分析了两者氨基酸序列的疏水性，分析结果如说明书图4所示。其中ScHO的C端289-318位氨基酸被识别为疏水的跨膜肽段；ScCPR的N端1-24位氨基酸被识别为疏水的跨膜肽段。按表7所示引物PCR扩增截短了不同长度跨膜肽段的ScHO和ScCPR，并按照实施例1的方法重新构建重组质粒pET28a(+)-ScHOΔ10/20/30、pET28a(+)-ScCPRΔ8/16/24及重组菌株E.coli BL21(DE3)

/pET28a(+)-ScHOΔ10/20/30、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-ScCPRΔ8/16/24，所涉及的引物如表7所示。

表7截短突变的引物及其扩增产物

按Takara

体系1：1mL反应体系，ScHO截短突变体细胞裂解液10g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mMNaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，ScCPR细胞裂解液50g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞50g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。不同ScHO截短突变体的实验结果如表8所示。

表8：ScHO及截短突变体催化生成的胆绿素浓度

根据检测结果，优选的截短突变体是ScHOΔ30。

体系2：1mL反应体系，ScCPR截短突变体细胞裂解液10g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，ScHO细胞裂解液50g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞50g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，于35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。不同ScCPR截短突变体的实验结果如表9所示。

表9ScCPR及截短突变体催化生成的胆绿素浓度

根据检测结果，优选的截短突变体是ScCPRΔ24。

以两种优选的突变体为催化剂，按以下反应条件进行转化实验：

1mL反应体系，ScHOΔ30细胞裂解液10g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，NADPH 4mM，ScCPRΔ24细胞裂解液10g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞10g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度。

反应液中检测到的胆绿素浓度达到81.4mg/L，如说明书附图5所示，截短突变后蛋白表达量得到改善。

实施例6：多酶共表达工程菌株的构建

通过将优选的多种酶整合至同一株大肠杆菌中，进一步提高催化能力和工业化应用前景。需要共表达的蛋白被确定为ScHOΔ30，ScCPRΔ24，AtFNR，AtFd和HsBVR；为了降低辅酶NADPH的用量和成本，额外选择来源于Azospirillum palustre(WP_098736599.1)的NADP

对于ScHOΔ30+ScCPRΔ24+MmBVR+ApFDH，分别以pETDuet-1和含有ScHOΔ30、ScCPRΔ24、MmBVR、ApFDH的pET28a(+)为模板，按表10所示引物，进行4轮PCR构建重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH。

表10构建重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH的引物

将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH。

对于ScHOΔ30+AtFNR+AtFd+MmBVR+ApFDH，在重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH的基础上，将ScCPRΔ24替换为AtFNR-AtFd，具体按表11所示引物进行2轮PCR，构建获得重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30-AtFNR-AtFd-MmBVR-ApFDH。

表11构建重组质粒pETDuet-1-ScHOΔ30/AtFNR/AtFd/MmBVR/ApFDH的引物

将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-ScHOΔ30-AtFNR-AtFd-MmBVR-ApFDH。

按实施例1所示进行细胞培养，并获得上述两种不同重组大肠杆菌的湿菌体，破碎后按以下反应体系进行转化实验。

1mL反应体系，重组大肠杆菌细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，氯化血红素0.5mM(用100mM NaOH溶解，并用HCl调节pH至7.5)，甲酸铵5mM，Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)补至1mL，置于2mL EP管中，35℃，200rpm反应10min，反应结束后取50μL反应液，加入950μL DMSO和二氯甲烷混合液(体积比5:1)，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆红素浓度。实验结果如表12所示。

表12不同重组大肠杆菌催化合成胆红素的浓度

检测结果显示，优选的重组菌是E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH。

实施例7：重组大肠杆菌催化合成胆红素

以重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-ScHOΔ30-ScCPRΔ24-MmBVR-ApFDH作为优选的催化剂，进行放大的转化实验。

1、摇瓶实验

(1)首先尝试了该催化剂的底物负载。

反应条件为：100mL反应体系，重组大肠杆菌细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，溶剂为甲酸铵溶液(pH7.5，50mM)，EDTA-Na

在上述反应条件下，分别添加0.5～4.0mM(0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM)的血红素，反应过程中持续取样，50μL反应液样品，加入950μL DMSO和二氯甲烷混合液(体积比5:1)，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆红素浓度。

不同底物浓度下的反应结果如说明书附图6所示。

检测结果显示底物血红素对反应过程有一定的抑制作用，血红素浓度不宜过高，在1mM的底物负载量下，获得较好的胆红素产量402.5mg/L，产率为68.9％。

最终确定反应条件为：重组大肠杆菌细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，血红素1mM，溶剂为甲酸铵溶液(pH 7.5，50mM)，EDTA-Na

2、上罐实验

将下述反应条件放大至5L容积的生物反应器中，装液量为2L，进行催化反应。

重组大肠杆菌细胞裂解液20g/L(所述裂解液的添加量为：先称取全细胞20g/L，破碎后即为相应的需要添加的裂解液)，血红素1mM，溶剂为甲酸铵溶液(pH 7.5，50mM)，EDTA-Na

反应过程持续取样，通过HPLC检测胆红素浓度、胆绿素浓度和血红素浓度；方法为：向50μL反应液样品中加入950μL DMSO和二氯甲烷混合液(体积比5:1)，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆红素浓度；另取50μL反应液样品，加入950μL甲醇，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测胆绿素浓度；另取50μL反应液样品，加入950μL NaOH(100mM)，12,000×g离心1min，取上清液，通过HPLC检测血红素浓度。

所述血红素的检测条件为：流动相：A(0.5％三氟乙酸水溶液)；B(乙腈：甲醇＝9：1)。进样程序：0min，20％A，0-30min，20％→90％A，30-31min，90％→20％A，31-35min，20％A。柱温：40℃，色谱柱：C18，进样量：5μL，运行时间35min，检测波长400nm。血红素的标准曲线如说明书附图7所示。根据HPLC检测结果，在2L体系中的底物血红素、中间产物胆绿素以及最终产物胆红素随反应进行的变化曲线如说明书附图8所示，具体的数据如表13所示。

表13反应进程中血红素、胆绿素和胆红素浓度随时间变化情况

结果显示：产物胆红素产量在反应40min时达到最高值，415.5mg/L，产率达到71.2％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。