一种适用于微量眼内液样本cfDNA测序的核酸抽提方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，涉及一种适用于微量眼内液样本cfDNA测序的核酸抽提方法。

背景技术

伪装综合征(masquerade syndrome)是指一系列具有眼内类炎症临床表现，但并非由葡萄膜免疫反应所导致的疾病。因伪装综合征的类炎症性眼内表现可广泛模拟葡萄膜炎(如玻璃体细胞、前房细胞等)，其诊断一直是眼科学领域的难点之一。在伪装综合征中，又以肿瘤性伪装综合征在临床诊疗中更具重要性，因其早期准确诊断与及时治疗、改善预后密切相关。

以玻璃体视网膜淋巴瘤(vitreoretinal lymphoma，VRL)为例，VRL是伪装综合征的主要组成病种，是一种罕见的眼部恶性肿瘤，其中大多数是侵袭性B细胞淋巴瘤，通常为弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。VRL的诊断长期以来一直具有挑战性，一方面，VRL的临床表现极易与葡萄膜炎混淆；另一方面，VRL的诊断金标准为细胞病理学检查中发现恶性淋巴细胞，但其阳性率较低，仅47.5％-80％，其原因可包括①糖皮质激素误用、②玻璃体切割术损伤完整细胞结构、③淋巴瘤细胞极易坏死、④可获得的眼内液量有限(常不超过1ml)，从而导致细胞病理学检查中无法观察到足够的完整细胞以供确诊。

近年来，各种新一代基因检测技术可从细胞遗传层面揭示肿瘤的发生与发展，从而实现肿瘤的分子诊断。游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)测序技术，是通过检测各类由细胞所释放而游离于体液(如血液、尿液等)中的DNA片段，从而对免疫、凝血、衰老、癌变等各种生理病理现象进行分析的技术。其中，尤以肿瘤来源的cfDNA更受重视，被认为是一种新型的肿瘤分子标志物，文献(Soliman SE,Alhanafy AM,Habib M,Hagag M,IbrahemR.Serum CirculatingCell Free DNA as Potential Diagnostic and PrognosticBiomarker in NonSmall Cell Lung Cancer.Biochem Biophys Rep(2018)15:45–51.2018.06.002),(Osumi H,Shinozaki E,Yamaguchi K,Zembutsu H.Clinical Utilityof Circulating Tumor DNA for Colorectal Cancer.Cancer Sci(2019)110(4):1148–55.13972)报道了通过血液样本对不同种类实体肿瘤进行无创性早期诊断。相较于其他新一代基因测序技术(如全外显子测序、单细胞测序等)，cfDNA测序技术对临床样本的处理流程简单，且不会额外消耗本应进行病理检查的样本，因此不会影响临床常规的病理学检查；同时，cfDNA测序所需样本更易于收集与储存，且可耐受样本稀释，因此具有从眼内液标本实现疑难疾病精确诊断的潜力。

然而在目前cfDNA的提取与检测中，由于cfDNA的浓度极低，因此目前主要应用在各类大体积体液中进行(如血液、尿液、腹腔积液、胸腔积液、肺泡灌洗液等)，从而获取足够检测的DNA样本量，但眼内液样本往往体积较小，单次可获得的房水量约为100μl，单次可采集的玻璃体液量约为500-1000μl，且经常被眼内灌注液所稀释；此外，常见的肿瘤cfDNA长度通常在150-180bp(碱基对)范围内，常用的cfDNA捕获试剂盒往往针对这一类短链DNA进行捕获，但眼内液样本中常常还含有细胞坏死、玻璃体切割术所致机械性破裂所释放的长链DNA或基因组DNA，则会对短链cfDNA的捕获与测序文库建立(以下简称建库)产生较大影响，测序成功率较低，远无法达到临床应用的要求。

综上所述，cfDNA测序技术具有通过眼内液诊断疑难眼底病的潜力，但现有的cfDNA抽提、检测技术尚无法有效解决眼内液①样本量少、②长链DNA与基因组DNA较多的难题，因此，急需一种适用于微量眼内液样本cfDNA测序的核酸抽提方法。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术中的不足，提供一种适用于微量眼内液样本cfDNA测序的核酸抽提方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种适用于微量眼内液样本cfDNA测序的核酸抽提方法，包括以下步骤：

(a)从眼内液提取cfDNA；

(b)对提取所得样本中的核酸进行质控；

(c)对质控不通过的样本进行DNA片段化处理；

(d)建立测序文库。

更优选的，所述步骤(c)中的片段化处理为步骤(b)中cfDNA含量不足10ng的样品，处理方法如下：

(c1)若总DNA<10ng，则认为样本所含总DNA不足，质控不通过。

(c2)若总DNA≥10ng、但cfDNA量<10ng，且有长链DNA或基因组DNA污染时，则需要进行DNA片段化处理。

更优选的，所述处理方法(c2)中DNA片段化处理采用的试剂盒为KAPAHyperPlusKit。

更优选的，所述的DNA片段化处理包括以下步骤：

(1)PCR管中配制反应体系；

(2)振荡混匀后，按预冷4℃5min、裂解37℃25-45min，维持4℃的程序进行片段化程序；

(3)纯化cfDNA。

更优选的，所述上述步骤(2)中的裂解时间为25min。

更优选的，所述上述步骤(3)中纯化cfDNA的方法为磁珠法。

更优选的，所述步骤(a)中从眼内液提取cfDNA包括如下步骤：

(a1)将样本在4℃下16000g离心10分钟，留取上清；

(a2)提取cfDNA。

更优选的，所述步骤(b)中的质控为测量其总DNA含量、150-180bp长度范围内的cfDNA含量，然后进行如下判断：

(b1)150-180bp范围内的cfDNA含量≥10ng，则直接进行建库。

(b2)150-180bp范围内的cfDNA含量<10ng，则还需进行优化。

更优选的，所述步骤(d)建立测序文库采用的试剂盒为QIAseq Ultralow inputLibrary Kit。

作为优选例，所述的样品包括稀释或未稀释的玻璃体、房水。

本发明的优点在于：

1、本发明中cfDNA测序方法是首次将KAPA HyperPlus Kit试剂盒应用于cfDNA样本。

2、其他常规测序的DNA裂解步骤后，直接进行后续建库，而本发明中因DNA样本来源为片段更小的cfDNA，因此裂解步骤完成后，新增了磁珠法纯化cfDNA的步骤，从而避免DNA裂解酶的过度裂解所导致的DNA样本损失。

3、本发明进行的改良方法可应用于微量眼内液标本从而获取足够DNA进行cfDNA测序检测，并使之可不受长链DNA与基因组DNA的影响。

附图说明

附图1为本方法的的技术流程图。

附图2为17,20,21,23,26样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图3为27,28,29,30,31,32样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图4为33,35,36,38,39,40样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图5为41,42,43,44,45样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图6为46,47,48,49,50样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图7为51,52,53,54,55样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图8为56,57,58,59,60样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

附图9为61,62样本的质控曲线、总DNA含量与初步质控结果。

具体实施方式

作为一例优选例，下述实施例按照附图1中技术流程图中的步骤进行，其中(c2)为本发明的创新之处。下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1材料与方法

1.1仪器与试剂

移液枪，(Eppendorf，德国)；EP管，(Axygen，美国)；超净台，(苏州净化设备工程有限公司，中国)；恒温金属浴加热块，(上海培清科技有限公司，中国)；低温高速离心机Centrifuge 5804R，(Eppendorf，德国)；涡旋混合器Vortex-Genie 2，(ScientificIndustries，美国)；电动吸引器7A-23D，(鱼跃，中国)；QIAamp Circulating Nucleic AcidKit，(Qiagen，荷兰)；Agilent 4200TapeStation，(Agilent Technologies，美国)；QIAseqUltralow input Library Kit，(Qiagen，荷兰)；KAPA HyperPlus Kit，(RocheSequencing，美国)；AMPure XP Beads，(Beckman Coulter，美国)；Agencourt SPRIPlateSuper Magnet Plate，(Beckman Coulter，美国)。

1.2实验方法

1.2.1从眼内液提取cfDNA

1.将样本在4℃下16000g离心10分钟，留取上清。

2.使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen,Venlo,TheNetherlands)提取cfDNA(按1ml眼内液计)。

(1)按如下表格配制提取体系：

(2)振荡30秒混匀反应体系，于60摄氏度孵育30min。

(3)加入Buffer ACB 3.6mL，振荡15-30s。

(4)将混合体系于冰上孵育5min。

(5)将QIAamp Mini column与负压吸引系统连接，将上述混合体系加入QIAampMini column，打开负压泵，至所有液体被吸尽后关闭负压泵。

(6)将600μl的Buffer ACW1加入QIAamp Mini column。打开负压泵，将液体吸尽后关闭负压泵。

(7)将750μl的Buffer ACW2加入QIAamp Mini column。打开负压泵，将液体吸尽后关闭负压泵。

(8)将750μl的无水乙醇加入QIAamp Mini column。打开负压泵，将液体吸尽后关闭负压泵。将QIAamp Mini column自负压吸引系统取下。

(9)关闭QIAamp Mini column的盖子，将其放入2mL的收集管，20000g下离心3min。

(10)将QIAamp Mini column取下放入另一个新的2mL的收集管，打开盖子，于56℃孵育10min至吸附膜完全干燥。

(11)取下QIAamp Mini column放入另一个1.5mL洗脱管，加入20-150μl的BufferAVE至QIAamp Mini column的吸附膜上，关闭盖子室温孵育3min。

(12)20000g下离心1min洗脱所吸附的核酸。

1.2.2对抽提核酸样本进行质控

使用Agilent 4200 TapeStation(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)系统对提取的核酸样本进行质控，测量其总DNA含量、150-180bp范围内的cfDNA含量。如cfDNA含量超过10ng，则直接进行后续常规建库操作，此方法中以QIAseq Ultralow inputLibrary Kit为例。如质控测得cfDNA含量不足，则进行下述优化工作流程。

1.2.3对质控不通过样本进行DNA片段化处理

1.若总DNA<10ng，则认为样本所含总DNA不足，质控不通过。

2.若总DNA≥10ng、但cfDNA量<10ng，且有长链DNA或基因组DNA污染时，则使用KAPA HyperPlus Kit(Roche Sequencing,Pleasanton，CA，USA)按以下步骤进行DNA片段化处理。

(1)于PCR管中按如下表格配制反应体系：

(2)振荡混匀后，按预冷4℃5min、裂解37℃25min，维持4℃的程序进行片段化程序。

(3)反应完成后，加入90μl AMPure XP Beads(Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA)，混匀后室温孵育5min。

(4)将含有反应体系的PCR管放于Agencourt SPRIPlate Super Magnet Plate(Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA)磁力板2min。

(5)吸除PCR管内上清，留存剩余的5μl上清。

(6)加入200μl 70％乙醇，室温孵育30s后吸除乙醇，重复2次。

(7)自Agencourt SPRIPlate Super Magnet Plate磁力板中取出PCR管，加入洗脱缓冲液冲洗混合10次，孵育2min。

(8)再次将PCR管放于Agencourt SPRIPlate Super Magnet Plate磁力板，孵育1min。

(9)将上清转移至新的PCR管，即为纯化的cfDNA样本。

1.2.4.建立测序文库

以QIAseq Ultralow input LibraryKit试剂盒建立测序文库。

1.末端补平(end-polishing)

(1)于PCR管中配置末端补平反应体系

(2)温和混匀后，按25℃30min、65℃15min、4℃维持的程序进行末端补平反应。

2.对DNA片段添加接头(adapter)

(1)于PCR管或预制孔板中配置反应体系

(2)混匀后按25℃10min、4℃维持的程序进行接头连接，完成后尽快进入下一步。

(3)向反应体系加入80μl AMPure XP Beads。

(4)混匀后室温孵育5min，将含有反应体系的PCR管放于Agencourt SPRIPlateSuper Magnet Plate磁力板5min。

(5)吸除PCR管内上清，留存剩余的5μl上清。

(6)加入200μl 70％乙醇，室温孵育30s后吸除乙醇，重复2次。

(7)在磁力板上孵育5-10min，将PCR管自磁力板上取下。

(8)加入洗脱缓冲液52.5μl并混合，孵育2min后，再次将PCR管放于AgencourtSPRIPlate Super Magnet Plate磁力板，孵育1min。

(9)将其中的50μl上清转移至新的PCR管，再加入50μl AMPure XP Beads。

(10)重复(4)至(7)步后，加入26μl洗脱缓冲液并混合，孵育2min后，再次将PCR管放于Agencourt SPRIPlate Super Magnet Plate磁力板，孵育1min。

(11)将其中的23.5μl上清转移至新的PCR管，即为文库DNA。

3.文库扩增

(1)按下表配置文库扩增体系，混匀

(2)按如下程序进行文库扩增

(3)向反应体系加入50μl AMPure XP Beads，重复上述2.(4)至2.(7)步骤。

(4)加入25μl洗脱缓冲液并混合，孵育2min后，再次将PCR管放于AgencourtSPRIPlate Super Magnet Plate磁力板孵育1min。

(5)将上清转移至新PCR管，即为扩增完成的文库，可供后续的文库质检、捕获、测序，或储存于-20℃。

2结果

2.1常规cfDNA抽提方法与改良cfDNA抽提方法对眼内液标本cfDNA测序成功率的影响

选取眼内液标本使用常规方法进行cfDNA抽提并进行质控与后续的建库、目标基因捕获、测序，记录其成功完成测序例数；对于常规cfDNA抽提后的质控失败样本，进行改良cfDNA抽提后尝试后续建库、目标基因捕获、测序，记录成功完成测序的例数。对比常规cfDNA抽提流程的测序成功率与改良cfDNA抽提流程的测序成功率的差异。结果表明，常规方法抽提cfDNA的62份眼内液样本中成功完成测序23例，成功率37.1％。测序失败样本中，30例为长链DNA或基因组DNA污染致建库风险无法进一步测序、9例为DNA总量低于10ng无法进行后续建库。将常规方法失败、且还有剩余样本共35例采用改良方法抽提cfDNA，最终成功完成测序29例，成功率82.9％。使用卡方检验对比两种方法总成功率，P<0.001，表明改良cfDNA方法具有更高的测序成功率，见表1。

表1：常规抽提法与改良抽提法行cfDNA测序成功例数对比

常规方法抽提后测序失败共39例，其中9例为DNA总量不足无法完成后续测序、30例为长链DNA或基因组DNA污染所致建库风险而未完成后续测序。Low：DNA总量不足；Risk：长链DNA、基因组DNA污染，风险较大不建议建库。详见附图1-8。

需要说明的是：①KAPA HyperPlus Kit试剂盒设计之初并无针对cfDNA测序的功能，本方法中首创将其中的DNA裂解试剂应用于cfDNA样本；②在进行DNA片段化处理中，振荡混匀后的条件为，预冷4℃5min、37℃裂解25分钟，25分钟的裂解时间是在我们前期工作中摸索获得的在眼部cfDNA样本中的最佳时间，而根据试剂盒操作手册，对常规人gDNA样本需要裂解45分钟才能达到cfDNA的长度水平。一般而言，裂解时间越长，片段越小。但裂解时间过长又会导致DNA过度降解以致DNA总量不足以进行后续测序，因此选取合适的裂解时间，在眼科微量标本中尤为重要；③其他常规测序的DNA裂解步骤后，直接进行后续建库，而本方法因DNA样本来源为片段更小的cfDNA，因此裂解步骤完成后，新增磁珠法纯化cfDNA的步骤(即实施例1中对质控不通过样本进行DNA片段化处理的步骤(3)至步骤(9))，从而避免DNA裂解酶的过度裂解所导致的DNA样本损失，此为本方法的另一个创新性改良步骤。

综上，本发明改良了现有的cfDNA抽提技术，并能应用于微量眼内液标本从而获取足够DNA进行测序检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。