一株纺锤链霉菌LS159及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及微生物菌种及其在植物病害生物防治领域和食品防腐保鲜领域的应用，更具体涉及一株纺锤链霉菌及其应用。

背景技术

微生物在自然界中普遍而广泛存在，它们其中的大部分是对人类无害或者是有益的，既可以应用活菌细胞进行食品发酵、疫苗开发，又可以利用其生理代谢作用进行有机酸、酶制剂、抗生素代谢产物的生产等，并且在自然界物质循环及资源化利用中发挥重要作用。但也有一小部分的微生物可以引起植物病害，造成食品腐败变质，给人类造成危害和损失。对于引起植物病害和食品腐败变质的有害微生物，一直以来以化学农药和化学防腐剂的应用主要措施。随着人们生活水平的提高，对食品安全和生态环境保护意识逐步提升，对绿色、低毒害的防治措施的应用需求不断增加。

放线菌作为一类革兰氏阳性原核微生物，在土壤、水体、植物表面及内部等环境广泛存在，并且很多种类可以产生抗菌性能，是植物病害防治及食品防腐保鲜中较常使用的种类。研究表明，某些放线菌通过产生抗生素、几丁质酶抑制有害微生物生长，或者通过生态位、营养竞争限制和阻止病原菌生长，从而减轻病害侵染和危害。放线菌中研究和应用最多的是链霉菌（

微生物菌剂的发酵需要添加适合和碳、氮源等营养物质，为了降低成本在选择培养基质时往往考虑使用一些工农业生产后的废弃物，这些废弃物中含有一定量的碳源、氮源等物质，经过适当调整可用于菌剂发酵的优良培养基来源。其中啤酒生产过程经历糖化、发酵、灌装等工序产生大量废水，这些啤酒废水中含有糖类、蛋白质等丰富有机物。我国是啤酒生产和消费大国，每生产 1吨啤酒会产生 3-10吨的废水，啤酒废水排放量大，啤酒厂每年因处理啤酒废水需要花费大量资金，消耗大量能源。从另一个角度考虑，啤酒废水中的有机质（包括：糖类、蛋白质等）是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。

发明内容

基于此，本发明专利在筛选具有抑制植物病原微生物和食品腐败微生物的纺锤链霉菌的同时，对其进行生理特性和分子鉴定，并利用啤酒废水对纺锤链霉菌发酵培养，这将对于减少化学药剂的使入、降低环境污染、提高食品安全，以及实现农业可持续发展具有重要意义。本发明人最终筛选和鉴定获得一株纺锤链霉菌（

本发明首先提供一种株纺锤链霉菌（

研究结果表明，LS159菌株对板栗疫病病原菌（

进一步研究表明， LS159菌株对8种常见引起食品腐败的真菌和细菌均有拮抗作用，其中对扩展青霉（

本发明进一步研究表明，所述LS159菌株能够较好地利用啤酒废水为主要成分的培养基，与ISP2培养基相比，在培养初期的1-3d，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌生长速度慢于ISP2培养基发酵的处理，但在发酵中后期二者生长量逐渐接近一致。因此，本发明还提供一种利用啤酒废水发酵所述LS159菌株的方法。具体地，其以啤酒废水为基本成分的发酵培养液对所述LS159菌株进行发酵。更具体地，所述发酵培养液是将啤酒废水与自来水按体积比为1：3-8混合，然后添加葡萄糖、酵母浸粉，调节pH至7.0-7.4，灭菌冷却即可。所述发酵条件为30-34 ℃、100-200 rpm培养3-7d。优选地，所述发酵培养液是将啤酒废水与自来水按体积比为1：5混合，然后添加0.5%的葡萄糖、0.5%的酵母浸粉，调节pH7.2，灭菌冷却即可；培养条件为32 ℃、150 rpm培养5d。

而且研究表明，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌LS159 菌液的抑菌功能与在ISP2培养基上培养的菌液效果一致，说明可以利用啤酒废水发酵拮抗菌纺锤链霉菌。因而本发明还提供上述发酵方法获得的菌液。并更进一步地，本发明提供所述菌液在作为生防菌的应用或在防治食品腐败中的应用。

本发明筛选获得的LS159菌株具广谱的抗菌性，既可用于生防菌，也可用于防止食品腐败，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1拮抗放线菌不同菌株对茄腐皮镰刀菌FD1的抑菌作用。

图2 LS159菌株16S rDNA系统发育树。

图3利用啤酒废水发酵纺锤链霉菌LS159效果。

生物材料保藏信息： 本发明的LS159菌株命名为纺锤链霉菌（

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行阐述，以期列好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1 具有拮抗功能的链霉菌的分离筛选

（1）土壤样品来源

土壤取自山西长治市襄垣县油用牡丹种植基地，选取生长健康的5年生油用牡丹植株，将植株连根拔起，轻轻抖落后用无菌毛刷刷取粘在根部的土壤（即根际土），每5棵植株的样品混为一个土样，将土壤装入无菌塑封袋，带回实验室于4℃冰箱中保存。

（2）链霉菌菌株的分离

取10 g 根际土壤样品放于90 mL的无菌蒸馏水中，均匀振荡30 min后，土壤悬液分别稀释至10

（3）菌株拮抗功能筛选

采用平板对峙培养法，对上述分离菌株进行拮抗效果的筛选。病原菌采用实验室保存的对油用牡丹有强致病性的茄腐皮镰刀菌（

结果表明，在山西省长治地区油用牡丹田间采集的油用牡丹根际土壤中共分离到650株纯种微生物，根据菌落形态判断，放线菌共有42株。其中对茄腐皮镰刀菌FD1有拮抗作用的放线菌20株，抑菌率大于50%的菌株有5株，分别为LS2、LS62、LS159、LS164和LS286，其中抑菌率最高的菌株为LS159和LS164，具体见图1。

实施例2 链霉菌LS159的理化特征及16S rRNA 分子鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对拮抗茄腐皮镰刀菌效果最好的菌株LS159进行形态学观察和生理生化鉴定，同时将该菌株进行16S rRNA基因扩增和测序分析。

菌株LS59理化特征结果如下：在ISP2固体培养基上（酵母浸粉 4 g，麦芽浸粉 10g，葡萄糖 4 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.4-7.6）该菌株基内菌丝浅黄色，气生菌丝浅褐色，不透明，孢子长柱状，表面光滑。培养48h后出现皱褶，培养3-7天产生孢子，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，产生过氧化化氢酶，V.P.测定为阳性（见表1）。

表1 LS159菌株形态特征及生理生化测定结果

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。

16S rRNA基因测序后在NCBI上进行 BLAST 比对分析，结果表明该菌与纺锤链霉菌

实施例3纺锤链霉菌LS159对多种植物病原微生物的拮抗作用

选择发病较普遍的植物真菌病害和细菌病害的病原微生物各4种为实验材料，采用平板对峙法对纺锤链霉菌LS159的拮抗功能谱进行测定，同时以分离获得的另外4株对茄腐皮镰刀菌FD1抑菌率高的链霉菌作对比。4种病原真菌为辣椒疫霉病病原菌（

取链霉菌单菌落接种在ISP2液体培养基中，30 ℃、150 rpm培养3-5 d，培养好的菌液用于平板对峙实验。对于病原真菌拮抗作用，进行平板对峙实验时在改良PDA培养基（即PDA培养基与ISP2培养基1:1比例混合：PDA培养基为200 g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1 L，加入20 g葡萄糖，加16 g琼脂粉；ISP2培养基为酵母浸粉 4 g，麦芽浸粉 10 g，葡萄糖 4 g，水1 L）平板中心接种已活化的0.5 cm×0.5 cm的病原菌菌块，在距离病原菌2.5 cm的两侧对称打孔，每孔加入100 μL的链霉菌菌液，每个处理重复3次，在28 ℃培养箱中培养5-7 d，用游标卡尺测定测量对病原菌的拮抗半径。对于病原细菌拮抗作用，进行平板对峙实验时，取培养好的4种病原细菌各200 μL分别涂布在LB改良培养基（即LB培养基与ISP2培养基1:1比例混合：LB培养基为NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，蛋白胨 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5；ISP2培养基为酵母浸粉4 g，麦芽浸粉 10 g，葡萄糖 4 g，水1 L）平板上，在平板中间打3个直径为0.7 cm孔，孔中加入100 μL链霉菌菌液，在30 ℃培养24-36 h，用游标卡尺测定抑菌直径。

结果表明，LS159对板栗疫病病原菌（

表2不同链霉菌对8种植物病原微生物的抑菌作用

注：病原真菌1.辣椒疫霉病病原菌（

实施例4纺锤链霉菌LS159对多种食品腐败微生物的拮抗作用

选择引起食品腐败的常见真菌和细菌各4种为实验材料，采用平板对峙法对纺锤链霉菌LS159的抗菌功能谱进行测定，同时以另一株纺锤链霉菌LS286作对比。4种真菌为黑曲霉（

取链霉菌单菌落接种在ISP2液体培养基中，30 ℃、150 rpm培养3-5 d，培养好的菌液用于平板对峙实验。对于食品腐败真菌拮抗作用，进行平板对峙实验时在改良PDA培养基（即PDA培养基与ISP2培养基1:1比例混合：PDA培养基为200 g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1 L，加入20 g葡萄糖，加16 g琼脂粉；ISP2培养基为酵母浸粉 4 g，麦芽浸粉 10 g，葡萄糖 4 g，水1 L）平板中心接种已活化的0.5 cm×0.5 cm的真菌菌块，在距离腐败真菌2.5 cm的两侧对称打孔，每孔加入100 μL的链霉菌菌液，每个处理重复3次，在28 ℃培养箱中培养5-7 d，用游标卡尺测定测量腐败真菌直径和拮抗半径。对于食品腐败细菌的拮抗作用，进行平板对峙实验时，取培养好的4种食品腐败细菌各200 μL分别涂布在LB改良培养基（即LB培养基与ISP2培养基1:1比例混合：LB培养基为NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，蛋白胨 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0-7.5；ISP2培养基为酵母浸粉 4 g，麦芽浸粉 10 g，葡萄糖 4 g，水1 L）平板上，在平板中间打3个直径为0.7 cm孔，孔中加入100 μL链霉菌菌液，在30 ℃培养24-36 h，测定抑菌直径。

结果表明，纺锤链霉菌LS159对8种引起食品腐败的真菌和细菌均有拮抗作用，其中对扩展青霉（

表3 纺锤链霉菌LS159对8种食品腐败微生物的抑菌作用

注：食品腐败真菌1.黑曲霉（

实施例5利用啤酒废水发酵纺锤链霉菌LS159

取纺锤链霉菌LS159单菌落接种在ISP2液体培养基中，30 ℃、150 rpm培养3-5 d，培养好的菌液待用。在啤酒废水中加入一定量的自来水（啤酒废水与自来水按体积比为1：5），然后添加0.5%的葡萄糖、0.5%的酵母浸粉，调节pH至7.0-7.4，分装到250ml三角瓶中，每瓶50ml，灭菌冷却后按2%的接种量进行接种，32 ℃、150 rpm培养1 d、2d、3d、5d、7d用酶标仪测OD600值。以ISP2培养基接种LS159，在同样条件下接种和培养的处理为对照。

结果表明，纺锤链霉菌LS159能够较好地利用啤酒废水为主要成分的培养基，与ISP2培养基相比，在培养初期的1-3d，利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌生长速度慢于ISP2培养基发酵的处理，但在发酵中后期二者生长量逐渐接近一致。具体结果见图3。

实施例6利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌LS159抑菌作用

为了确认利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌LS159 菌液的抑菌功能是否受影响，按实施例5的方法获得在啤酒废水中培养5d的纺锤链霉菌LS159发酵液，将其进行抑菌效果研究。抑菌实验所用有害微生物的包括1种植物病原真菌板栗疫病病原菌（

结果表明（见表4），利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌LS159 菌液的抑菌功能与在ISP2培养基上培养的菌液效果一致，说明可以利用啤酒废水发酵拮抗菌纺锤链霉菌。

表4利用啤酒废水发酵的纺锤链霉菌LS159菌液抑菌作用

注：1. 板栗疫病病原菌（