对人IL-4受体α具有高亲和力的人抗体及其用途

【技术领域】

本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与作为人IL-4(hIL-4)的受体的人IL-4受体α(hIL-4Rα)以高亲和力结合；一种编码所述分离的抗体或其抗原结合片段的核酸；一种包含所述核酸的载体；一种用所述载体转化的细胞；一种用于产生所述抗体或其抗原结合片段的方法；一种含有所述抗体或其抗原结合片段的缀合物；一种用于预防或治疗炎性疾病的含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物；以及一种用于诊断炎性疾病的含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物。

【背景技术】

过敏性疾病(如特应性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘和食物过敏)与Th2细胞对无害环境抗原(过敏原)的反应加重有关。

过敏原被抗原呈递细胞捕获，迁移到淋巴结，并作用于淋巴结中的幼稚T辅助细胞(Th0)以通过IL4诱导Th0细胞的分化。过敏原特异性Th细胞属于Th2表型，并且是通过白介素-4(IL-4)从前体细胞T细胞分化的，从而发育为Th2细胞。激活后，Th2细胞分泌白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)，它们连同与其表面结合的信号一起诱导B细胞转化为产生IgE的浆细胞。IgE分子与肥大细胞中的高亲和力FcεR结合，然后遇到过敏原，从而诱导肥大细胞的激活并诱导过敏反应介质的释放。Th2细胞因子还促进嗜酸性粒细胞的存活并促进肥大细胞的生长，所述肥大细胞释放另外的Th2细胞因子，所述另外的Th2细胞因子可以增强IgE产生、Th2细胞分化和脱粒后嗜酸性粒细胞的存活。

因此，Th2细胞在过敏反应的诱导和发展中发挥关键作用。因此，预期中和并抑制Th2细胞因子(例如，IL-4和IL-13)的作用以抑制其发展和/或其效应物的作用是介导过敏反应的有效方法。

IL-4特异性药物(即奥克赛普(altrakincept)(Immunex)和帕考珠单抗(GlaxoSmithKline))展现出部分缓解哮喘症状的作用，但在早期临床阶段被放弃。尽管预期针对IL-13的药物比针对IL-4的药物具有更有效的治疗效果，但安芦组单抗(Pfizer；Wyeth)在临床2期失败，曲罗芦单抗(AstraZeneca)在临床3期失败，并且来瑞组单抗(Roche,Dermira)正在进行2期的临床试验。由于这两种细胞因子的重叠作用，迄今已开发的用于抑制IL-4或IL-13的单一药物在临床实践中没有展现出很大的效果。

因此，已经提出抑制两种细胞因子(即IL-4和IL-13)的作用可能比单独靶向IL-4或IL-13更有益。特别地，细胞表面受体和受体复合物与IL-4和/或IL-13以不同的亲和力结合。IL-4与IL-4Rα以高亲和力(1nM)结合以与IL-13Rα1形成异二聚体，而IL-13与IL-13Rα1以高亲和力(30nM)结合以与IL-4Rα形成异二聚体，从而传递通过Stat6的细胞信号传导。因此，已经对靶向其受体的策略进行了研究。

在IL-4突变蛋白(匹曲白滞素；Aerovance，加利福尼亚州伯克利)的情况下，通过在与IL-13Rα的结合位点处引入突变即使在与IL-4Rα结合时也无法形成受体复合物，因此在临床2a期，由于对通过IL-4和IL-13的信号的抑制能力而显示出降低过敏原诱导的晚期哮喘反应的作用以及缓解哮喘患者在静息阶段的肺部炎症的作用。这进一步支持了IL-4Rα靶向的观点。然而，由于其半衰期短，PK(药代动力学)特征未达到预期。

另一种IL-4/IL-13抑制剂AMG317(Amgen)与IL-4Rα结合并抑制IL4和IL13的活性。然而，当AMG317被施用于对照(placebo)和严重特应性哮喘患者持续12周时，其显示出低有效性，并且其2期临床试验失败。

关于迄今开发的抗hIL-4Rα抗体，由Regeneron Pharmaceuticals Inc.开发(美国专利号7,605,237、韩国专利号10-1474227)且在2017年被FDA批准的度匹鲁单抗用于治疗过敏性疾病(例如，特应性湿疹疾病)。度匹鲁单抗是具有很高亲和力(pM水平的平衡解离常数(K

然而，除度匹鲁单抗以外的抗hIL-4Rα治疗性抗体尚未被批准，并且对治疗性药物的抗性(如抗药物抗体(ADA))可能在连续和重复施用相同治疗性药物后发生(Vaisman-Mentesh,A.等人,2019)。因此，对具有有效治疗效果的抗hIL-4Rα抗体的技术仍然有很高的需求。

另外，IL-4Rα可以诱导与受体结合的物质的内吞作用(受体介导的内吞作用)，这是由于其快速细胞内化以降解物质的特性。该特性为抗原介导的对抗体的快速清除提供了机会，所述抗体被施用于身体并与IL-4Rα结合(Fujimoto等人,2015)。当抗体的亲和力高时，尤其是当由于与抗原的低解离速率(dissociation rate)常数(离解速率(off-rate)常数)而在与受体结合后不发生脱离时，这种情况可以得到促进(M Ritchie等人,2013)。

在该技术背景下，基于开发能够抑制IL-4和IL-13信号二者的新型抗hIL-4Rα抗体的必要性，由于针对相同抗原的抗体的功效可能根据表位和亲和力而变化，并且由于在连续和重复施用相同的治疗剂时，可能会产生对其的抗性，因此本发明人开发了一种抗hIL-4Rα抗体，所述抗hIL-4Rα抗体具有对应于pM水平的高平衡解离常数(K

【发明内容】

【技术问题】

因此，鉴于上述问题已经做出本发明，并且本发明的一个目的是提供一种新型抗体或其抗原结合片段，所述新型抗体或其抗原结合片段对hIL-4Rα具有pM水平的亲和力(K

本发明的另一个目的是提供一种新型抗体或其抗原结合片段，所述新型抗体或其抗原结合片段具有不同于常规抗体的hIL-4Rα的表位。

本发明的另一个目的是提供一种新型抗体或其抗原结合片段，所述新型抗体或其抗原结合片段具有增加的对于hIL-4Rα的抗原解离速率(离解速率)。

本发明的另一个目的是提供一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述核酸的载体、一种用所述载体转化的细胞以及一种产生其的方法。

本发明的另一个目的是提供一种包含所述抗体或其抗原结合片段的缀合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗炎性疾病的含有所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于诊断炎性疾病的含有抗体或其抗原结合片段的组合物。

【技术解决方案】

根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种抗体或其抗原结合片段来完成，所述抗体或其抗原结合片段对于人白介素-4受体α(hIL-4Rα)具有如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的小于150pM的平衡解离常数(K

特别地，根据本发明的抗体与表位结合并与人白介素-4(hIL-4)和人白介素-13(hIL-13)竞争结合hIL-4Rα，所述表位包括由SEQ ID NO:98表示的人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的Leu67、Leu68、Asp92、Val93和Asp97的氨基酸残基。

根据本发明的抗体是与人白介素-4受体α(hIL-4Rα)结合的分离的抗体或其抗原结合片段，并且预期具有比先前开发的抗体更快的抗原解离速率(离解速率)，从而减少体内抗原介导的抗体清除。

根据本发明的另一方面，提供了一种编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

根据本发明的另一方面，提供了一种含有所述核酸的载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种用所述载体转化的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)培养所述细胞和(b)从所述细胞收集抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的另一方面，提供了一种缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自肽、蛋白质、小分子药物、核酸、纳米颗粒和脂质体的生物活性分子融合。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗炎性疾病的含有所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于诊断炎性疾病的含有所述抗体或其抗原结合片段的组合物。

【附图说明】

图1A是显示用于表达hIL-4Rα抗原蛋白的重组表达载体的示意图，其中Pcmv是启动子，并且H是聚6×组氨酸标记。

图1B显示了确认在HEK293F细胞中表达的hIL-4Rα抗原蛋白的SDS-PAGE的结果。

图2显示了证实抗hIL-4Rα抗体与hIL-4Rα抗原蛋白的结合亲和力和特异性结合的间接ELISA的结果。

图3A是显示通过HEK-蓝细胞的hIL-4依赖性STAT6磷酸化而得到的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的酶-底物反应和分泌机制的示意图。

图3B显示了抗hIL-4Rα抗体的使用HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的程度。

图4是显示基于4R34构建的用于改善抗hIL-4Rα抗体的亲和力的文库的构建策略的示意图，其中所述文库构建在重链可变区的CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR3中。

图5是显示用于选择基于4R34构建的用于改善抗hIL-4Rα抗体的亲和力的文库的策略的示意图。

图6显示了通过流式细胞术分析的关于在基于4R34构建的文库中获得对hIL-4Rα具有高亲和力的克隆的逐步选择过程的数据。

图7A是显示用于表达hIL-4-mFc配体蛋白的动物细胞表达载体的示意图。

图7B显示了确认在HEK293F细胞中表达的hIL-4-mFc配体蛋白的SDS-PAGE的结果。

图8显示了通过流式细胞术分析的关于在与hIL-4-mFc竞争条件下酵母表面表达的scFab克隆与hIL-4Rα结合的能力的数据，其证明酵母表面表达的scFab克隆与hIL-4结合类似的结合位点。

图9显示了具有改善的亲和力的抗hIL-4Rα抗体的使用HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的程度。

图10是显示用于构建基于4R34.1构建的用于改善抗hIL-4Rα抗体的亲和力的文库的策略的示意图，其中所述文库构建在重链可变区的CDR1和轻链可变区的CDR1中。

图11显示了所选择的抗hIL-4Rα抗体与hIL-4-mFc配体对hIL-4Rα的结合竞争ELISA的结果，其中根据抗体的浓度证实与hIL-4-mFc的结合竞争，这证明抗hIL-4Rα抗体所结合的区域与hIL-4结合位点重叠。

图12显示了抗hIL-4Rα抗体的使用HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的程度。

图13显示了抗hIL-13Rα抗体的使用HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的程度。

图14显示了在不同抗体浓度下通过流式细胞术分析的表达hIL-4Rα的THP-1细胞系和不表达hIL-4Rα的Molt-4细胞系中的抗hIL-4Rα抗体的hIL-4Rα特异性结合能力。

图15A是显示hIL-4和hIL-4Rα的结合结构(PDB ID：1IAR)以及对于结合重要的残基的详细视图，其中残基Glu33和Arg112是hIL-4中对于与hIL-4Rα结合发挥重要作用的残基，预期残基Tyr38、Ser95、Asp97和Tyr208是hIL-4Rα中对于与hIL-4结合发挥重要作用的残基，并且预期残基Leu67、Leu68、Asp92和Val93参与了与hIL-4的结合，并且是由Medimmune Limited开发的抗体的表位区。

图15B显示了关于构建、表达和通过将丙氨酸突变引入图10A中所示的每个hIL-4Rα残基中纯化的hIL-4Rα变体在非还原条件下12％SDS-PAGE的结果。

图15C显示了抗hIL-4Rα抗体和通过在图10A中纯化的hIL-4Rα变体的间接ELISA证实每种抗体的表位区的测试的结果，其中度匹鲁单抗类似物展现出比在Val93或Asp97残基处具有单个丙氨酸突变的hIL-4Rα变体更低的结合能力，并且不同的抗hIL-4Rα抗体展现出与hIL-4Rα变体不同的结合能力，这表明抗体的表位区在亲和成熟过程中发生了变化。

图16显示了抗hIL-4Rα抗体在正常受试者和患者来源的PHA激活的PBMC中抑制细胞生长的能力。

图17A显示了抗hIL-4Rα抗体抑制正常受试者和患者来源的幼稚T细胞分化为Th2细胞的能力的定量值。

图17B是代表性图像，其显示了证实抗hIL-4Rα抗体抑制正常受试者和患者来源的幼稚T细胞分化为Th2细胞的能力的测试的结果。

【具体实施方式】

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与由本发明所属领域中的技术人员所理解的含义相同。通常，本文所用的命名法是本领域中熟知的，并且是通常使用的。

在一方面，本发明涉及与人白介素-4受体α(hIL-4Rα)结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段具有如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的小于150pM的平衡解离常数(K

根据本发明的抗体是与抗原hIL-4Rα以高亲和力结合并且具有中和IL-4活性的能力的抗体。术语“亲和力”是指特异性识别抗原的特异性位点并与其结合的能力，并且抗体对抗原的特异性和高亲和力是免疫应答中的重要因素。

可以使用表面等离子体共振(SPR)(例如，BIAcore仪器)来确定平衡解离常数(K

在一个实施方案中，根据本发明的抗体与表位结合，并且可以与人白介素-13(hIL-13)和人白介素-4(hIL-4)竞争结合hIL-4Rα，所述表位包括SEQ ID NO:98的hIL-4Rα中的Leu67、Leu68、Asp92、Val93和Asp97的氨基酸残基。

如本文所用，术语“抗体”是指与hIL-4Rα特异性结合的抗hIL-4Rα抗体。本发明的范围不仅包括与hIL-4Rα特异性结合的完整抗体，还包括所述抗体分子的抗原结合片段。

所述完整抗体具有这样的结构，所述结构具有两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键与相应重链连接。所述重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(ε)型，并且分为以下亚类：伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。所述轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)类型。

所述抗体或抗体片段的抗原结合片段是指具有抗原结合功能的片段，并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。在这些抗体片段中，Fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定结构域(CH1)的结构，每个Fab具有一个抗原结合位点。“scFab”是由轻链和重链可变区、轻链恒定区、第一重链恒定区(CH1)和接头组成的多肽。在一些情况下，其可以通过插入半胱氨酸残基来稳定。Fab'与Fab的不同之处在于，它还包括在重链CH1结构域的C末端含有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab')2是由Fab'铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。

Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，并且单链Fv(scFv)是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通常通过共价键经由其间的肽接头连接，或在C末端直接连接，形成像双链Fv一样的二聚体状结构。此类抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，Fab可通过用木瓜蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得，并且F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得)，并且可使用基因重组技术来产生。

在一个实施方案中，本发明的抗体是Fv形式(例如，scFv)或完整抗体形式。另外，所述重链恒定区可选自伽马(γ)、缪(u)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)或伊普西隆(c)同种型。例如，所述恒定区可为γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。所述轻链恒定区可为κ或λ。

如本文所用，术语“重链”涵盖全长重链和其片段二者，所述全长重链包含：可变结构域(VH)，其含有氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。如本文所用，术语“轻链”涵盖全长轻链和其片段二者，所述全长轻链包含：可变结构域(VL)，其含有氨基酸序列，所述氨基酸序列的可变区序列足以赋予针对抗原的特异性；和恒定结构域(CL)。

本发明的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、scFv、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fv(sdFv)、抗个体基因型(抗Id)抗体、此类抗体的表位结合片段等。

术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的均一抗体(即构成群体的每个抗体)，不包括可能以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性并因此被单一抗原位点诱导。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

例如，可用于本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法来产生，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核或植物细胞中产生。另外，单克隆抗体可以从噬菌体抗体文库分离。

在本发明的一个实施方案中，可以构建文库以改善与hIL-4Rα特异性结合的抗体的CDR区的亲和力，并且可以通过包括以下的方法来实现：(1)在参与作为文库模板的4R34和4R34.1轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的抗原结合的六个互补结合位点(CDR)中选择具有与hIL-4Rα结合的高可能性的氨基酸位点；(2)设计简并密码子引物和能够编码包含在所述文库中的所选择的氨基酸位点处的氨基酸的加标寡核苷酸；以及(3)使用酵母表面表达系统以scFab或Fab的形式表达所设计的重链可变区文库。

在本发明的一个实施方案中，可以使用文库分离和/或筛选与hIL-4Rα特异性结合的抗体scFab以改善亲和力。

根据本发明的用于筛选与hIL-4Rα特异性结合的抗体的方法可以通过包括以下的方法来进行：

(1)使用酵母表面表达系统表达能够与hIL-4Rα结合的抗体scFab文库；

(2)构建并表达与His标记融合的IL-4Rα载体；

(3)将hIL-4Rα与所述文库结合，并选择即使在满足使结合的hIL-4Rα解离的条件后仍保持与hIL-4Rα结合的酵母(动力学筛选)；以及

(4)测量hIL-4Rα与所述文库之间结合的亲和力。

如上所述，根据本发明的抗hIL-4Rα抗体是与hIL-4Rα以高亲和力结合的抗体，所述抗体是通过以下方式获得的：从在酵母细胞表面表达的人抗体Fab文库选择针对hIL-4Rα的抗体，另外在酵母表面上构建抗体Fab文库以改善亲和力，以及通过动力学筛选来选择与hIL-4Rα以高亲和力结合的抗体。

用于从文库鉴定和分离高亲和力抗体的技术对于分离新型治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和力抗体可以取决于文库大小、细菌细胞中的生产效率和文库的多样性。文库的大小会因抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的不当折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。在抗体结合结构域或抗原结合结构域没有正确折叠时，可抑制在细菌细胞中的表达。可以通过使可变/恒定界面表面上的残基或所选CDR残基交替突变来改善表达。

在高亲和力抗体的分离中，重要的是生成抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的多个文库。发现CDR3区经常参与抗原结合。由于重链上的CDR3区根据大小、序列和结构维度形态显著变化，可使用其来制备多个文库。

还可通过在每一位置使用所有20种氨基酸随机化可变重链和轻链的CDR区来产生多样性。使用所有20种氨基酸得到多样性增加的抗体序列，并增加鉴定出新抗体的机会。

术语“表位”是指抗体能够特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由一组化学活性表面分子如氨基酸或糖侧链组成，并且通常不仅具有特定的三维结构特征，还具有特定的电荷特征。三维表位与非三维表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的键会断裂，而与后者的键不会断裂。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抗体可以与表位结合，所述表位包括选自SEQ ID NO:98的hIL-4Rα中的Leu67、Leu68、Asp92、Val93和Asp97的氨基酸残基。

根据本发明的实施方案，根据亲和成熟得到的4R34、4R34.1和4R34.1.9抗体将hIL-4Rα的Leu67、Leu68、Asp92、Val93和Asp97识别为重要表位，但是每个表位的贡献是不同的。特别地，与Asp92和Val93结合的能力往往高于4R34或4R34.1的结合能力，这表明结合能力仍由其他相邻残基维持。这表明抗体的表位在亲和成熟过程中发生了变化。与野生型相比，度匹鲁单抗类似物与hIL-4Rα氨基酸残基突变体结合的能力没有显著差异，但Val93和Asp97被认为涉及与抗体的弱结合。因此，证实了根据本发明的抗体具有不同于其他抗体(包括度匹鲁单抗类似物)的表位。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合抗体，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区(供体抗体)的残基替代。

术语“人抗体”意指源自人免疫球蛋白的分子，其中包括互补决定区和结构区的构成该抗体的所有氨基酸序列是由人免疫球蛋白组成。

一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时其他一条或多条链包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，该“嵌合”抗体与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及所述抗体的展现所需生物活性的片段中的相应序列相同或同源。

如本文所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链区域和重链区域，所述轻链区域和重链区域包含互补决定区(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。

术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。

在本发明中，与hIL-4Rα结合的抗体或其抗原结合片段可以包含SEQ ID NO:11至13或84的重链CDR1、选自SEQ ID NO:14至22、73至76和85的重链CDR2和选自SEQ ID NO:23至32的重链CDR3；以及

选自SEQ ID NO:43至52和92至97的轻链CDR1、选自SEQ ID NO:53至60的轻链CDR2和选自SEQ ID NO:61至68、81和82的轻链CDR3。

特别地，所述抗体或其抗原结合片段可以包含如下表1和表2所示的重链和轻链CDR序列。

[表1]

[表2]

术语“框架区”(FR)是指除了CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，被鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。

与hIL-4Rα结合的抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1至10、69至72和83的序列。

另外，与hIL-4Rα的胞外结构域结合的抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:33至42、77至80和86至91的序列。

特别地，所述抗体或其抗原结合片段可以包含如下表3和表4所示的重链和轻链可变区序列。

[表3]

[表4]

本发明的抗体或抗体片段可以包含本文所述的抗hIL-4Rα抗体以及其生物学等同物的序列，只要其可以特异性地识别hIL-4Rα即可。例如，可以对抗体的氨基酸序列做出另外的改变以进一步改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。

在考虑具有生物学等效活性的变异时，根据本发明的抗体或其编码核苷酸分子解释为包含与序列号中所示序列具有实质同一性的序列。术语“基本同一性”意味着，在将本发明序列与任何另一个序列比对以尽可能接近地与其对应并使用本领域中常用的算法分析所比对序列时，序列具有至少90％的同源性，更优选地至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的同源性。用于序列比较的比对方法是本领域中熟知的。NCBI基础局部比对搜索工具(BLAST)可以通过NCBI等获得，并且可以与互联网上的序列分析程序如BLASTP、BLASM、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX联合使用。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。使用此程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html找到。

基于此，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性。这种同源性可以通过使用本领域中已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，根据本发明的核酸或蛋白质的序列同一性百分比可以使用序列比较算法(即，BLAST或BLAST 2.0)、人工比对或目测检查来确定。

在本发明的另一方面中，提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

通过分离编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸，可以经由重组产生抗体或其抗原结合片段。将核酸分离并插入可复制载体中，接着进行进一步克隆(DNA扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面，本发明涉及一种包含所述核酸的载体。

术语“核酸”旨在涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子二者，并且作为核酸的基本组成单元的核苷酸包括天然来源的核苷酸以及其中糖或碱基部分被修饰的类似物。编码本发明的重链可变区和轻链可变区的核酸的序列可以变化。这种变异包括核苷酸的添加、缺失或非保守或保守取代。

编码抗体的DNA可以使用常规程序(例如，使用能够与编码抗体重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。可获得多种载体。载体组分通常包含但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括质粒载体；粘粒载体；和病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码抗体的多核苷酸与启动子可操作地连接。

术语“可操作地连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子结合位点的阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，并且使调节序列能够调节另一核酸序列的转录和/或翻译。

在使用原核细胞为宿主时，其通常包括能够进行转录的有效启动子(如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、用于起始翻译的核糖体结合位点、和转录/翻译终止序列。另外，例如，在使用真核细胞为宿主时，其包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌酸启动子)、或源自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、埃伯斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

任选地，所述载体可以与另一种序列融合，以便纯化由其表达的抗体。要与其融合的序列包括例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6x His(六组氨酸；Qiagen，美国)等。

所述载体包含本领域中一般用作选择性标记物的抗生素抗性基因，并且其例子包含赋予对以下项的抗性的基因：氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。

在另一方面中，本发明涉及经上文所提到的载体转化的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞可为原核生物、酵母或高等真核细胞，但不限于此。

可以使用原核宿主细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus))。

对动物细胞的关注最多，并且有用宿主细胞系的例子包括但不限于：COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S和HT1080。

在另一方面，本发明涉及一种产生所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)培养细胞；和(b)从所述培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。

可以在各种培养基中培养细胞。可无限制地使用任何市售培养基作为培养基。可以适当浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必需补充物。培养条件如温度和pH是如下那些，其常规地用于所选择用于表达的对本领域技术人员将明显的宿主细胞。

对抗体或其抗原结合片段的回收可以例如通过以下方式进行：离心或超滤以去除杂质，并且使用例如亲和色谱进一步纯化所得产物。可以使用其他纯化技术，诸如阴离子或阳离子交换色谱、疏水作用色谱、和羟磷灰石(HA)色谱。

在另一方面，本发明涉及一种抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自肽、蛋白质、小分子药物、核酸、纳米颗粒和脂质体的生物活性分子融合。

所述蛋白质包括抗体、抗体片段、免疫球蛋白、肽、酶、生长因子、细胞因子、转录因子、毒素、抗原肽、激素、转运蛋白、运动功能蛋白、受体、信号传导蛋白、储存蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内部蛋白、外部蛋白、分泌型蛋白、病毒蛋白质、糖蛋白质、截短的蛋白质、蛋白质复合物、化学修饰的蛋白质等。

术语“小分子药物”是指具有小于约1,000道尔顿的分子量并且具有作为疾病的治疗剂的活性的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物，其在本文中被广泛使用。本文使用的小分子药物包括寡肽和分子量小于约1,000道尔顿的其他生物分子。

如本文所用，术语“纳米颗粒”是指这样的颗粒，其包括直径为1至1,000nm的材料，并且所述纳米颗粒可以是金属/金属核-壳复合物(包含金属纳米颗粒、金属纳米颗粒核和包含所述核的金属壳)、金属/非金属核-壳复合物(包含金属纳米颗粒核和围绕所述核的非金属壳)、或非金属/金属核-壳复合物(包含非金属纳米颗粒核和围绕所述核的金属壳)。根据一个实施方案，所述金属可以选自金、银、铜、铝、镍、钯、铂、磁性铁及其氧化物，但不限于此，并且所述非金属可以选自二氧化硅、聚苯乙烯、胶乳和丙烯酸物质，但不限于此。

脂质体由围绕可以自我缔合的水性内部隔室的一个或多个脂质双层膜组成。脂质体可以基于其膜的类型和大小来指定。小单层囊泡(SUV)具有单个膜，并且可以具有20nm至50nm的直径。大单层囊泡(LUV)可以具有50nm或更大的直径。少层大囊泡和多层大囊泡具有多个通常同心的膜层，并且直径可以是100nm或更大。具有多个非同心膜(即若干个小囊泡包含在较大囊泡内)的脂质体被称为“多泡囊泡”。

如本文所用，术语“融合”是指具有不同或相同功能或结构的两个分子的整合，并且包括通过能够将抗体或其抗原结合片段与所述蛋白质、小分子药物、纳米颗粒或脂质体结合的任何物理、化学或生物学方法的融合。所述融合可以优选地使用接头肽进行，并且所述接头肽可以在根据本发明的抗体轻链可变区、抗体或其片段的不同位置处介导与所述生物活性分子的融合。

在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物含有所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物作为活性成分。

可以使用根据本发明的抗体治疗的炎性疾病的例子可以包括过敏性疾病，如特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎和食物过敏反应，但不限于此。

除过敏性疾病(如特应性皮炎、哮喘、过敏性鼻炎或食物过敏反应)外，可使用本发明抗体治疗的疾病包括关节炎(包括化脓性关节炎)、疱疹、慢性特发性荨麻疹、硬皮病、肥厚性瘢痕、惠普耳氏病、良性前列腺增生、肺障碍(如轻度、中度或重度哮喘)、炎性障碍(如炎性肠病)、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯病、先兆子痫、舍格伦综合征、自身免疫性淋巴细胞增殖综合征、自身免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自身免疫性葡萄膜炎、结核病或肾病，但不限于此。

在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含：(a)药学有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向患者施用根据本发明的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的抗体通过消除、抑制或降低hIL-4活性可用于预防或治疗hIL-4介导的疾病。根据本发明的抗体可以通过抑制与hIL-4Rα结合并诱导Th2免疫应答的hIL-4和hIL-13的信号来抑制T细胞的生长和Th2细胞的分化。

如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物而导致抑制炎性疾病的发展或延迟炎性疾病的进展的任何作用。术语“治疗”意指抑制炎性疾病的进展或减轻或消除炎性疾病。本发明的抗体可以在体外和体内均用于涉及hIL-4Rα表达细胞的应用。

本发明的药物组合物包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段或缀合物，并且除了用于施用本发明的药物组合物的组分之外，所述药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。如本文所用术语“药学上可接受的载体”是指不损害所施用化合物的生物活性或特性并且不刺激生物体的载体或稀释剂。配制为液体溶液的用于组合物的药学上可接受的载体已被灭菌并且是生物相容的并且所述载体的例子包括盐水、无菌水、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油及其一种或多种的混合物。如果需要，可添加其他常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以配制可注射溶液(如水性溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。

根据本发明的药物组合物可以是多种口服或肠胃外配制品中的任一种。就此而言，所述药物组合物可以使用普通稀释剂或赋形剂(如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来配制。用于口服施用的固体配制品可以包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等。这种固体配制品是通过将至少一种化合物与至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)混合来制备。除了简单的赋形剂，还可以使用润滑剂，如硬脂酸镁或滑石。用于口服施用的液体配制品可以包括悬浮液、内服溶液、乳液、糖浆等。除了简单稀释剂(如水或液体石蜡等)以外，还可以将各种赋形剂(如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂)掺入液体配制品中。另外，用于肠胃外施用的配制品包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳液、冻干物、栓剂等。有用的非水性溶剂和悬浮液包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、和可注射酯(如油酸乙酯)。栓剂的基础成分包括Witepsol、聚乙二醇(macrogol)、Tween 61、可可脂、月桂脂(laurin butter)和甘油明胶。

使用根据本发明的抗体或其抗原结合片段或缀合物治疗炎性疾病的方法包括向受试者施用药学有效量的所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物。对于本领域技术人员来说明显的是，可以基于医学专家的判断来确定适当的总日剂量。另外，将所述抗体、其抗原结合片段或所述缀合物可以以单一剂量施用或者可以被分为多个剂量。然而，考虑到本发明的目标，用于特定患者的具体治疗有效量优选地根据多种因素来确定，所述因素包括要实现的反应的类型和程度，以及所用其他药剂的存在，具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，治疗期，和与特定组合物联合或同时使用的药物，以及制药领域熟知的其他类似因素。

向其施用本发明的组合物的受试者包括哺乳动物，包括人，但不限于此。

如本文所用，术语“施用”是指通过任何适当方法向患者提供根据本发明的药物组合物的动作，并且根据本发明的组合物可以通过使得能将组合物递送到靶组织的各种途径中的任何一种来口服或肠胃外施用。

根据本发明的抗体或其抗原结合片段可以作为单一试剂使用或与常规治疗剂组合使用。

在另一方面，本发明涉及用于诊断炎性疾病的组合物，所述组合物包含抗体或其抗原结合片段。此外，在另一方面，本发明涉及一种用于诊断炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒含有所述诊断组合物。

如本文所用，术语“诊断”意指确定病理生理学的存在或特征。在本发明中，诊断用于确定炎性疾病的发作或进展。

对于使用根据本发明的抗体或其抗原结合片段的诊断方法，所述药物可以包含可检测的标记，所述标记用于在体外或体内检测hIL-4Rα抗原表达细胞的存在。可在体内检测到的放射性同位素(如可以使用闪烁、磁共振成像或超声波检测到的标记)可以用于临床诊断应用。有用的闪烁标记包括正电子发射体和γ-发射体。作为磁源成像的代表性造影剂包括顺磁性或超顺磁性离子(例如，铁、铜、锰、铬、铒、铕、镝、钬和钆)、氧化铁颗粒和水溶性造影剂。对于超声检测，气体或液体可以被困于作为微泡造影剂释放的多孔无机颗粒中。可用于体外检测的可检测标记包括荧光团、可检测表位或粘合剂、和放射性标记。

用于诊断炎性疾病的试剂盒还可以包含具有适合于分析方法的一种或多种其他组分的组合物、溶液或装置。

在一个实施方案中，所述试剂盒可以包含瓶子、小瓶、袋子、针或注射器。所述容器可以由多种材料(如玻璃、塑料或金属)制成。所述容器上的标记可以提供使用说明。所述试剂盒还可以包含从商业和使用角度所需的其他材料如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

实施例

在下文中，将参考实施例更加详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：重组人白介素-4受体α(hIL-4Rα)的表达

制备了用于衍生对于人白介素-4受体α(hIL-4Rα)具有特异性的抗体的抗原蛋白。由于hIL-4Rα是糖蛋白，因此使用了动物细胞表达系统。使用限制酶NheI/BamHI将全长cDNA(Met26-Ser232)克隆至动物表达载体(pSecTag2A)中，并构建pSecTag2A-hIL-4Rα，使得6X组氨酸标记的蛋白质与C末端融合(图1A)。将抗原蛋白瞬时转染至HEK293F(Invitrogen)细胞中以进行表达和纯化。将其100mL转染在摇瓶(corning)中后，将HEK293F细胞以1.0X 10

使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将洗脱的蛋白质与储存缓冲液(PBS，pH 7.4)交换，然后使用Vivaspin 30,000MWCO(Sartorius)离心浓缩器浓缩。测量纯化的蛋白质在562nm波长处的吸光度，并根据绘制的标准曲线使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo)中的溶液对其量进行定量。

为了确认hIL-4Rα的去糖基化状态，参照标准方案使纯化的hIL-4Rα蛋白和PNG酶F(NEB)酶进行反应。

特别地，将2μl的GlycoBuffer 2(10X)添加至10μg的hIL-4Rα蛋白中，并用去离子水将最终体积调节至20μl。将5μl的PNG酶F酶添加至该混合物中，接着在37℃下孵育24小时。通过SDS-PAGE分析检测12.5μl的混合物和5μg的纯化的hIL-4Rα蛋白的纯度(图1B)。在纯化的蛋白质中，在分子量大于预期分子量(26kDa)的情况下观察到轻微移位的条带。与PNG酶F一起处理后，在26kDa处观察到条带，在36kDa处观察到对应于PNG酶F的条带。这表明移位的条带是由于不同的糖基化模式所致。

实施例2：酵母表面表达文库中单克隆抗体的选择

对表达人抗体Fab(Baek,DS和YS Kim(2014).J.Microbiol.Biotechnol.24(3):408-420)的酵母Fab文库进行筛选，以筛选出表达与<实施例1>中制备的hIL-4Rα抗原蛋白特异性结合的Fab的酵母克隆。

从酵母Fab文库选择与hIL-4Rα抗原蛋白特异性结合的克隆的方法如下。首先，使用试剂盒(EZ-LINKTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒，Pierce Inc.)将hIL-4Rα抗原蛋白与生物素缀合。表达Fab的酵母文库的表达水平可以通过Alexa 488缀合的抗IgG抗体(山羊Alexa 488缀合的抗Fc抗体，Thermo)来检测，并且其抗原结合能力可以使用PE缀合的链霉亲和素(链霉亲和素-R-藻红蛋白缀合(SA-PE)，Thermo)来检测。使用FACS过程选择表达大量Fab且具有与生物素化hIL-4Rα结合的高能力的克隆，同时将文库的浓度降低至生物素化hIL-4Rα，并重复分析衍生池的过程。此过程重复4次。

最后，从表达与hIL-4Rα特异性结合的每个单独克隆的酵母细胞获得DNA，并进行序列分析以选择10种类型的抗体，其中鉴定出特定的核苷酸序列和氨基酸序列。

分别地，表5和表7显示了10个单独克隆的重链CDR序列和重链可变区序列，这些单独克隆具有与所选择的hIL-4Rα结合的能力，并且表6和表8显示了轻链CDR序列和轻链可变区序列。

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

实施例3：IgG转化和所选择的抗hIL-4Rα抗体的鉴定

将所选择的呈Fab和度匹鲁单抗形式的10种抗体转化成作为常用抗体的IgG1形式。将所选择的抗体Fab和度匹鲁单抗的可变区(VH、VL)引入编码IgG1的轻链(CH1、CH2、CH3)和重链(CL)的pcDNA3.4载体中。具有IgG1恒定区的度匹鲁单抗被称为“度匹鲁单抗类似物”。将各个抗体的轻链和重链以1:1的比率共转化至HEK293F细胞中，使得轻链和重链在细胞中一起表达。将根据瞬时转染方法收集的细胞孵育上清液施加至蛋白A琼脂糖柱上，并用PBS(12mM磷酸盐、137mM NaCl、2.7mM KCl(pH 7.4))洗涤。使用0.1M甘氨酸和0.5M NaCl缓冲液在pH 3.0下洗脱抗体，并且使用1m Tris缓冲液立即中和样品。

使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液与储存缓冲液(PBS，pH 7.4)交换，然后使用Vivaspin 30,000MWCO(Sartorius)作为离心浓缩器浓缩洗脱的蛋白质。测量纯化的蛋白质在562nm波长处的吸光度，并根据绘制的标准曲线使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo)中的溶液对其量进行定量。

实施例4：选择的抗hIL-4Rα抗体的结合能力的验证

使用间接ELISA确定抗体对抗原的抗原结合能力(亲和力)和特异性。为了检测上述<实施例1>中制备的hIL-4Rα抗原蛋白的特异性，将GST(谷胱甘肽S-转移酶)蛋白在室温下以50ng/孔固定在96孔板中持续1小时，并在室温下用含有4％脱脂牛奶的0.1％PBST(0.1％Tween20(pH 7.4)、137mM NaCl、10mM磷酸盐、2.7mM KCl)封闭1小时。将溶液丢弃，并将残余物用0.1％PBST洗涤三次，然后在50至500nM的范围内连续稀释，将每种抗体以25μl添加至封闭板中的每个孔中，并使反应在室温下进行1小时。将溶液丢弃，并将残余物用0.1％PBST洗涤3次，然后将25μl的抗人IgG-HRP抗体(1:8000)作为二抗添加至每个孔中，接着在室温下反应1小时。将溶液丢弃，将残余物用PBST洗涤3次，并将25μl的TMB溶液添加至每个孔中，接着在室温下显色1分钟。用H

如从图2的结果可以看出，10种抗体对hIL-4Rα具有结合特异性，并对其具有广泛的亲和力。

实施例5：所选择的抗hIL-4Rα抗体对通过IL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制的评价

可以通过比色分析经由监测通过IL-4或IL-13的细胞信号传导的激活来比较HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞(Invivogen)的生物活性。这些细胞源自通过转染人STAT6基因以向充分表达hIL-4和hIL-13受体的HEK293细胞提供完全激活的STAT6途径而获得的稳定细胞系。另外，用STAT6诱导型分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因转染这些细胞。当hIL-4或hIL-13与HEK-蓝-IL-4/IL-13细胞的表面表达的hIL-4受体或hIL-13受体结合时，它们激活Tyk2和JAK1并募集和磷酸化STAT6。活性磷酸化STAT6形成二聚体，移动到细胞核，与反应性基因的启动子结合并诱导SEAP的分泌。分泌的SEAP导致粉红色的底物，QUANTI-Blue变成紫色(图3A)。显色的程度与存在的hIL-4和hIL-13的量呈正相关，并且hIL-4和IL-13的含量可以参照标准进行定量。因此，这些细胞能够容易地筛选抗IL-4/hIL-4Rα抗体或抗IL-13/IL-13Rα1抗体是否阻断hIL-4或hIL-13信号传导途径。

图3B显示了HEK-蓝IL-4/13细胞的SEAP分泌结果，从而证实了与度匹鲁单抗类似物的hIL-4信号阻断作用相比，构建的抗hIL-4Rα抗体的hIL-4信号阻断作用。

特别地，在96孔板中的培养基(补充有4.5g/L葡萄糖(Gibco/Invitrogen)、10％热灭活FBS(Gibco/Invitrogen)、10μg/mL杀稻瘟菌素S、激活的肽基核苷抗生素(Invitrogen)、100μg/mL博莱霉素(商品名)和链霉菌素的DMEM)中，以100μl的量以2.5×10

分析结果表明，所有抗体展现出比度匹鲁单抗类似物更低的hIL-4信号阻断作用，并且其中4R25和4R34展现出高hIL-4信号阻断作用(图3B)。

实施例6：所选择的抗hIL-4Rα抗体的结合能力的分析

为了更定量地分析4R25和4R34与hIL-4Rα的结合能力，使用Biacore2000仪器进行SPR(表面等离子体共振)。

特别地，将hIL-4Rα(Sino Biological)在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至50μl/ml的浓度，并固定至CM5传感器芯片(GE Healthcare)上的约500个反应单元(RU)。然后，以30μl/min的流速分析HBS-EP缓冲液(10mM Hepes、3mM乙二胺四乙酸和0.005％表面活性剂P20(pH 7.4)，GE Healthcare)，并以1nM至80nM的浓度分析4R25和4R34抗体。在结合和解离分析之后，通过用缓冲溶液(10mM甘氨酸，pH 2.0)以30μl/min的流速冲洗CM5芯片90秒来进行CM5芯片的再生。将通过结合90秒且解离900秒获得的传感图归一化，并从中减去空白细胞的值以计算亲和力。

表9显示了使用SPR(BIACORE 2000)分析抗hIL-4Rα抗体对hIL-4Rα的亲和力的结果。4R25和4R34分别展现出1.21nM和141pM的高亲和力，但是这种亲和力的增加被认为是由于因抗原固定而改善亲合力作用导致的。以这种方式，亲和力可能根据抗原固定的水平而变化。

[表9]

实施例7：用于增加基于4r34的亲和力的酵母细胞表面表达文库的构建

在上述<实施例5>中，4R34抗体在亲和力和抑制通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的能力方面优于4R25。因此，本发明人旨在增加抗hIL-4Rα抗体对hIL-4Rα的亲和力，以增加抗hIL-4Rα抗体的生物学功效。

首先，为了在酵母表面表达单链Fab(scFab)，在用NheI/ApaI限制酶处理的pYDS-H载体(Baek和Kim 2014)中以scFab的形式构建4R34抗体，以克隆pYDS 4R34 scFab载体和pYDS假载体，其中由于开放阅读框(ORF)因一个另外引入的核苷酸而移位，因此产生了终止密码子。通过使用pYDS假载体，即使混合了未经限制酶处理的载体，也只有含有所需文库基因的载体才能在酵母表面表达scFab。

关于文库，在基于pYDS 4R34 scFab载体的六个CDR中，随机突变被引入VH-CDR2、VH-CDR3和VL-CDR3区中，预测它们在抗原结合中发挥重要作用(图4)。

特别地，在10种抗体序列之间进行比较后，将突变引入具有低保守率的VH-CDR2(50、52-57)、VH-CDR3(95-98)和VL-CDR3(89、90、93、95A)中。由于在许多区域中同时引入了突变，因此使用了加标寡聚物来防止与hIL-4Rα的结合能力的损失。这是这样的突变方法，其可以应用于所有氨基酸，同时以50％概率保存常规野生型4R34序列。这是这样的技术，其通过设计引物来确保在PCR过程中50％的野生型氨基酸，同时保持79％的野生型核苷酸和编码氨基酸的三个核苷酸中7％的剩余核苷酸。

进行重叠PCR以制备用NheI/ApaI限制酶处理的12μg文库基因和4μg pYDS假载体。尽管未经限制酶处理的pYDS假载体仍然存在且因此被转化至酵母菌株中，但通过终止密码子而不会在酵母表面表达。将这两个基因混合并通过电穿孔转化至酵母EBY100(MATa，Trp-)菌株中以用于酵母表面表达，并通过同源重组进行构建。该过程重复10次，然后进行连续稀释，然后通过测量在SD-CAA+Trp选择培养基(20g/L葡萄糖、6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源、5.4g/L Na

实施例8：酵母scFab文库关于hIL-4Rα抗原蛋白的动力学筛选

为了选择与hIL-4Rα结合的单独克隆，通过作为竞争蛋白的在20倍更高的浓度下的生物素化hIL-4Rα(生物素化hIL-4Rα)与非生物素缀合的hIL-4Rα之间的竞争，选择具有更高亲和力的克隆。图5是显示在<实施例7>中构建的基于4R34的酵母scFab文库中选择对hIL-4Rα具有高亲和力的克隆的策略的示意图。

特别地，将1ml的100nM生物素化hIL-4Rα与酵母细胞中表达的scFab(1×10

在二级FACS中，将1ml的10nM生物素化hIL-4Rα与2×10

通过上述选择方法从酵母细胞表面分离对hIL-4Rα具有高结合能力的四个单独克隆(4R34.1、4R34.2、4R34.19、4R34.29)。

另外，确定抗hIL-4RαscFab是否与酵母表面上的生物素化hIL-4Rα竞争结合hIL-4。为了这一目的，将全长hIL-4cDNA(His25-Ser153)克隆至NotI/ApaI中以构建用于表达hIL-4-mFc蛋白的载体，其中将编码hIL-4分泌信号肽的DNA与作为含有鼠重链恒定区(铰链-CH2-CH3，mFc)的动物表达载体的pcDNA3.4的5'端融合(图7A)。

使用瞬时转染表达和纯化蛋白质。在摇瓶中，将在无血清FreeStyle 293表达培养基中悬浮生长的HEK293F细胞用质粒和聚乙烯亚胺(PEI)的混合物转染。在将100mL转染至摇瓶中后，将HEK293F细胞以1.0×10

特别地，将1nM生物素化hIL-4Rα或20nM与生物素化hIL-4Rα融合的hIL-4-mFc蛋白与scFab酵母在室温下结合30分钟。然后，将SA-PE与其在4℃下结合15分钟，并通过流式细胞术分析与生物素化hIL-4Rα的结合程度(图8)。

表10和表11显示了对所选择的hIL-4Rα具有高结合能力的四种单独克隆的重链可变区序列和CDR序列，并且表12和表13显示了轻链可变区序列和CDR序列。

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

实施例9：基于4R34具有改善的亲和力的抗体的结合能力的分析以及其对通过IL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制

将选择的克隆(4R34.1、4R34.2、4R34.19、4R34.29)各自插入具有轻链和重链的pcDNA3.4载体中。将这两个载体以1:1的比率同时瞬时转染至表达HEK293F蛋白的细胞中，使得轻链和重链在细胞中一起表达。

为了定量分析其与hIL-4Rα的结合能力，使用Biacore2000仪器进行SPR(表面等离子体共振)。

特别地，将hIL-4Rα(Sino Biological)在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至50μl/ml的浓度，并固定至CM5传感器芯片(GE Healthcare)上的约80个反应单元(RU)。然后，以30μl/min的流速分析HBS-EP缓冲液(10mM Hepes、3mM乙二胺四乙酸和0.005％表面活性剂P20(pH 7.4)，GE Healthcare)，并以1nM至80nM的浓度分析4R25和4R34抗体。在结合和解离分析之后，通过用缓冲溶液(10mM甘氨酸，pH 2.0)以30μl/min的流速冲洗CM5芯片90秒来进行CM5芯片的再生。将通过结合90秒且解离900秒获得的传感图归一化，并从中减去空白细胞的值以计算亲和力。

表14显示了使用SPR(BIACORE 2000)分析抗hIL-4Rα抗体(4R34.1、4R34.2、4R34.19、4R34.29)对hIL-4Rα的亲和力的结果。4R34展现出比以前低3.8nM的亲和力，但这被认为是由于与其他hIL-4α固定的差异。在所选择的克隆中，4R34.1展现出18.2pM的最高亲和力，并且4R34.2、4R34.19和4R34.29也展现出131pM至313pM的高亲和力。

[表14]

使用具有增加的亲和力的克隆(4R34.1、4R34.2、4R34.19、4R34.29)并使用用作文库模板的4R34作为对照组，以与<实施例5>中相同的方式评价对通过HIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制。

特别地，在96孔板的每个孔中的培养基(补充有4.5g/L葡萄糖(Gibco/Invitrogen)、10％热灭活FBS(Gibco/Invitrogen)、10μg/mL杀稻瘟菌素S、激活的肽基核苷抗生素(Invitrogen)、100μg/mL博莱霉素(商品名)和链霉菌素的DMEM)中，以100μl的量以2.5×10

分析结果表明，所有具有改善的亲和力的抗hIL-4Rα抗体展现出比用作模板的4R34更高的hIL-4信号阻断作用，并且其中4R34.1抗体展现出最高的hIL-4信号阻断作用(图9)。

实施例10：对于基于4R34.1抗体的另外的亲和力改善构建并选择高多样性抗体文库

因为确定的是抑制通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的能力可以通过改善亲和力而增加，所以通过修饰(改善)VH-CDR1以及在实施例7中未使用的VH-CDR1来增加亲和力以及对通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制。

特别地，类似于实施例7，使用变性密码子(NNK)将突变引入VH-CDR1(31-35)和VH-CDR1(27-32)中，其中可以排列所有20个氨基酸，并且使用pYDS 4R34.1载体作为模板(图10)。

进行重叠PCR以制备用NheI/ApaI限制酶处理的12μg文库基因和4μg pYDS假载体。将这两个基因混合并通过电穿孔转化至EBY100(MATa，Trp-)酵母菌株中以用于酵母表面表达，并通过同源重组进行构建。该过程重复10次，进行连续稀释，然后通过测量在SD-CAA+Trp选择培养基(20g/L葡萄糖、6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源、5.4g/L Na

在一级FACS中，使1ml的1μM生物素化hIL-4Rα与1×10

在最终的四级FACS之后，根据PE信号对与hIL-4Rα具有高结合能力的单独克隆进行分类，并选择称为“4R34.1.11”、“4R34.1.13”、“4R34.1.17”、“4R34.1.18”、“4R34.1.19”和“4R34.1.21”的克隆。

在上述实施例3中，将六种克隆转化为IgG并鉴定。表15和表16显示了对hIL-4Rα具有高结合能力的所选择的六种单独克隆的重链可变区序列和CDR序列，并且表17和表18显示了轻链可变区序列和CDR序列。

[表15]

[表16]

[表17]

[表18]

实施例11：对于抗体选择的生化/生物学评价

<抗体与人hIL-4对hIL-4Rα的竞争结合的评价>

进行结合竞争ELISA以确定抗hIL-4Rα抗体是否与hIL-4竞争hIL-4Rα结合位点，作为选择具有高生物学功效的抗hIL-4Rα抗体的标准。

特别地，将在实施例1中纯化的hIL-4Rα蛋白在室温下以50ng/孔的浓度在96孔板中固定1小时，并在室温下用含有4％BSA(牛血清白蛋白)的0.1％PBST封闭1小时。将溶液丢弃，将残余物用0.1％PBST洗涤3次，并制备hIL-4-mFc[27nM]和不同浓度[20nM、100nM、500nM]下的抗hIL-4Rα抗体的混合物，以25μl的量添加至封闭板的每个孔中，并使其在室温下反应1小时。将该溶液丢弃，将残余物用0.1％PBST洗涤3次，并将作为二抗的抗小鼠IgG-HRP抗体(1:4000)以25μl的量添加至每个孔中，并使其在室温下反应1小时。将该溶液丢弃，将残余物用PBST洗涤3次，并将TMB溶液以25μl的量添加至每个孔中，接着在室温下显色1分钟30秒。用H

<亲和力评价>

表19显示了使用SPR分析抗体对hIL-4Rα的亲和力的结果。

[表19]

特别地，将hIL-4Rα(Sino Biological)在10mM NaAc缓冲液(pH 4.0)中稀释至50μl/ml的浓度，并固定至CM5传感器芯片(GE Healthcare)上的约200个反应单元(RU)。然后，在HBS-EP缓冲液(10mM Hepes、3mM乙二胺四乙酸和0.005％表面活性剂P20(pH 7.4)，GEHealthcare)中以30μl/min的流速进行分析，并且将4R34.1、4R34.1.11、4R34.1.13、4R34.1.17、4R34.1.18、4R34.1.19、4R34.1.21和度匹鲁单抗类似物抗体在1nM至80nM的浓度下进行分析。在结合和解离分析之后，通过用缓冲溶液(10mM甘氨酸，pH 2.0)以30μl/min的流速冲洗CM5芯片90秒来进行CM5芯片的再生。将通过结合90秒且解离360秒获得的传感图归一化，并从中减去空白细胞的值以计算亲和力。

发现新得到的抗体对hIL-4Rα的亲和力与4R34.1的亲和力没有太大差异。

<对通过hIL-4依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制的评价>

使用4R34.1作为对照组(用作关于4R34.1.11、4R34.1.13、4R34.1.17、4R34.1.18、4R34.1.19和4R34.1.21抗体的文库模板)，以与实施例5中相同的方式通过测量HEK-蓝IL-4/13细胞的SEAP分泌来检测抗hIL-4Rα抗体的hIL-4信号阻断作用。

特别地，在96孔板的每个孔中的培养基(补充有4.5g/L葡萄糖(Gibco/Invitrogen)、10％热灭活FBS(Gibco/Invitrogen)、10μg/mL杀稻瘟菌素S、激活的肽基核苷抗生素(Invitrogen)、100μg/mL博莱霉素(商品名)和链霉菌素的DMEM)中，以100μl的量以2.5×10

分析的结果表明，所有具有增加的亲和力的抗hIL-4Rα抗体比在20至100nM浓度下用作模板的4R34.1抗体具有更高的hIL-4信号阻断作用，并且其中4R34.1.17和4R34.1.19抗体展现出最高的hIL-4信号阻断作用(图12)。

<对通过hIL-13依赖性STAT6磷酸化所得的SEAP活性的抑制的评价>

使用4R34.1作为对照组(用作关于4R34.1.17和4R34.1.19抗体的文库模板，其具有中和hIL-4的高能力)，通过测量HEK-蓝IL-4/13细胞的SEAP分泌来检测抗hIL-4Rα抗体的hIL-13信号阻断作用。

特别地，在96孔板的每个孔中的培养基(补充有4.5g/L葡萄糖(Gibco/Invitrogen)、10％热灭活FBS(Gibco/Invitrogen)、10μg/mL杀稻瘟菌素S、激活的肽基核苷抗生素(Invitrogen)、100μg/mL博莱霉素(商品名)和链霉菌素的DMEM)中，以100μl的量以2.5×10

分析结果表明，具有增加的亲和力的抗hIL-4Rα抗体比度匹鲁单抗类似物具有更高的阻断1nM hIL-13信号的作用(图13)。

由于hIL-13在哮喘患者的血清中以78.5+/-64.5pg/ml的极低量存在，因此可以预期将其施用于哮喘患者将具有与度匹鲁单抗类似的作用。

实施例12：用于最终抗体选择的hIL-4Rα特异性结合能力的验证

为了检测对hIL-4Rα的特异性，使用表达hIL-4Rα的THP-1细胞系(hIL-4Rα阳性)和不表达hIL-4Rα的Molt-4细胞系(hIL-4Rα阴性)，通过FACS检测hIL-4Rα抗体的hIL-4Rα特异性结合。

特别地，将2×10

分析结果表明，与对照4R34.1抗体相比，4R34.1.17和4R34.1.19抗体展现出与THP-1中的hIL-4Rα改善的结合能力(图14)。然而，4R34.1.17抗体也与不表达hIL-4Rα的Molt-4细胞系结合，因此其对hIL-4Rα没有特异性(图14)。因此，证实与4R34.1的hIL-4Rα特异性结合能力相比，4R34.1.19抗体具有改善的hIL-4Rα特异性结合能力，从而阻断IL-4信号传导。

实施例13：4R34.1.19抗体的表位定位

[表20]SEQ ID NO:98

hIL-4与hIL-4Rα的结合结构显示在PDB(蛋白质数据库)ID：1IAR中，对两种蛋白质的结合重要的残基是hIL-4的Glu33和Arg112，并且hIL-4Rα的Tyr38、Ser95、Asp97和Tyr208具有静电相互作用(LaPorte等人,2008)。

另外，预期Leu67、Leu68、Asp92和Val93也参与了与hIL-4的结合，并且这些残基被其他抗hIL-4Rα抗体(Medimmune Limited)识别为Leu67、Leu68、Asp92和Val93的表位(韩国专利号1620539)。图15A是显示了在hIL-4与hIL-4Rα的结合结构中的结合发挥重要作用的残基以及抗体的表位区的详细视图。

为了进行表位定位，引入单个突变以将上述八个残基(Tyr38、Ser95、Asp97、Tyr208、Leu67、Leu68、Asp92、Val93)中的每一个转化为Ala，以与<实施例1>中相同的方式纯化八种hIL-4Rα蛋白，并且使用12％SDS-PAGE检测纯度(图15B)。

将蛋白质在室温下以50ng/孔在96孔板中固定1小时，并在室温下用含有4％BSA(牛血清白蛋白)的0.1％PBST封闭1小时。将溶液丢弃，将残余物用0.1％PBST洗涤三次，将5nM hIL-4-mFc和100pM或2.5nM抗hIL-4Rα抗体(4R34 4R34.1、4R34.1.9、度匹鲁单抗类似物)以25μl/孔添加至封闭板中，并使反应在室温下进行1小时。将溶液丢弃，将残余物用0.1％PBST洗涤3次，然后将25μl的抗人IgG-HRP抗体(1:8000)作为二抗添加至每个孔中，并使其在室温下反应1小时。将溶液丢弃，将残余物用PBST洗涤3次，并将25μl的TMB溶液添加至每个孔中，接着在室温下显色1分钟。用H

作为结果，如可从图15C看出，度匹鲁单抗类似物展现出与引入了具有Ala而不是Val93或Asp97的单个突变的蛋白质的低结合能力。4R34、4R34.1和4R34.1.19抗体将hIL-4Rα的Leu67、Leu68、Asp92、Val93和Asp97识别为表位。4R34.1.19将hIL-4Rα的Asp92和Val93残基识别为表位，但不能将其识别为比亲和成熟前得到的抗体更重要的表位。其原因被认为是其他相邻残基也有助于与抗体结合，并且仍然保持结合能力。度匹鲁单抗类似物被认为具有这些残基作为表位，因为与野生型IL-4Rα相比，当Val93和Asp97突变为Ala时与hIL-4Rα的结合能力减小。总之，证实所选择的抗体具有与其他抗体(包括度匹鲁单抗类似物)的表位不同的表位。

另外，hIL-4Rα的Tyr38、Ser95、Asp97和Tyr208与hIL-13的Glu45和Arg98具有静电相互作用(LaPorte等人,2008)。因此，4R34、4R34.1和4R34.1.9被认为与hIL-13竞争结合位点并抑制hIL-13的信号传导。

实施例14：4R34.1.19抗体抑制PHA激活的PBMC的细胞增殖的能力的评价人PBMC不表达大量hIL-4Rα，但已经报道，在B细胞和T细胞中当使用称为“PHA(植物血凝素P，Sigma-Aldrich)”的有丝分裂原激活时表达IL-4Rα。因此，使用用PHA激活的PBMC确定4R34.1.19候选抗体是否实际上抑制了人类中表达hIL-4Rα的细胞的增殖。

特别地，为了从人外周血分离免疫细胞(PBMC)，将5ml的Ficoll(GE Healthcare)装入15ml试管中。将收集的血液与PBS(pH 7.4)以1:1混合并振荡，然后将10ml的混合物添加至含有Ficoll的试管中，同时防止与Ficoll混合，并在不间断的状态下以750g离心20分钟。然后，回收在Ficoll上形成的血沉棕黄层，并用PBS(pH 7.4)洗涤两次，以得到含有T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞的PBMC。分离的正常PBMC不表达足够大量的IL-4Rα以观察IL-4Rα的结合。因此，将PBMC用称为“PHA”(Sigma-Aldrich)的有丝分裂原处理72小时，以刺激T细胞和B细胞被激活。已经报道，用PHA处理引起免疫细胞分裂，并在T细胞和B细胞中表达IL-4Rα受体。将1x10

分析的结果表明，与作为模板的4R34.1抗体相比，4R34.1.19抗体展现出抑制PHA激活的PBMC增殖的显著改善的作用，并且抑制PHA激活的PBMC增殖的程度与对照度匹鲁单抗类似物的抑制程度类似(图16)。

实施例15：4R34.1.9抗体抑制Th2细胞分化的能力的评价

使用IL-4ELISpot测定确定4R34.1.9抗体是否抑制Th2细胞通过IL-4的分化。

特别地，添加与识别以<实施例14>中相同的方式分离的人PBMC中CD4的PE-cy5缀合的抗体(Thermo Fisher Scientific)以及与识别CD45RO(记忆细胞的细胞表面标记物)的FITC缀合的抗体(Thermo Fisher Scientific)，并使其在4℃下反应30分钟。将所得物用PBS洗涤，并通过FACS Aria III(BD biosciences，韩国)分离幼稚CD4

分析的结果表明，与模板4R34.1抗体相比，4R34.1.19抗体具有对来自正常和哮喘患者的幼稚T细胞分化为Th2细胞的显著改善的抑制作用，以及与对照度匹鲁单抗类似物的抑制分化作用类似的抑制分化作用。这可以从定量值和代表性图像(图17A和图17B)看出。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，本说明书是为了阐述用于说明性目的的优选实施方案而提供，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

【工业实用性】

本发明的抗hIL-4Rα抗体或其抗原结合片段中和hIL-4活性，从而具有抑制患者来源的T细胞的生长和抑制其分化为Th2细胞的作用，因此用于治疗或预防炎性疾病，更特别地过敏性疾病(如皮炎、哮喘、过敏性鼻炎或食物过敏反应)以及包括但不限于以下的疾病：关节炎(包括化脓性关节炎)、疱疹、慢性特发性荨麻疹、硬皮病、肥厚性瘢痕、惠普耳氏病、良性前列腺增生、肺障碍(如轻度、中度或重度哮喘)、炎性障碍(如炎性肠病)、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯病、先兆子痫、舍格伦综合征、自身免疫性淋巴细胞增殖综合征、自身免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自身免疫性葡萄膜炎、结核病和肾病。

【序列表自由文本】

附有电子文件。

<110> 亚洲大学校产学协力团

<120> 对人IL-4受体α具有高亲和力的人抗体及其用途

<130> PP-B2289

<150> KR18/137199

<151> 2018-11-09

<160> 98

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Arg Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Gln Arg Ser Ala Thr Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Pro Leu Ser Ala Ala Trp Ser His Ser Ser Tyr Tyr Asn

100 105 110

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Ser His Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro His Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser His Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser His Gly Asn Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Thr Gly Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

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Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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65 70 75 80

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115

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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<211> 116

<212> PRT

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<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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115

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<211> 116

<212> PRT

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<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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85 90 95

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Gly

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1 5 10 15

Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Gly

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Ala Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly

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<220>

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Val His Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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35 40 45

Ser Ala Ile Thr Ala Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly

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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

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Gly Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

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65 70 75 80

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<220>

<223> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 98

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1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

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Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

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210 215 220

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225 230